Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

Resumen

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Resumen

El músculo esquelético tiene una notable capacidad para regenerarse después de una lesión, que es impulsada por células madre musculares residentes en el tejido obligado. Después de la lesión, la célula madre muscular se activa y sufre proliferación celular para generar un grupo de mioblastos, que posteriormente se diferencian para formar nuevas fibras musculares. En muchas condiciones de desgaste muscular, incluida la distrofia muscular y el envejecimiento, este proceso se ve afectado, lo que resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. El proceso de regeneración muscular en el pez cebra está altamente conservado con sistemas de mamíferos que proporcionan un excelente sistema para estudiar la función y regeneración de las células madre musculares, en condiciones de desgaste muscular como la distrofia muscular. Aquí, presentamos un método para examinar la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular. El primer paso consiste en el uso de una plataforma de genotipado que permite la determinación del genotipo de las larvas antes de provocar una lesión. Una vez determinado el genotipo, el músculo se lesiona mediante una puñalada con aguja, tras la cual se utiliza la microscopía de luz polarizante para determinar el grado de regeneración muscular. Por lo tanto, proporcionamos una tubería de alto rendimiento que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Introducción

El músculo esquelético representa el 30-50% de la masa corporal humana, y no solo es indispensable para la locomoción, sino que también sirve como un órgano metabólico y de almacenamiento crítico¹. A pesar de ser postmitótico, el músculo esquelético es altamente dinámico y conserva una tremenda capacidad regenerativa después de una lesión. Esto se atribuye a la presencia de células madre residentes en tejidos (también llamadas células satélite), localizadas bajo la lámina basal de miofiberes y marcadas por los factores de transcripción pareados de proteína de caja 7 (pax7)y/o proteína de caja pareada 3 (pax3),entre otros^2,3. Después de la lesión, la célula satélite se activa y sufre proliferación celular para generar un grupo de mioblastos, que posteriormente se diferencian para formar nuevas fibras musculares. La cascada altamente conservada de señales pro-regenerativas que regulan la activación de las células satélite y la reparación muscular robusta se ve afectada en diversas condiciones, como las miopatías y el envejecimiento homeostático^4,5.

Uno de estos grupos diversos de miopatías es la distrofia muscular, caracterizada por desgaste muscular progresivo y degeneración⁶. Estas enfermedades son consecuencia de mutaciones genéticas en proteínas clave, entre ellas la distrofina y la laminina-α2 (LAMA2), responsables de la unión de las fibras musculares a la matriz extracelular^7,8. Dado que las proteínas implicadas en la distrofia muscular juegan un papel tan central en el mantenimiento de la estructura muscular, durante muchos años se creyó que un fallo en este proceso era el mecanismo responsable de la patogénesis de la enfermedad⁹. Sin embargo, estudios recientes han identificado defectos en la regulación de las células madre musculares y el posterior deterioro en la regeneración muscular como segunda posible base para la patología muscular observada en la distrofia muscular^10,11. Como tal, se necesitan más estudios para investigar cómo un deterioro en la función de las células madre musculares y los elementos de nicho asociados contribuyen a la distrofia muscular.

Durante la última década, el pez cebra(Danio rerio)se ha convertido en un importante modelo de vertebrados para el modelado de enfermedades¹². Esto se atribuye al rápido desarrollo externo del embrión de pez cebra, junto con su claridad óptica, que permite la visualización directa de la formación muscular, el crecimiento y la función. Además, no solo el desarrollo y la estructura del músculo están altamente conservados en el pez cebra, sino que también muestran un proceso altamente conservado de regeneración muscular¹³. En consecuencia, el pez cebra representa un excelente sistema para estudiar la patobiología de las enfermedades musculares y explorar cómo se ve afectada la regeneración muscular en ella. Con este fin, hemos desarrollado un método que permite el estudio oportuno de la regeneración del músculo esquelético en modelos de pez cebra de enfermedad muscular. Esta tubería de alto rendimiento implica un método para genotipar embriones vivos^14,después del cual se realiza una lesión por apuñalamiento con aguja y se toma una imagen del grado de regeneración muscular mediante microscopía de luz polarizante. Por lo tanto, la utilización de esta técnica revelará la capacidad regenerativa del músculo en modelos de enfermedad muscular de pez cebra.

Protocolo

El mantenimiento del pez cebra se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos operativos estándar aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Monash bajo la licencia de colonia de cría ERM14481.

1. Determinación del genotipo de embriones vivos mediante una plataforma de genotipado embrionario.

1. Anestesiar 3 días después de la fertilización (dpf) embriones de pez cebra mediante la adición de metanosulfonato de tricaína a una concentración final de 0.016% (v / v) en medio embrionario (5 mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄ en agua). Espere 10 minutos para asegurarse de que los peces estén completamente anestesiados, evidente cuando los peces dejan de nadar.
2. Prepare el chip de extracción de ADN de 24 cámaras pelando la película protectora transparente de la superficie superior del chip (Figura 1A).
3. Corte la punta de una punta de filtro de 20 μL para ensanar la abertura. Usando esto, elija un solo embrión en un volumen de 13 μL de medio embrionario y cargue en la primera cámara del chip. Repita este proceso hasta que los embriones hayan sido dispensados en cada cámara.
   NOTA: Este paso debe realizarse en un área con corrientes de aire mínimas, ya que el alto flujo de aire puede causar una evaporación excesiva del fluido, lo que posteriormente resulta en una reducción de la sensibilidad al genotipado y la supervivencia de los embriones.
4. Una vez que se haya cargado el número deseado de embriones en el chip de extracción de ADN, cárgelo en la plataforma de genotipado de embriones de pez cebra. Esto se logra mejor colocando primero en un lado, seguido del resto.
   NOTA: Evite agregar demasiada presión a la plataforma, ya que esto puede sobrecargar y dañar los resortes subyacentes.
5. Coloque la tapa de la plataforma magnética sobre el chip, lo que evitará la evaporación de los medios embrionarios durante el protocolo de extracción de ADN, y cierre la tapa de la plataforma.
6. Configure la unidad base en 2,4 voltios, 0,051 A y 0,12 W e inicie el protocolo de extracción de ADN presionando el botón "ON/OFF". La plataforma debe comenzar a vibrar, lo que se puede evaluar tocando suavemente la tapa. El protocolo debe ejecutarse durante 8 minutos.
   NOTA: La vibración vigorosa resulta en el desprendimiento de células epidérmicas, de las cuales se extrae el ADN genómico.
7. Mientras se ejecuta el programa, prepare una placa de 24 pozos agregando 1 ml de medio embrionario a cada pozo, lo cual es necesario para separar embriones individuales mientras se realizan los ensayos de genotipado aguas abajo.
8. Además, etiquete adecuadamente 8 tubos de tiras de pozos, que se utilizarán para la recolección de material de ADN de cada embrión.
9. Al finalizar el protocolo de 8 minutos, presione el botón ON / OFF para detener la vibración de la plataforma.
10. Abra la tapa de la plataforma y retire suavemente la tapa magnética para garantizar que se aplique una presión mínima a la plataforma.
11. Retire con cuidado el chip de extracción de ADN de la plataforma y colóquelo sobre una superficie plana.
12. De la primera cámara, retire 10 μL de medios embrionarios que rodean al embrión y colóquelo en el pozo apropiado del tubo de tira de 8 pozos. El medio contiene el material genético de ese embrión, que se utilizará para los ensayos posteriores.
    NOTA: Evite tocar el embrión con la punta de la pipeta durante la recolección de medios, ya que esto puede dañar el embrión.
13. Usando una pipeta de plástico, agregue inmediatamente dos gotas de medio embrionario fresco a la misma cámara. Recoge el embrión y muévelo al primer pozo de una placa de 24 pozos.
14. Repita los pasos 1.12 y 1.13 para todas las cámaras restantes. Al finalizar esto, la placa de 24 pozos que contiene embriones vivos se puede mover a una incubadora de 28 ° C.
15. Realizar ensayos de genotipado aguas abajo apropiados para determinar el genotipo de los embriones.
    NOTA: El ADN obtenido de la plataforma de genotipado embrionario puede ser amplificado con éxito por PCR y puede ser utilizado para análisis posteriores incluyendo secuenciación, electroforesis en gel, o análisis de fusión de alta resolución¹⁴. Para genotipar la cepa lama2 descrita en los resultados representativos se utilizó PCR, digestión por restricción y electroforesis en gel. Dado que la concentración de ADN obtenida de cada embrión es baja, se sugiere utilizar la mayoría, si no todo, del material genético obtenido para el ensayo posterior.
16. Una vez identificado el genotipo de cada larva, transfiéralas a placas de Petri de 90 mm, colocando cada genotipo en un plato diferente. Llene el plato con 25 ml de embriones medianos y manténgalos en la incubadora de 28 °C.

2. Realizar una lesión muscular con una puñalada con aguja

1. Una vez que las larvas son 4 dpf, anestesiarlas añadiendo metanosulfonato de tricaína a una concentración final de 0,016% (v/v) en medio embrionario. Espere 10 minutos para asegurarse de que los peces estén completamente anestesiados, evidente cuando los peces dejan de nadar.
   NOTA: Para evitar sesgos, la identidad del genotipo debe cegarse al investigador que realiza las puñaladas y los análisis posteriores.
2. Durante este tiempo, prepare 24 placas de pozo llenando cada pozo con 1 ml de medio embrionario fresco, y configure el estereomitroscopio con un fondo negro y luz de alta potencia, para facilitar la visualización de los bordes de somite.
3. Usando una pipeta de plástico, transfiera una larva anestesiada a una nueva placa de Petri.
4. Retire cuidadosamente el exceso de medio embrionario con una pipeta y, bajo un microscopio de disección, oriente el pez de tal manera que la cabeza esté a la izquierda, la cola a la derecha, la región dorsal hacia arriba y la región ventral haciaabajo (Figura 1B).
5. Trabajando bajo un microscopio de disección, use una aguja de calibre 30 para realizar una puñalada rápida pero precisa en el músculo epaxial ubicado por encima del mioseptum horizontal. Para asegurar la consistencia en la posición anterior-posterior, apunte a 1-2 somitas ubicadas por encima del poro anal (Figura 1B).
   NOTA: Evite apuñalar el tubo neural y la notocorda, y trabaje rápidamente para evitar el secado del pescado durante el proceso.
6. Usando una pipeta de plástico, vierta una gota de medio embrionario sobre el pez cebra apuñalado y transfiéralo cuidadosamente a un pozo de la placa de 24 pozos.
7. Repita los pasos 2.3 a 2.6. hasta que todos los peces han sido apuñalados.
   NOTA: Varias larvas pueden ser apuñaladas juntas dependiendo de la velocidad de procesamiento y la competencia del investigador, siempre y cuando los peces no se sequen durante el proceso.
8. Una vez que todas las larvas hayan sido apuñaladas, coloque la placa de 24 pozos en la incubadora de 28 ° C hasta que se realicen las imágenes posteriores.

3. Imágenes de lesión muscular y recuperación

1. A 1 día después de la lesión (1 dpi), anestesiar las larvas apuñaladas agregando metanosulfonato de tricaína a una concentración final de 0.016% (v / v) en medio embrionario. Espere 10 minutos para asegurarse de que los peces estén completamente anestesiados, evidente cuando los peces dejan de nadar.
   NOTA: A 0 dpi, el sitio de la herida contiene una gran cantidad de desechos celulares, lo que dificulta la cuantificación de la extensión de la lesión muscular(Figura suplementaria 1A-B). Se necesitan aproximadamente 18-20 horas para que estos desechos se eliminen del sitio de la herida y, como tal, es más confiable obtener imágenes de larvas a 1 dpi, en lugar de 0 dpi, para determinar el alcance de la lesión provocada.
2. Coloque un plato basado en el fondo de vidrio limpio y vacío en el escenario del microscopio polarizador y coloque el fondo utilizando el software integrado.
   NOTA: No utilice placas de Petri de plástico para obtener imágenes de birrefringencia, ya que no transmiten adecuadamente la luz refractada. Dependiendo del microscopio polarizado utilizado, es posible que se requieran ajustes adicionales según las pautas del fabricante.
3. Una vez establecido el fondo, retire el plato a base de fondo de vidrio de la etapa de microscopio y, con una pipeta de vidrio, transfiera el pescado anestesiado y apuñalado al plato a base de fondo de vidrio.
4. Retire cuidadosamente el exceso de medio embrionario con una pipeta y oriente el pez según 2.5: la cabeza está a la izquierda, la cola a la derecha, la región dorsal hacia arriba y la región ventral hacia abajo.
   NOTA: Asegúrese de que las larvas se monten lo más planas posible, ya que el montaje desigual da como resultado diferentes intensidades de birrefringencia en diferentes somitas.
5. Coloque el plato a base de fondo de vidrio con las larvas anestesiadas en el escenario del microscopio y realice una imagen del músculo con luz polarizada(Figuras 1C y 1D).
   NOTA: Dependiendo del tipo de microscopio/lente polarizada utilizado, la orientación del pez en su eje anterior-posterior puede afectar la birrefringencia general¹⁵. Asegúrese de incluir al menos 5 somitas a cada lado del sitio de la lesión al tomar imágenes.
6. Usando una pipeta de plástico, vierta una gota de medio embrionario para rehidratar el pescado y coloque el pescado en un pozo de una placa de 24 pozos llena de medio embrionario.
   NOTA: Es importante realizar las imágenes lo más rápido posible para evitar que el pescado se seque.
7. Repita los pasos 3.3. a 3.6. hasta que todos los peces han sido fotografiado.
8. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, guárdelas en formato .tiff para análisis posteriores.
9. Vuelva a colocar el pez en la incubadora de 28 °C hasta realizar la imagen posterior a 3 dpi (7 dpf).
10. Cuando los peces son de 3 dpi, imagine que el pez según 3.3 a 3.8.
11. Una vez que todos los peces hayan sido fotografiados, eutanasiarlos agregando metanosulfonato de tricaína a una concentración final de 0.2% (v / v) en medio embrionario. Espere al menos 10 minutos para asegurarse de que los peces sean sacrificados, evidente por la pérdida de la capacidad de natación, el bombeo de las cubiertas branquiales y la falta de una respuesta de vuelo después del tacto.

4. Cuantificación de la regeneración muscular

1. Abra una imagen de 1 ppp en un software de análisis de imágenes como el software Image J disponible gratuitamente.
2. Usando la herramienta de polígono, dibuje alrededor del sitio de la herida y mida el área y la intensidad media de birrefringencia de esta región(Figuras 1C y 1D). Copie estos valores en las celdas D3 y E3 de la plantilla proporcionada (Tabla suplementaria 1).
3. Dibuje dos regiones adicionales, cada una de las que abarca 1-2 somitas ilesas, y mida el área y las intensidades medias de birrefringencia de cada una de estas regiones(Figuras 1C y 1D). Copie estos valores en las celdas D4-D5 y E4-E5 de la plantilla proporcionada (Tabla suplementaria 1).
   NOTA: Si bien es preferible seleccionar los mismos somitas ilesos en las imágenes de 1 dpi y 3 dpi, el desprendimiento esporádico de las fibras musculares y la posterior reducción de la birrefringencia en los mutantes pueden hacer que esto sea imposible. Por lo tanto, en el caso de que los mismos somitas no se puedan seleccionar a 1 dpi y 3 dpi debido a la reducción de la integridad muscular en los mutantes, seleccione dos áreas diferentes pero no afectadas en cada uno de los puntos de tiempo.
4. Calcule la birrefringencia normalizada para cada región dividiendo la intensidad media de birrefringencia de esa región por el área, que se muestra en la columna F de la plantilla proporcionada (Tabla suplementaria 1).
5. Repita los pasos 4.1-4.4 para todas las imágenes de 1 ppp y 3 ppp.
   NOTA: Cuando se utiliza la plantilla proporcionada (Tabla suplementaria 1), el área de 1 dpi y los valores medios de intensidad de birrefringencia deben insertarse en las columnas D y E respectivamente, y el área de 3 dpi y los valores medios de intensidad de birrefringencia deben insertarse en las columnas J y K respectivamente.
6. Para cada punto de tiempo, calcule la birrefringencia normalizada promedio de las dos regiones no lesionadas. Este valor proporciona un punto de referencia del músculo no lesionado.
   NOTA: En la plantilla proporcionada (Tabla suplementaria 1), este valor se calcula en las columnas G y M, para las imágenes de 1 dpi y 3 dpi respectivamente.
7. A continuación, determine la extensión de la lesión muscular a 1 dpi, dividiendo la birrefringencia normalizada de la región de la lesión por la birrefringencia normalizada promedio de las regiones no lesionadas (calculada en 4.6).
   NOTA: Utilizando el procedimiento de apuñalamiento con aguja detallado anteriormente, las larvas de tipo silvestre generalmente muestran una birrefringencia normalizada de 48.5 ± 14.3% en el sitio de la herida a 1 dpi, lo que indica que la birrefringencia se ha reducido en aproximadamente un 50% en comparación con los somitas ilesos. Cuando se utiliza la plantilla (Tabla suplementaria 1), este valor se calcula como un porcentaje en la columna H.
8. Para determinar el grado de regeneración muscular, divida la birrefringencia normalizada de la región de la lesión en la imagen de 3 dpi, por la intensidad normalizada promedio de las regiones no lesionadas en esta etapa.
   NOTA: A 3 dpi, las larvas de tipo silvestre suelen mostrar una birrefringencia normalizada de 60 ± 15,3% en el sitio de la herida. Dado que la birrefringencia normalizada dentro del sitio de la herida a 1 dpi fue de 48,5 ± 14,3% (paso 4,7), el aumento de la birrefringencia a 3 dpi a 60 ± 15,3% indica una recuperación de aproximadamente 11,5%. Cuando se utiliza la plantilla (Tabla suplementaria 1), este valor se calcula como un porcentaje en la columna N.
9. Manteniendo los peces dentro de cada genotipo separados, realice una prueba t emparejada que compare la birrefringencia normalizada del sitio de la herida a 3 dpi (paso 4.8) con la de 1 dpi (paso 4.7). Esto revelará la trayectoria de regeneración muscular mostrada por cada pez en cada genotipo, y resaltará si el grado de regeneración muscular mostrado por cada genotipo ha cambiado significativamente.
10. Finalmente, calcule el índice regenerativo dividiendo el valor obtenido en el paso 4.8, que es el grado de regeneración muscular a 3 dpi, por el valor obtenido en el paso 4.7, que es el grado de lesión muscular a 1 dpi. Un índice regenerativo de 1 indica que la lesión a 1 dpi es comparable a 3 dpi y que no se ha producido regeneración muscular; un valor por encima de 1 indica que a 3 dpi se ha formado un nuevo músculo en el sitio de la herida destacando que el músculo se ha regenerado; y un índice regenerativo de menos de 1 destaca que la herida a 3 dpi es peor que 1 dpi, y que la regeneración muscular está deteriorada. Se puede realizar una prueba t o un ANOVA unidireccional para comparar estadísticamente el grado de regeneración muscular entre los diferentes genotipos. Cuando se utiliza la plantilla proporcionada (Tabla suplementaria 1), este valor se calcula en la columna O.
    NOTA: Se recomienda realizar todo el experimento por triplicado, con peces de cada experimento obtenidos de diferentes padres biológicos, y cada experimento realizado en diferentes días, para evitar cualquier sesgo.

Resultados

La capacidad de cuantificar la birrefringencia del músculo esquelético proporciona un método no invasivo pero altamente reproducible para examinar y comparar los niveles de daño muscular, y examinar la regeneración muscular in vivo. La birrefringencia resulta de la difracción de la luz polarizada a través de la matriz pseudocristalina de los sarcómeros musculares¹⁵, y después de una lesión o daño al músculo, es evidente una reducción en la bir...

Discusión

La regeneración del músculo esquelético está impulsada por células madre musculares residentes en el tejido obligado, cuya función se altera en muchas enfermedades musculares como la distrofia muscular, impidiendo posteriormente el proceso de regeneración muscular. Aquí, describimos un protocolo de alto rendimiento para examinar la regeneración muscular en modelos vivos de pez cebra de enfermedad muscular. El primer paso de la tubería utiliza una plataforma de genotipado de embriones^14,q...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Thermo Fischer	142475
30 gauge needles	Terumo	NN-3013R
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products PT	S9014S20
DNA extraction chips	wFluidx	ZEG chips
Embryo genotyping platform	wFluidx	ZEG base unit	Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette	Hirschmann	9260101
Glass plate dish	WPI	FD35-100	Commonly referred to as FluoroDish
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Plastic pipette	Livingstone	PTP03-01
Polarizing microscope	Abrio	N/A