Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito

Resumo

Apresentamos protocolos para três métodos diferentes para a homogeneização de quatro diferentes grupos musculares de tecido muscular esquelético de ratos para medir e comparar os níveis de nitrato e nitrito. Além disso, comparamos diferentes pesos amostrais para investigar se o tamanho da amostra tecidual afeta os resultados da homogeneização.

Resumo

Íons de nitrato (NO₃^-) já foram pensados para ser produtos finais inertes do metabolismo do óxido nítrico (NO). No entanto, estudos anteriores demonstraram que os íons nitrato podem ser convertidos de volta ao NO em mamíferos através de um mecanismo de redução de duas etapas: o nitrato sendo reduzido a nitrito (NO₂^-) principalmente por bactérias comensais orais, em seguida, o nitrito sendo reduzido a NO por vários mecanismos, incluindo através de proteínas contendo heme ou molibdênio. Esta via redutora do nitrato contribui para melhorar as vias de sinalização mediadas pelo NO, particularmente no sistema cardiovascular e durante o exercício muscular. Os níveis de nitrato no organismo antes dessa utilização são determinados por duas fontes diferentes: oxidação endógena do NO e ingestão dietética de nitrato, principalmente de plantas. Para elucidar o complexo ciclo do NO em circunstâncias fisiológicas, examinamos ainda mais a dinâmica de seus metabólitos, nitrato e íons nitrito, que são relativamente estáveis em comparação com o NO. Em estudos anteriores, o músculo esquelético foi identificado como um importante órgão de armazenamento de íons nitrato em mamíferos, bem como uma fonte direta de NO durante o exercício. Portanto, estabelecer uma metodologia confiável para medir os níveis de nitrato e nitrito no músculo esquelético é importante e deve ser útil para estender sua aplicação a outras amostras de tecido. Este artigo explica em detalhes a preparação de amostras de músculo esquelético, utilizando três métodos de homogeneização diferentes, para medições de nitrato e nitrito e discute questões importantes relacionadas aos processos de homogeneização, incluindo o tamanho das amostras. As concentrações de nitrato e nitrito também foram comparadas em quatro grupos musculares diferentes.

Introdução

O óxido nítrico (NO), uma pequena molécula sinalizadora gasosa, desempenha um papel crítico nos processos fisiológicos e fisiopatológicos¹. O NO pode ser produzido a partir da L-arginina por enzimas endógenas da família da óxido nítrico sintase (NOS) antes de ser submetido à rápida oxidação em nitrato (NO 3-) e, possivelmente, nitrito (NO 2^-) no sangue e nos tecidos ^2,3. Recentemente, esses ânions demonstraram ser reduzidos de volta ao NO em sistemas de mamíferos⁴. O nitrato é convertido em nitrito, principalmente por nitrato redutases bacterianas comensais na cavidade oral atuando sobre íons secretados pelas glândulas salivares e ingeridos diretamente ⁵ e, em certa medida, por enzimas de mamíferos como a xantina oxidorredutase ^6,7. O nitrito pode ser ainda reduzido a NO por vários mecanismos, incluindo desoxihemoglobina⁸, desoximioglobina⁹, enzimas contendo molibdênio 10 e redução não enzimática na presença de prótons^11,12.

Esta via nitrato-nitrito-NO é reforçada em condições hipóxicas, em que a atividade da NOS é diminuída porque a NOS requer oxigénio para a geração NO⁴. Muitos estudos recentes têm relatado efeitos benéficos do nitrato dietético na regulação da pressão arterial e no desempenho do exercício, sugerindo que as vias de redução do nitrato contribuem para o aumento da sinalização do NO^13,14,15. Estudos anteriores mostraram que alguns músculos esqueléticos são provavelmente os principais locais de armazenamento de nitrato no corpo¹⁶. Em comparação com o sangue ou outros órgãos internos, como o fígado, o músculo esquelético (glúteo máximo) contém níveis significativamente mais elevados de nitrato e tem uma massa substancial no corpo dos mamíferos. O exercício em esteira foi mostrado para aumentar a redução de nitrato para nitrito e para NO em glúteos em um modelo^de rato 7. Esses resultados implicam que alguns músculos esqueléticos podem ser fontes importantes de NO através de vias de redução de nitrato em situações fisiológicas. Estudos mais recentes sugerem que esses achados, incluindo alterações nos níveis de nitrato muscular durante o exercício, também ocorrem em humanos¹⁷.

Dois dos autores atuais já haviam estabelecido um método para medir os níveis de nitrato e nitrito no sangue e em outras amostras líquidas¹⁸. No entanto, quando os níveis desses ânions em homogeneizados teciduais foram inicialmente analisados, protocolos detalhados não estavam disponíveis. Para entender a dinâmica nitrato-nitrito-NO em vários órgãos diferentes, nosso objetivo foi desenvolver um método preciso e eficiente para medir os níveis de nitrato e nitrito em tecidos de mamíferos, incluindo o músculo esquelético. Em estudos anteriores, tecidos de roedores foram utilizados para desenvolver processos de homogeneização confiáveis e, em seguida, analisar os teores de nitrato e nitrito nesses homogeneizados 7,16,19. O uso desse método de homogeneização foi estendido às amostras de biópsia do músculo esquelético humano, sendo confirmados os valores e, o que é mais importante, os valores observados para o músculo em comparação com o sangue/plasma estavam em faixas e proporções semelhantes às observadas em roedores¹⁷. Nos últimos anos, outros grupos também começaram a medir os níveis de nitrato e nitrito em homogeneizados musculares esqueléticos, relatando valores comparáveis aos relatados por nosso grupo^20,21.

O objetivo deste trabalho de protocolo é descrever em detalhes a preparação de homogeneizados musculares esqueléticos utilizando três diferentes métodos de homogeneização para posterior medição dos níveis de nitrato e nitrito. Além disso, os efeitos do peso tecidual utilizado para homogeneização sobre os valores de nitrato e nitrito em amostras de músculo esquelético foram examinados. Acreditamos que esses métodos podem ser facilmente aplicados a outros tipos de tecidos de mamíferos. Recentemente, especialmente no campo da fisiologia do exercício, foi dada atenção às possíveis diferenças na fisiologia do nitrato/nitrito/NO de acordo com os grupos musculares. Também relatamos as quantidades de nitrato e nitrito em quatro músculos de roedores diferentes e encontramos uma distribuição não uniforme de ambos os íons entre esses diferentes músculos; uma observação que requer um estudo mais aprofundado.

Protocolo

O protocolo animal foi aprovado pelo NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Os animais foram manuseados e tratados de acordo com o atual Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, disponível gratuitamente no site da AAALAC.

1. Coleção muscular esquelética de ratos

1. Enquanto um rato está sob anestesia profunda (isoflurano a 5%, confirmado pela reação ausente ao aperto da cauda / perna), inicie a perfusão com solução salina contendo heparina colocando uma agulha 19 G em um ápice do ventrículo esquerdo e fazendo um corte no átrio direito. Permita que a solução salina com heparina penetre através dos órgãos internos até que pelo menos 1,5 litro / kg tenha fluído através do tecido. Neste ponto, os animais estão mortos por exsanguinação e as carcaças estão prontas para serem processadas para coleta de amostras.
   NOTA: Alcançar uma boa perfusão é fundamental, especialmente para medições precisas de nitrito, porque o nitrito é oxidado em nitrato por qualquer hemoglobina restante.
2. Identificar os tecidos musculares alvo e retirá-los das patas traseiras²² usando instrumentos cirúrgicos limpos. Remova o máximo de gordura e tecidos conjuntivos dos tecidos musculares quanto possível.
3. Coloque a quantidade desejada de músculo em um tubo de microcentrífuga e, em seguida, coloque no gelo seco. Conservar os tubos cheios de tecido no congelador a -80 °C.
   NOTA: No caso de amostras de biópsia humana, apague-as completamente imediatamente após a coleta com gaze limpa para remover o excesso de sangue.

2. Preparação para homogeneização

1. Preparação de solução que conserva nitritos (solução de paragem)
   1. Preparar uma solução amarela límpida contendo 890 mM de ferricianeto de potássio (K₃Fe(CN)₆) e 118 mM de NEM (N-etilmaleimida) em água destilada, garantindo a ausência de cristais. Adicione o tensoativo não iônico (detergente) na proporção de 1:9 (v/v, Tabela de Materiais) e misture suavemente para evitar a formação de espuma.
   2. Diluir a solução de paragem na proporção de 1:9 com água destilada. Colocar a solução de paragem diluída (proporção de 1:5 de tecido muscular para solução de paragem diluída) no tubo de homogeneização.
      NOTA: Vinte miligramas de tecido exigirão 100 μL de solução de parada e 200 mg de tecido exigirão 1000 μL de solução de parada no tubo. A presença de detergente em solução adicionada é fundamental para a ruptura das membranas celulares. Qualquer detergente não iônico pode ser usado, mas deve-se tomar cuidado para verificar se ele não interfere com o método de quimioluminescência.
2. Preparação de tecidos
   1. Retire o tecido do congelador a -80 °C e descongele lentamente no gelo. Remova a gordura restante e o tecido conjuntivo do músculo esquelético. Corte pedaços de músculo esquelético e borre na gaze para secar.
   2. Pese a quantidade de tecido (20, 50 e 200 mg). Coloque o músculo esquelético pré-pesado na solução de parada nos tubos de homogeneização ou coloque o tecido pré-pesado em um tubo de microcentrífuga limpo para uso posterior.

3. Homogeneização

1. Homogeneizador rotativo (Figura 1)
   1. Coloque na máquina o tubo do tipo M que contém o músculo esquelético pré-pesado e a solução de paragem pré-medida. Homogeneizar cada amostra duas vezes (colocando no ciclo de homogeneização mais destrutivo) e colocar o tubo no gelo imediatamente após cada homogeneização por 5 minutos para esfriar.
   2. Centrifugar brevemente a 2.000 × g e 4 °C durante 5 min. Coloque o tubo cheio de volta no gelo e adicione o volume apropriado de metanol (≥ 99,9%, 10x do peso do tecido). Vórtice completamente por 15 s.
      NOTA: Para 20 mg de tecido, use 200 μL de metanol. O metanol é usado para precipitar proteínas do homogeneizado tecidual e não interfere com o método de quimioluminescência. Se for utilizado outro método de precipitação de proteínas, testar a sua compatibilidade com a quimioluminescência.
   3. Homogeneize mais uma vez e incube no gelo por 30 min. Centrifugar as amostras durante 35 minutos a 4 °C e 3 500 × g. Aspirar o sobrenadante e medir os níveis de nitrito/nitrato ou conservar a -80 °C para utilização posterior.
2. Homogeneizador de esferas (Figura 2)
   1. Colocar o tecido muscular esquelético num tubo contendo grânulos (proporção de 1:5 para tecido:solução de paragem diluída) e homogeneizar duas vezes durante 45 s à velocidade mais elevada disponível no instrumento utilizado. Coloque o tubo no gelo imediatamente após cada homogeneização por 5 minutos para esfriar.
   2. Centrífuga brevemente usando uma pequena centrífuga de desktop (2.000 x g) por 5 seg. Coloque o tubo de volta no gelo e adicione um volume apropriado de metanol (pureza ≥ 99,9%, 10x do peso do tecido). Vórtice completamente por 15 s.
      NOTA 1: Para 20 mg de tecido, use 200 μL de metanol.
      NOTA 2: O metanol é usado para precipitar proteínas do homogeneizado tecidual e não interfere com o método de quimioluminescência. Se for utilizado outro método de precipitação de proteínas, testar a sua compatibilidade com a quimioluminescência.
   3. Homogeneizar mais uma vez por 45 s na velocidade mais alta disponível no instrumento utilizado. Incubar no gelo por 30 min. Centrífuga a 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirar o sobrenadante e medir os níveis de nitrito/nitrato ou conservar a -80 °C para utilização posterior.
3. Pulverizador (Figura 3)
   1. Preparar tubos contendo solução de parada diluída (5x do peso do tecido) e pesá-los. Registar o peso (tubo + solução de paragem).
   2. Coloque a ferramenta pulverizadora de nitrogênio líquido no gelo seco e aguarde aproximadamente 30 minutos para que ela atinja a temperatura desejada.
   3. Usando pinças resfriadas em nitrogênio líquido, transfira uma amostra (peso do tecido já medido) para o pulverizador. Adicione uma pequena colher de nitrogênio líquido para garantir que o tecido esteja à temperatura do nitrogênio líquido.
   4. Depois que 95% do nitrogênio líquido tiver vaporizado, coloque a ferramenta de esmagamento em cima do tecido e pressione firmemente. Você deve sentir o esmagamento da amostra. Usando o martelo, bata na ferramenta de esmagamento 3-5x.
   5. Verifique a amostra para quaisquer pedaços restantes usando uma colher resfriada em nitrogênio líquido. Depois de resfriar em nitrogênio líquido, use um pedaço de papel de seda para limpar qualquer água congelada antes de tocar no tecido. Se um pedaço estiver presente, mova-o para o centro e, em seguida, ataque mais 5-6 vezes com o martelo.
   6. Quando toda a amostra tiver sido pulverizada, utilizar a colher de azoto líquido refrigerada para transferir directamente o tecido triturado para o tubo pré-pesado que contém a solução de paragem diluída (passo 3.3.1). Certifique-se de realizar esta etapa rapidamente, pois quando o músculo esquelético esmagado aquece, fica pegajoso e difícil de transferir.
   7. Vórtice por 15 s. Verifique se nenhum tecido está preso na parte superior do tubo, abrindo o tubo. Se houver, tente desalojá-lo e, em seguida, vórtice novamente.
   8. Centrifugar a amostra por 2-3 s usando uma pequena centrífuga de desktop. Pese o tubo novamente. Calcular o peso do tecido deduzindo o peso original do tubo (passo 3.3.1) deste novo peso. Coloque o tubo no gelo.
      NOTA: Os pesos exatos ajudarão a determinar o peso exato do tecido e quanto tecido foi perdido durante a pulverização.
   9. Uma vez que todas as amostras tenham sido processadas até ao passo 3.3.8, adicionar um volume adequado de metanol (≥ 99,9 %, 10x do peso tecidual). Vórtice completamente por 15 s e incube no gelo por 30 min.
      NOTA: Para 20 mg de tecido, use 200 μL de metanol. O metanol é usado para precipitar proteínas do homogeneizado tecidual e não interfere com o método de quimioluminescência. Se for utilizado outro método de precipitação de proteínas, testar a sua compatibilidade com a quimioluminescência.
   10. Centrífuga a 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirar o sobrenadante e medir os teores de nitrito/nitrato ou conservar a -80 °C para utilização posterior.

4. Medição de nitrito/nitrato com analisador de óxido nítrico (NOA)

1. Preparar todas as amostras por um dos três métodos de homogeneização diferentes descritos acima e injetá-las em um NOA para medição de nitrato e nitrito.
   NOTA: Protocolos detalhados para uso da NOA foram publicados anteriormente¹⁹.

Resultados

Para a obtenção de resultados representativos, foram utilizados tecidos musculares esqueléticos de 8 ratos Wistar (machos e fêmeas, peso 250 ± 50 g). Homogeneizados do músculo esquelético de ratos (50 mg de músculo glúteo máximo para cada método) foram preparados por três diferentes ferramentas de homogeneização (homogeneizador rotativo, homogeneizador de esferas e pulverizador). Os teores de nitrato e nitrito desses homogeneizados foram então determinados por meio de um analisador de óxido nítrico (NOA)...

Discussão

Para monitorar as mudanças nos metabólitos do NO, nitrato e nitrito, em função de intervenções fisiológicas, é imperativo medir os níveis desses íons nos diferentes órgãos que são críticos em seu metabolismo. Como a hemoglobina no sangue reagirá com o NO e seus metabólitos, também é importante remover o sangue rapidamente das amostras de tecido, tanto quanto possível. Assim, os animais foram perfundidos com solução salina antes de coletar tecidos musculares esqueléticos (glúteos, TA, EDL, músculo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentle MACS M tube	Miltenyi Biotec	130-093-236	Length: 87 mm; Diameter: 30 mm
Heparin Sodium	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Methanol	Sigma	646377
Minilys bead homogenizer	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM; N-ethylmaleimide	Sigma	4260
Nitric Oxide analyzer	GE	Sievers NOA 280i
NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol	Sigma	74385
Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys lysing kit	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization
Pulverizer kit	Cellcrusher	Cellcrusher kit