Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern derselben Spezies zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Heutzutage ist es möglich, eine breite Palette von molekularen Werkzeugen zu finden, um Parasiten-Wirts-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Es bestehen jedoch einige Einschränkungen, um kommerzielle monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erhalten, die spezifische Zellstrukturen und Proteine in Parasiten erkennen. Außerdem gibt es nur wenige kommerzielle Antikörper zur Kennzeichnung von Trypanosomatiden. Normalerweise werden polyklonale Antikörper gegen Parasiten im eigenen Haus hergestellt und könnten in Kombination mit anderen Antikörpern, die in derselben Spezies produziert werden, schwieriger zu verwenden sein. Hier zeigt das Protokoll, wie polyklonale und monoklonale Antikörper, die in derselben Spezies gezüchtet wurden, verwendet werden, um eine Doppeltemarkierung der Immunfluoreszenz durchzuführen, um wirtszell- und pathogeninteraktionen zu untersuchen. Um die doppelmarkierende Immunfluoreszenz zu erreichen, ist es entscheidend, zuerst den polyklonalen Antikörper der Maus zu inkubieren und dann die Inkubation mit dem sekundären Maus-IgG-Antikörper zu verfolgen, der mit einem beliebigen Fluorochrom konjugiert ist. Danach ist ein zusätzlicher Blockierungsschritt notwendig, um zu verhindern, dass spuren des primären Antikörpers vom nächsten sekundären Antikörper erkannt werden. Dann werden ein monoklonaler Maus-Antikörper und sein spezifischer sekundärer IgG-Unterklasse-Antikörper, der an ein anderes Fluorochrom konjugiert ist, zu den geeigneten Zeitpunkten in die Probe gegeben. Darüber hinaus ist es möglich, eine dreifache Markierung der Immunfluoreszenz mit einem dritten Antikörper durchzuführen, der in einer anderen Spezies aufgezogen wurde. Auch Strukturen wie Kerne und Aktin können anschließend mit ihren spezifischen Verbindungen oder Markierungen gefärbt werden. Somit können diese hier vorgestellten Ansätze für jede Zelle angepasst werden, deren Primärantikörperquellen begrenzt sind.