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Las vesículas bacterianas desempeñan un papel importante en la patogénesis y tienen aplicaciones biotecnológicas prometedoras. La heterogeneidad de las vesículas complica el análisis y el uso; por lo tanto, es necesario un método simple y reproducible para separar los diferentes tamaños de vesículas. Aquí, demostramos el uso de la cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas heterogéneas producidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
La pared celular de las bacterias Gram-negativas consiste en una membrana interna (citoplasmática) y externa (OM), separadas por una fina capa de peptidoglicano. A lo largo del crecimiento, la membrana externa puede sangrar para formar vesículas esféricas de la membrana externa (OMV). Estos OMV están involucrados en numerosas funciones celulares, incluida la entrega de carga a las células huésped y la comunicación con las células bacterianas. Recientemente, el potencial terapéutico de los OMV ha comenzado a ser explorado, incluyendo su uso como vacunas y vehículos de administración de medicamentos. Aunque los OMV se derivan del OM, durante mucho tiempo se ha apreciado que la carga de lípidos y proteínas del OMV difiere, a menudo significativamente, de la del OM. Más recientemente, se ha descubierto evidencia de que las bacterias pueden liberar múltiples tipos de OMV, y existe evidencia de que el tamaño puede afectar el mecanismo de su absorción por las células huésped. Sin embargo, los estudios en esta área están limitados por las dificultades para separar eficientemente los OMV de tamaño heterogéneo. La centrifugación por gradiente de densidad (DGC) se ha utilizado tradicionalmente para este propósito; sin embargo, esta técnica requiere mucho tiempo y es difícil de ampliar. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), por otro lado, es menos engorrosa y se presta a la escala futura necesaria para el uso terapéutico de omV. Aquí, describimos un enfoque SEC que permite la separación reproducible de vesículas de tamaño heterogéneo, utilizando como caso de prueba, OMVs producidos por Aggregatibacter actinomycetemcomitans, que varían en diámetro desde menos de 150 nm hasta más de 350 nm. Demostramos la separación de OMV "grandes" (350 nm) y OMV "pequeños" (<150 nm), verificados por dispersión dinámica de luz (DLS). Recomendamos las técnicas basadas en SEC sobre las técnicas basadas en DGC para la separación de vesículas de tamaño heterogéneo debido a su facilidad de uso, reproducibilidad (incluido el usuario a usuario) y la posibilidad de escalar.
Las bacterias gramnegativas liberan vesículas derivadas de su membrana externa, las llamadas vesículas de membrana externa (OMV), a lo largo del crecimiento. Estos OMV desempeñan un papel importante en la comunicación de célula a célula, tanto entre las bacterias y el huésped como entre las células bacterianas, al transportar una serie de biomoléculas importantes, incluyendo ADN / ARN, proteínas, lípidos y peptidoglicanos1,2. En particular, el papel de los OMV en la patogénesis bacteriana ha sido ampliamente estudiado debido a su enriquecimiento en ciertos factores de virulencia y toxinas3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Se ha informado que los OMV varían en tamaño de 20 a 450 nm, dependiendo de la bacteria madre y la etapa de crecimiento, con varios tipos de bacterias que liberan OMVde tamaño heterogéneo8,12, 13,14,que también difieren en su composición proteica y mecanismo de entrada de la célula huésped12. H. pylori liberó OMVs que varían en diámetro de 20 a 450 nm, con los OMVs más pequeños que contienen una composición de proteínas más homogénea que los OMVs más grandes. Es importante destacar que se observó que las dos poblaciones de OMVs eran internalizadas por las células huésped a través de diferentes mecanismos12. Además, hemos demostrado que Aggregatibacter actinomycetemcomitans libera una población de OMV pequeños (<150 nm) junto con una población de OMV grandes (>350 nm), con los OMV que contienen una cantidad significativa de una toxina proteica secretada, leucotoxina (LtxA)15. Si bien el papel de la heterogeneidad omv en los procesos celulares es claramente importante, las dificultades técnicas para separar y analizar distintas poblaciones de vesículas han limitado estos estudios.
Además de su importancia en la patogénesis bacteriana, se han propuesto OMV para su uso en una serie de aplicaciones biotecnológicas, incluso como vacunas y vehículos de administración de medicamentos16,17,18,19,20. Para su uso traslacional en tales enfoques, se requiere una preparación limpia y monodispersa de vesículas. Por lo tanto, son necesarios métodos efectivos y eficientes de separación.
Más comúnmente, la centrifugación por gradiente de densidad (DGC) se utiliza para separar poblaciones de vesículas de tamaño heterogéneo de los desechos celulares, incluidos los flagelos y las proteínas secretadas21; el método también se ha reportado como un enfoque para separar subpoblaciones omv de tamaño heterogéneo12,13,14. Sin embargo, DGC consume mucho tiempo, es ineficiente y muy variable de usuario a usuario22 y, por lo tanto, no es ideal para escalar verticalmente. Por el contrario, la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) representa un enfoque escalable, eficiente y consistente para purificar OMVs21,23,24. Hemos encontrado que una columna SEC larga (50 cm), de flujo por gravedad, llena de medio de filtración de gel es suficiente para purificar y separar eficientemente las subpoblaciones de OMV. Específicamente, utilizamos este enfoque para separar los OMV de A. actinomycetemcomitans en subpoblaciones "grandes" y "pequeñas", así como para eliminar la contaminación de proteínas y ADN. La purificación se completó en menos de 4 h, y se logró la separación completa de las subpoblaciones de OMV y la eliminación de escombros.
1. Preparación de tampones
2. Preparación de la muestra OMV
3. Embalaje de la columna S-1000
4. Carga de la muestra y recogida de fracciones
5. Análisis de muestras
Un esquema del protocolo se muestra en la Figura 1.
Figura 1: Esquema del procedimiento SEC. La columna se empaqueta con un medio de filtración de gel desgasificado cuidadosamente para evitar burbujas y discontinuidades, luego se lava con dos volúmenes de columna de tampón de elución. A continuación, la muestra se pipetea cuidadosamente en la parte superior del gel, sin interrumpir el embalaje del gel. La columna se abre y se ejecuta hasta que la muestra entra completamente en el gel. En este punto, el búfer se coloca en la parte superior de la columna y se recogen los primeros 20 ml de eluido. A continuación, se recoge una serie de fracciones de 1 ml. Estas fracciones se colocan en una placa de 96 pozos o una placa de inmunoplaca de 96 pozos para el análisis del contenido de lípidos y proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 2 muestra resultados representativos de este método. Los OMV producidos por A. actinomycetemcomitans cepa JP2 se purificaron por primera vez a partir del sobrenadante de cultivo utilizando ultracentrifugación15. Anteriormente encontramos que esta cepa produce dos poblaciones de OMVs, una con diámetros de unos 300 nm y otra con diámetros de unos 100 nm15. Para separar estas poblaciones de OMV, purificamos la muestra utiliz...
Aquí, hemos proporcionado un protocolo para la separación simple, rápida y reproducible de subpoblaciones bacterianas omv. Aunque la técnica es relativamente sencilla, hay algunos pasos que deben realizarse con mucho cuidado para garantizar que se produzca una separación eficiente en la columna. En primer lugar, es esencial que el gel se cargue en la columna con cuidado y lentamente para evitar burbujas de aire. Hemos observado que dejar el gel a temperatura ambiente durante varias horas antes de cargar la columna p...
Los autores no tienen conflictos de intereses que informar.
Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (1554417) y los Institutos Nacionales de Salud (DE027769).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
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