Un modèle murin pour la pancréatite chronique par perfusion de TNBS dans les voies biliaires

Résumé

La pancréatite chronique (PC) est une maladie caractérisée par une inflammation et une fibrose du pancréas, souvent associée à des douleurs abdominales intraitables. Cet article se concentre sur le raffinement de la technique pour générer un modèle murin de CP par perfusion de voies biliaires avec de l’acide 2,4,6 -trinitrobenzène sulfonique (TNBS).

Résumé

La pancréatite chronique (PC) est une maladie complexe impliquant une inflammation pancréatique et une fibrose, une atrophie glandulaire, des douleurs abdominales et d’autres symptômes. Plusieurs modèles de rongeurs ont été développés pour étudier la PC, dont le modèle de perfusion d’acide sulfonique 2,4,6-trinitrobenzène (TNBS) des voies biliaires reproduit les caractéristiques de la douleur neuropathique observées dans la PC. Cependant, la perfusion de médicaments pour les voies biliaires chez la souris est techniquement difficile. Ce protocole démontre la procédure de perfusion de TNBS des voies biliaires pour la génération d’un modèle murin CP. Le TNBS a été perfusé dans le pancréas par l’ampoule de Vater dans le duodénum. Ce protocole a optimisé le volume de médicaments, les techniques chirurgicales et la manipulation des médicaments pendant la procédure. Les souris traitées par TNBS ont montré des caractéristiques de LA PC reflétées par des réductions de poids corporel et du pancréas, des changements dans les comportements associés à la douleur et une morphologie pancréatique anormale. Avec ces améliorations, la mortalité associée à l’injection de TNBS était minime. Cette procédure est non seulement essentielle pour générer des modèles de maladie pancréatique, mais est également utile dans l’administration locale de médicaments pancréatiques.

Introduction

La pancréatite chronique (PC) est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par l’atrophie du pancréas, la fibrose, les douleurs abdominales et la perte éventuelle des fonctions exocrine et endocrinienne¹. Les traitements médicaux et chirurgicaux actuels ne sont pas curatifs mais sont entrepris pour soulager les symptômes qui sont la conséquence de la maladie: douleurs abdominales réfractaires, dysfonctionnement endocrinien et exocrinien. Par conséquent, des traitements plus efficaces sont nécessaires de toute urgence². Les modèles animaux constituent un outil essentiel pour développer une meilleure compréhension de la maladie et étudier les traitements potentiels³. Plusieurs modèles murins pour la PC ont été développés, dont des modèles de céruléine et / ou d’alcool sont couramment utilisés. Il a été démontré que la céruléine, un oligopeptide stimulant la sécrétion pancréatique, induit de manière reproductible un modèle CP présentant une atrophie pancréatique, une fibrose, entre autres⁴. Un autre modèle courant utilise des injections en série de L-arginine, qui produit une insuffisance exocrine similaire à celle observée chez les patients humains⁵. La PC peut également être induite par une ligature complète ou partielle du canal pancréatique, ainsi que par une hypertension du canal pancréatique^6,7. Malgré la variété des modèles animaux disponibles pour la PC, aucun de ces modèles ne reproduit efficacement la douleur abdominale ressentie par les patients atteints de^{PC 8.}

Des études antérieures ont montré que l’injection pancréatique locale d’acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique (TNBS) reproduit la douleur persistante ressentie par les patients atteints de^{PC 9,10,11}. Les souris traitées par TNBS ont démontré une hypersensibilité abdominale et une augmentation des comportements liés à la douleur ainsi qu’une « hypersensibilité généralisée » aux stimuli douloureux, un phénomène qui a été observé chez les patients atteints de PC^10. En plus d’imiter avec précision la douleur CP, le modèle TNBS reproduit également d’autres caractéristiques pathologiques de la condition humaine telles que la fibrose, l’infiltration de cellules mononucléaires et le remplacement des cellules acineuses par du tissu adipeux^10,12. Cependant, la perfusion de TNBS par les voies biliaires est une procédure techniquement difficile chez la souris qui peut causer la mort. À notre connaissance, il n’existe aucun protocole visuel pour montrer comment la perfusion dans les voies biliaires est effectuée. Dans cet article, nous démontrons la procédure de perfusion de TNBS pour générer un modèle murin CP. Cette procédure aidera à générer des modèles animaux précieux pour l’étude de la PC et d’autres maladies du pancréas et peut être utilisée pour infuser d’autres matériaux (par exemple, virus, cellules) dans le pancréas¹³.

Protocole

Toutes les procédures ont été menées avec l’approbation des comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud et du Ralph H. Johnson Medical Center. Des souris mâles C57BL/6J âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées dans cette étude. Les souris étaient logées sous un cycle standard de 12 lumières / 12 ténèbres avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.

1. Préparation de la solution injectable de TNBS

1. Préparer de l’éthanol à 10 % dans une solution saline à 0,9 %. Dissoudre le TNBS de base (voir tableau des matériaux)dans de l’éthanol à 10 % jusqu’à une concentration finale de 7,5 mM en ajoutant 7,5 μL de TNBS dans 1 mL d’éthanol à 10 %.
   ATTENTION : Le TNBS présente un danger chimique. Préparez la solution à l’intérieur d’une hotte et utilisez un équipement de protection individuelle tel que des gants, des lunettes et une blouse de laboratoire pour éviter tout contact direct avec le TNBS.
2. Chargez 50 μL de solution de TNBS à 0,75 % dans une seringue à insuline avec une aiguille de calibre 31. Charger 50 μL d’éthanol à 10 % dans une solution saline dans une seringue de la même taille que la commande du véhicule. Placez les seringues sur de la glace et protégez-les de la lumière jusqu’à ce que cela soit nécessaire.

2. Préparation et chirurgie de la souris

1. Rasez les cheveux de la zone chirurgicale abdominale.
2. Injecter une dose préventive de l’analgésique (p. ex. buprénorphine 0,1 mg/kg d’AP) avant la chirurgie.
3. Induire et maintenir la souris sous anesthésie générale avec 1,5-2% d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène. Confirmez l’anesthésie en pinçant les orteils et en observant l’animal faute de réflexe.
4. Placez la souris sur un coussin chirurgical chauffé pendant la chirurgie. Appliquez une pommade vétérinaire sur chaque œil lorsque la souris est sous anesthésie.
5. Désinfectez le site chirurgical en essuyant la zone chirurgicale 3x avec 2% d’iode, suivi de 70% d’alcool (Table des matières).
6. Effectuez une laparotomie avec des micro-ciseaux pour générer une incision de 0,5 à 1 cm.
7. Exposez doucement le duodénum et localisez le canal biliaire commun à l’aide de cotons-tiges (Table des matériaux).
8. Placez un micro-clip hémo droit (Table des matériaux) sur le conduit commun proximal pour empêcher l’écoulement de TNBS ou de solutions de véhicule dans le foie et la vésicule biliaire (Figure 1A, B).
9. Exposez doucement le duodénum et insérez l’aiguille dans le canal pancréatique à travers la papille de Vater.
10. Une fois que l’aiguille est à l’intérieur du conduit, placez un clip micro-hémo incurvé (Table des matériaux) sur le duodénum entourant l’aiguille (Figure 1A) pour fixer l’aiguille en place et empêcher la solution injectée de pénétrer dans le duodénum.
11. Infuser progressivement la solution (TNBS ou véhicule) dans le canal pancréatique pendant une minute.
    REMARQUE: Le TNBS doit être perfusé lentement pendant une minute de temps, et il est facile de contrôler la vitesse de perfusion lorsque le pancréas est perfusé avec une seringue à insuline avec une aiguille de 5/16 pouce et 31G. Gardez la main aussi stable que possible pour éviter de piquer le canal biliaire. Si le TNBS est injecté avec succès, la couleur jaune peut être visible à l’intérieur du pancréas.
12. Après la perfusion, retirez soigneusement la micro-pince près du foie, puis retirez la micro-pince qui maintient l’aiguille et le duodénum.
13. Revenir soigneusement au duodénum à sa position d’origine.
14. Laisser 0,5 mL de solution saline stérile chaude (36-37 °C) dans la cavité abdominale avant la fermeture, pour aider le duodénum à retrouver sa position d’origine et aider à la récupération du péristaltisme.
15. Fermez l’incision dans la couche musculaire à l’aide d’une suture continue avec un point de suture 5-0. Fermez la peau à l’aide d’une suture interrompue avec un point de suture 4-0.
16. Placez la cage contenant des souris sur un coussin chauffant pour permettre la récupération de l’anesthésie.
17. Confirmez que les souris sont chaudes et capables de mouvements spontanés avant de les renvoyer dans la salle de détention.
18. Continuer à fournir un analgésique (p. ex., buprénorphine 0,1 mg/kg p.i.) toutes les 12 h et de la chaleur supplémentaire pendant 48 h après la chirurgie.

3. Surveillance du comportement de la souris

1. Retirez les sutures au jour 7 après la chirurgie.
2. Surveillez la santé et le comportement de la souris quotidiennement pendant la première semaine après la chirurgie. Surveillez les signes de détresse tels que la vocalisation, la posture du dos voûté ou la réduction de la locomotion. Mesurez le poids corporel tous les deux jours.
3. Utilisez les monofilaments de Von Frey (VFF) pour mesurer l’hypersensibilité mécanique abdominale avant et 2, 3 semaines après la chirurgie comme décrit^9,14.
   1. Appliquez des VFF de différentes forces appliquées dans l’ordre croissant sur la région abdominale supérieure 10x tous les 1-2 s. Considérez le soulèvement, la rétraction ou le léchage de l’abdomen (réponse de sevrage) comme une réponse positive.
   2. Appliquez un stimulus plus fort si une réponse positive n’est pas observée, et un stimulus plus faible si une réponse positive est observée. Le seuil de retrait est la force à laquelle la souris répond 50% du temps.

4. Collecte et analyse histologique du tissu pancréatique

1. Sacrifiez les souris sous anesthésie par luxation cervicale et disséquez soigneusement le pancréas de l’intestin et d’autres organes.
2. Fixez le pancréas dans du paraformaldéhyde à 10% pendant 24 h, incorporez-le dans de la paraffine, coupez des sections de tissu de 5 μm d’épaisseur et placez-les sur des lames de verre pour les tacher.
3. Effectuer la coloration à l’hématoxyline-éosine et à la coloration trichrome de Masson à l’aide des méthodes standard indiquées précédemment⁴.

Résultats

Les procédures de perfusion des voies biliaires ont été optimisées pour réduire la mortalité des souris associée à cette procédure¹⁰. Le TNBS a d’abord été administré dans un volume total de 35 μL ou 50 μL. L’injection de TNBS dans un volume de 50 μL pourrait atteindre l’ensemble du pancréas et induire un phénotype de maladie plus homogène (Figure 1B). De plus, l’injection de TNBS à l’aide d’une seringue à insuline avec aiguille 31G pou...

Discussion

L’infusion de TNBS dans les voies biliaires pour induire une pancréatite chronique est techniquement difficile chez la souris, car jusqu’à 22,5% des souris peuvent mourir dans les 3-4 jours suivant la perfusion du médicament¹⁰. Ici, ce rapport a affiné la procédure sur la base d’études antérieures et a réduit la mortalité précoce des souris à <10%. Par exemple, l’augmentation du volume de médicaments (de 35 μL à 50 μL) peut garantir que les médicaments atteignent l’ensemb...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF