Cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana

La pared celular de las bacterias Gram-negativas consiste en una membrana interna (citoplasmática) y externa (OM), separadas por una fina capa de peptidoglicano. A lo largo del crecimiento, la membrana externa puede sangrar para formar vesículas esféricas de la membrana externa (OMV). Estos OMV están involucrados en numerosas funciones celulares, incluida la entrega de carga a las células huésped y la comunicación con las células bacterianas. Recientemente, el potencial terapéutico de los OMV ha comenzado a ser explorado, incluyendo su uso como vacunas y vehículos de administración de medicamentos. Aunque los OMV se derivan del OM, durante mucho tiempo se ha apreciado que la carga de lípidos y proteínas del OMV difiere, a menudo significativamente, de la del OM. Más recientemente, se ha descubierto evidencia de que las bacterias pueden liberar múltiples tipos de OMV, y existe evidencia de que el tamaño puede afectar el mecanismo de su absorción por las células huésped. Sin embargo, los estudios en esta área están limitados por las dificultades para separar eficientemente los OMV de tamaño heterogéneo. La centrifugación por gradiente de densidad (DGC) se ha utilizado tradicionalmente para este propósito; sin embargo, esta técnica requiere mucho tiempo y es difícil de ampliar. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), por otro lado, es menos engorrosa y se presta a la escala futura necesaria para el uso terapéutico de omV. Aquí, describimos un enfoque SEC que permite la separación reproducible de vesículas de tamaño heterogéneo, utilizando como caso de prueba, OMVs producidos por Aggregatibacter actinomycetemcomitans, que varían en diámetro desde menos de 150 nm hasta más de 350 nm. Demostramos la separación de OMV "grandes" (350 nm) y OMV "pequeños" (<150 nm), verificados por dispersión dinámica de luz (DLS). Recomendamos las técnicas basadas en SEC sobre las técnicas basadas en DGC para la separación de vesículas de tamaño heterogéneo debido a su facilidad de uso, reproducibilidad (incluido el usuario a usuario) y la posibilidad de escalar.