Cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana

Resumen

Las vesículas bacterianas desempeñan un papel importante en la patogénesis y tienen aplicaciones biotecnológicas prometedoras. La heterogeneidad de las vesículas complica el análisis y el uso; por lo tanto, es necesario un método simple y reproducible para separar los diferentes tamaños de vesículas. Aquí, demostramos el uso de la cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas heterogéneas producidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Resumen

La pared celular de las bacterias Gram-negativas consiste en una membrana interna (citoplasmática) y externa (OM), separadas por una fina capa de peptidoglicano. A lo largo del crecimiento, la membrana externa puede sangrar para formar vesículas esféricas de la membrana externa (OMV). Estos OMV están involucrados en numerosas funciones celulares, incluida la entrega de carga a las células huésped y la comunicación con las células bacterianas. Recientemente, el potencial terapéutico de los OMV ha comenzado a ser explorado, incluyendo su uso como vacunas y vehículos de administración de medicamentos. Aunque los OMV se derivan del OM, durante mucho tiempo se ha apreciado que la carga de lípidos y proteínas del OMV difiere, a menudo significativamente, de la del OM. Más recientemente, se ha descubierto evidencia de que las bacterias pueden liberar múltiples tipos de OMV, y existe evidencia de que el tamaño puede afectar el mecanismo de su absorción por las células huésped. Sin embargo, los estudios en esta área están limitados por las dificultades para separar eficientemente los OMV de tamaño heterogéneo. La centrifugación por gradiente de densidad (DGC) se ha utilizado tradicionalmente para este propósito; sin embargo, esta técnica requiere mucho tiempo y es difícil de ampliar. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), por otro lado, es menos engorrosa y se presta a la escala futura necesaria para el uso terapéutico de omV. Aquí, describimos un enfoque SEC que permite la separación reproducible de vesículas de tamaño heterogéneo, utilizando como caso de prueba, OMVs producidos por Aggregatibacter actinomycetemcomitans, que varían en diámetro desde menos de 150 nm hasta más de 350 nm. Demostramos la separación de OMV "grandes" (350 nm) y OMV "pequeños" (<150 nm), verificados por dispersión dinámica de luz (DLS). Recomendamos las técnicas basadas en SEC sobre las técnicas basadas en DGC para la separación de vesículas de tamaño heterogéneo debido a su facilidad de uso, reproducibilidad (incluido el usuario a usuario) y la posibilidad de escalar.

Introducción

Las bacterias gramnegativas liberan vesículas derivadas de su membrana externa, las llamadas vesículas de membrana externa (OMV), a lo largo del crecimiento. Estos OMV desempeñan un papel importante en la comunicación de célula a célula, tanto entre las bacterias y el huésped como entre las células bacterianas, al transportar una serie de biomoléculas importantes, incluyendo ADN / ARN, proteínas, lípidos y peptidoglicanos^1,2. En particular, el papel de los OMV en la patogénesis bacteriana ha sido ampliamente estudiado debido a su enriquecimiento en ciertos factores de virulencia y toxinas^3,

Protocolo

1. Preparación de tampones

1. Para preparar el tampón de lavado ELISA, agregue 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl y 1 g de albúmina sérica bovina (BSA) a 1 L de agua desionizada (DI). Añadir 500 μL de polisorbato-20. Ajuste el pH a 7.2 usando HCl o NaOH.
2. Para preparar el búfer de bloqueo, agregue 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl y 10 g de BSA. Agregue 500 μL de polisorbato-20 a 1 L de agua DI. Ajuste el pH a 7.2 usando HCl o NaOH.
3. Para preparar el tampón de elución (PBS), agregue 8.01 g de NaCl, 2.7 g de KCl, 1.42 g de Na₂HPO₄y 0.24 g de KH₂PO₄ a 1 L de agua DI. Ajuste el pH a 7.4 usando HCl o ....

Resultados

La Figura 2 muestra resultados representativos de este método. Los OMV producidos por A. actinomycetemcomitans cepa JP2 se purificaron por primera vez a partir del sobrenadante de cultivo utilizando ultracentrifugación¹⁵. Anteriormente encontramos que esta cepa produce dos poblaciones de OMVs, una con diámetros de unos 300 nm y otra con diámetros de unos 100 nm^15. Para separar estas poblaciones de OMV, purificamos la muestra utiliz.......

Discusión

Aquí, hemos proporcionado un protocolo para la separación simple, rápida y reproducible de subpoblaciones bacterianas omv. Aunque la técnica es relativamente sencilla, hay algunos pasos que deben realizarse con mucho cuidado para garantizar que se produzca una separación eficiente en la columna. En primer lugar, es esencial que el gel se cargue en la columna con cuidado y lentamente para evitar burbujas de aire. Hemos observado que dejar el gel a temperatura ambiente durante varias horas antes de cargar la columna p.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028
Amicon 50 kDa filters	Millipore Sigma	UFC905024
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9704-100
ELISA Immuno Plates	Thermo Scientific	442404
FM 4-64	Thermo Scientific	T13320	1.5 x 50 cm
Glass Econo-Column	BioRad	7371552
Infinite 200 Pro Plate Reader	Tecan
Potassium Chloride (KCl)	Amresco (VWR)	0395-500G
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4)	Amresco (VWR)	0781-500G
Sephacryl S-1000 Superfine	GE Healthcare	17-0476-01
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Chemical	S271-3
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Amresco (VWR)	0404-500G
Tris Base	VWR	0497-1KG
Tween(R) 20	Acros Organics	23336-2500