Diferenciación y polarización de macrófagos en un fenotipo similar a M2 utilizando una línea celular de leucemia THP-1 similar a monocitos humanos

Resumen

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) similares a M2 se asocian con progresión tumoral y mal pronóstico en el cáncer. Este protocolo sirve como una guía detallada para diferenciar y polarizar de manera reproducible las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Este modelo es la base para investigar los efectos antiinflamatorios de la TAM dentro del microambiente tumoral.

Resumen

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) pueden cambiar su expresión y perfil de citoquinas de acuerdo con los estímulos externos. Esta notable plasticidad permite a TAM adaptarse a los cambios en curso dentro del microambiente tumoral. Los macrófagos pueden tener principalmente atributos proinflamatorios (similares a M1) o antiinflamatorios (similares a M2) y pueden cambiar continuamente entre estos dos estados principales. Los macrófagos similares a M2 dentro del entorno tumoral se asocian con la progresión del cáncer y el mal pronóstico en varios tipos de cáncer. Se utilizan muchos métodos diferentes para inducir la diferenciación y polarización de las células THP-1 para investigar los mecanismos celulares e intercelulares y los efectos de TAM dentro del microambiente de los tumores. Actualmente, no existe un modelo establecido para la polarización de macrófagos similares a M2 utilizando la línea celular THP-1, y los resultados de la expresión y los perfiles de citoquinas de los macrófagos debido a ciertos estímulos in vitro varían entre los estudios. Este protocolo sirve como guía detallada para diferenciar las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos M0 y para polarizar aún más las células en un fenotipo similar a M2 dentro de los 14 días. Demostramos los cambios morfológicos de células similares a monocitos THP-1, macrófagos diferenciados y macrófagos polarizados similares a M2 utilizando microscopía de luz. Este modelo es la base para los modelos de línea celular que investigan los efectos antiinflamatorios de TAM y sus interacciones con otras poblaciones celulares del microambiente tumoral.

Introducción

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) y su papel en la inflamación crónica, la aparición del cáncer y el desarrollo de tumores son objetivos importantes en investigaciones recientes^1,2. Los monocitos de sangre periférica que se reclutan en el microambiente tisular del tumor en desarrollo se diferencian en macrófagos y pueden polarizarse en dos subtipos principales de macrófagos³. El macrófago activado clásicamente representa el fenotipo M1 principalmente proinflamatorio y el subtipo similar a M2 activado alternativamente muestra características predominantemente antiinflamatorias⁴. Los macrófagos pueden cambiar dinámicamente entre estos dos fenotipos principales dependiendo de su metabolismo celular, con subtipos intermedios que tienen atributos inflamatorios y antiinflamatorios⁵. TAM representa una población heterogénea de ambos fenotipos. Sin embargo, una función promotora de tumores y un mal pronóstico en diferentes tipos de cáncer se asocian particularmente con macrófagos similares a M2^6,7,8.

Los perfiles funcionales de los macrófagos y su interacción con otras células dentro del microambiente tumoral son complejos y difíciles de capturar en un entorno en constante cambio durante el desarrollo continuo del tumor. Las líneas celulares pueden proporcionar una población celular homogénea con viabilidad estable en cultivo, lo que puede facilitar el proceso de demostración de mecanismos celulares e intercelulares definidos. La línea celular THP-1 similar a un monocitos es un sistema modelo legítimo para monocitos humanos primarios⁹. Esta línea celular inmortalizada espontáneamente se ha obtenido de la sangre periférica de un lactante de un año con leucemia monocítica aguda^9,10. La diferenciación y polarización de las células THP-1 han sido reportadas por varios estudios y se han realizado de múltiples maneras diferentes^11,12,13,14. La activación y, por tanto, la polarización de los macrófagos en un fenotipo tipo M1 es seguida por un mecanismo de rebote antiinflamatorio compensatorio, promoviendo un fenotipo tipo M2 a través de citoquinas producidas por macrófagos inflamatorios, como la interleucina 6 (IL-6) o el itaconato^15,16. Esto podría servir como un mecanismo de ruptura para atenuar una respuesta inflamatoria excesiva después de la activación celular¹⁷. El proceso de diferenciar y polarizar monocitos y células similares a monocitos THP-1 en un fenotipo antiinflamatorio similar a M2 también se acompaña de estímulos proinflamatorios que deben superarse. Una respuesta inflamatoria de citoquinas puede ser causada por estrés mecánico^18,como cambiar los medios para realimentar las células, o agregar compuestos químicos para diferenciar las células THP-1, como forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), e inducir la producción de factor de necrosis tumoral α (TNFα), interleucina 1β (IL-1β) o IL-6^19. Este perfil alterado de expresión de citoquinas como respuesta a la PMA puede afectar y prevenir la polarización posterior de los macrófagos²⁰. Los períodos de descanso adecuados, como se informó antes después del tratamiento con PMA, permiten que estas respuestas inflamatorias disminuyan y faciliten la polarización celular en un fenotipo 21 distinto similar a^M2.

Este protocolo demuestra un método para diferenciar y polarizar las células similares a los monocitos THP-1 en un fenotipo de macrófagos similar a M2 en un plazo de 14 días.

Protocolo

Nota : una descripción general de los pasos descritos en este protocolo se muestra en la figura 1. Se compró la línea celular de leucemia similar a monocitos humanos THP-1. Se realizó un breve análisis de repetición en tándem para autenticar la línea celular THP-1. Realice todos los pasos en condiciones estériles. La línea celular monocítica THP-1 crece en suspensión y no se adhiere a las superficies de cultivo celular. La adherencia se puede inducir diferenciando los monocitos en células similares a los macrófagos a través de, por ejemplo, estrés mecánico o tratamiento específico conPMA.

1. Cultivo y mantenimiento de células similares a monocitos THP-1

1. Establezca un temporizador para 150 s. Retire el vial congelado que contiene la línea celular THP-1(Tabla de materiales)del nitrógeno líquido y descongele inmediatamente en un baño de agua limpia (37 °C). Inicie el temporizador tan pronto como el vial se coloque en el baño de agua. Afloje la tapa para liberar la presión que se está acumulando debido al proceso de descongelación, pero asegúrese de que la abertura del tubo no entre en contacto con el agua, para evitar la contaminación. El período de tiempo óptimo para descongelar las células se encuentra entre 120-150 s. Continúe descongelando la suspensión celular hasta que quede una viruta de hielo del tamaño de aproximadamente 4 mm dentro del vial; luego, continúe con el siguiente paso inmediatamente.
2. Transfiera la fase líquida de la suspensión celular a un tubo de 15 ml que contenga 9 ml de medios de crecimiento calientes (37 °C) (Tabla de materiales). Luego, transfiera 1 ml de la suspensión de células medias calientes al vial de THP-1 y vuelva al tubo de 15 ml para derretir la viruta de hielo restante y enjuague el vial para asegurarse de que no queden células.
3. Mezcle la suspensión suavemente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1000 μL. Retire una muestra pequeña (aproximadamente 10 μL) para contar la viabilidad de las células (usando azul tripano para la exclusión) mientras se hilan. Gire hacia abajo la suspensión de celda caliente a 200 x g durante 7 min a 37 °C.
4. Retire el sobrenadante por completo y vuelva a sususpend con un cierto volumen de medio de crecimiento caliente para lograr una densidad celular de 5 x 10⁵/ ml. Mezclar la suspensión suavemente y transferir 22 ml de volumen a matraces de cultivo celular T-75 (Tabla de materiales). Guarde los matraces en posición vertical en una incubadora a 37 °C con una concentración de dióxido de carbono (CO_{2) del 5%.} Intercambie los medios de crecimiento cada 3-4 días.

2. Siembra de células THP-1 y diferenciación en macrófagos M0

1. Preparar la célula que contiene el medio de crecimiento con la densidad celular respectiva para sembrar células a una densidad de 3 x 10⁵/mL/pozo en placas de cultivo celular de 24 pozos (Tabla de Materiales). Mezclar el medio suavemente y preparar alícuotas de 26 mL, cada una puesta en un tubo de 50 mL. Use cada alícuota de 26 ml para sembrar las células en una placa respectiva.
2. Transfiera 1 ml del medio que contiene la célula a cada pozo de una placa de 24 pozos. Mezcle los medios suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo entre transferencias.
3. Preparar una solución madre de PMA (disolver 1 mg de PMA en 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) = ~ 16 mM de solución de PMA en DMSO) y diluirla con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) a una concentración final de trabajo de 10 ng / μL justo antes del tratamiento celular (Tabla de materiales). Mantenga la solución en hielo y úselo inmediatamente. No vuelva a congelar. Agregue 100 ng de PMA por pozo. Deje que cada placa celular se asiente en la incubadora sin ningún tratamiento adicional durante 72 h.
4. Después de 72 h, retire el medio de crecimiento y reemplácelo con 1 ml de medio de crecimiento fresco. No toque el fondo de los pozos con puntas de pipeta. Deje reposar las células durante otras 96 h en la incubadora.
5. Después de 96 h, repita el paso 2.4 (cambio de medios) y deje que las células descansen durante otras 24 h.
   NOTA: Los macrófagos M0 ya están listos para ser utilizados en experimentos (Figura 2). Inmediatamente antes de tratar las células como parte de experimentos adicionales, considere un cambio de medios solo con RPMI(Tabla de materiales)ya que los suplementos de medios de crecimiento pueden causar interferencia con los reactivos que se agregan para el tratamiento celular. En caso de que se necesiten macrófagos similares a M2, continúe con la sección 3.

3. Polarización de macrófagos M0 en macrófagos similares a M2

1. Preparar una solución madre de IL-4 e IL-13 (disolver 20 μg de IL-4 o IL-13 en 200 μL de agua libre de nucleasa) y diluirla a una concentración final de trabajo de 2 ng/μL con PBS inmediatamente antes del tratamiento celular. Mantenga la solución en hielo y úselo inmediatamente. No vuelva a congelar.
2. Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con 1 ml de medio de crecimiento fresco. Añadir 20 ng de interleucina 4 (IL-4) y 20 ng de interleucina 13 (IL-13) por pozo. Deje reposar las células durante 48 h en la incubadora.
3. Después de 48 h, repita el paso 3.2. Deje reposar las células durante otras 48 h en la incubadora.
4. Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con 1 ml de medio de crecimiento fresco. Deje reposar las células durante 48 h en la incubadora.
   NOTA: Los macrófagos similares a M2 ahora están listos para ser utilizados en experimentos (Figura 2). Inmediatamente antes de tratar las células como parte de experimentos adicionales, considere un cambio de medios solo con RPMI(Tabla de materiales)ya que los suplementos de medios de crecimiento pueden causar interferencias.

4. Desprendimiento y recolección de macrófagos para citometría de flujo

NOTA: Utilice un método mecánico que combine el choque en frío y el raspado celular para separar y cosechar los macrófagos polarizados de las placas para la citometría de flujo.

1. Retire el medio de células calientes y reemplácelo con una mezcla de PBS helado (sin calcio y magnesio) y suero bovino fetal (FBS) al 5%, 1 ml por pozo. Inmediatamente después de esto, coloque la placa celular sobre hielo durante 45 minutos. No coloque la placa celular sobre hielo antes de que se retire el medio celular caliente, ya que esto disminuirá significativamente la viabilidad celular. Mantenga las células en hielo solo después de inducir el choque frío con la mezcla de PBS / FBS al 5% helada.
2. Después de 45 minutos en hielo, raspe las celdas usando mini raspadores de celdas(Tabla de Materiales). Transfiera suavemente los macrófagos desprendidos en PBS frío / 5% FBS en un tubo de 15 ml. Mantenga el tubo en hielo en todo momento hasta que las células se tiñen.
   NOTA: Auna ocho pozos de células para alcanzar recuentos celulares adecuados para la tinción.

Resultados

Se caracterizaron macrófagos similares a M2 y se validó la polarización M2 mediante citometría de flujo para marcadores de grupo de diferenciación (CD) CD14, CD11b, CD80 (marcador similar a M1) y CD206 (marcador similar a M2). La tinción por citometría de flujo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los macrófagos se lavaron con PBS/5% FBS y se incubaron con el bloqueo del receptor Fcγ para evitar la unión inespecífica. Las células se tiñeron con anticuerpos CD14 y CD80 antihumanos conj...

Discusión

Este protocolo sobre la diferenciación y polarización de células similares a monocitos THP-1 en 14 días proporciona un método para obtener macrófagos con un fenotipo distinto similar a M2 debido a la incubación de células de tratamiento prolongado con períodos de descanso adecuados entre pasos.

Ciertos pasos son críticos para este protocolo. El tiempo de duplicación de los monocitos THP-1 es de aproximadamente 26 h. Las células se pueden dividir a una densidad celular de 9 x^10...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
1.5 mL microcentrifuge tube	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-898
1000 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase solution 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 Incubator	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter cap	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)	Eppendorf, Enfield, USA	-
Ethyl alcohol (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc Block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)	R&D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4)	R&D, Minneapolis, USA	SRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA	-
L-Glutamine Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100	Nikon, Melville, USA	-
Nuclease-free water	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 variable pipet-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
P200 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus pipettor	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precision Water bath (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202