Интактная модель ишемического грызуна перикарда

Резюме

Этот протокол описывает этапы индуцирования инфаркта миокарда у мышей при сохранении перикарда и его содержимого.

Аннотация

Этот протокол показал, что перикард и его содержимое играют важную антифиброзную роль в модели ишемического грызуна (коронарная перевязка для индуцирования повреждения миокарда). Большинство доклинических моделей инфаркта миокарда требуют нарушения целостности перикарда с потерей гомеостатической клеточной среды. Однако недавно нами была разработана методология индуцирования инфаркта миокарда, которая минимизирует повреждение перикарда и сохраняет популяцию иммунных клеток сердца. Наблюдалось улучшенное функциональное восстановление сердца у мышей с интактным перикардиальным пространством после коронарной перевязки. Этот метод дает возможность изучить воспалительные реакции в перикардиальном пространстве после инфаркта миокарда. Дальнейшее развитие методов маркировки может быть объединено с этой моделью, чтобы понять судьбу и функцию перикардиальных иммунных клеток в регулировании воспалительных механизмов, которые управляют ремоделированием в сердце, включая фиброз.

Введение

По сей день сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) признаны ведущей причиной смерти во всем мире, что приводит к значительному финансовому бремени и снижению качества жизни пациентов¹. Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является подтипом ССЗ и играет важную роль в развитии инфаркта миокарда (ИМ), который является основным фактором смертности. По определению, ИМ возникает в результате необратимого повреждения ткани миокарда из-за длительных состояний ишемии и гипоксии. Ткани миокарда не хватает способности к регенерации, поэтому травмы являются постоянными и приводят к замене сердечной мышцы фиброзным рубцом, который может быть первоначально защитным, но в конечном итоге способствует неблагоприятному ремоделированию сердца и возможной сердечной недостаточности².

Хотя ведение пациентов с ИБС значительно улучшилось за последние несколько десятилетий, хроническая сердечная недостаточность (ХСН), вторичная по отношению к ишемии, поражает многих пациентов во всем мире. Для профилактики и управления этой эпидемией необходимо более глубоко понять основные механизмы и разработать новые терапевтические подходы. Кроме того, прошлые результаты подчеркивают ограничения системной терапии и необходимость разработки точных альтернатив. Учитывая, что исследование молекулярных последствий ИМ у людей зависит от способности доступа к инфарктной ткани, животные модели, которые повторяют характеристики и развитие ИМ человека и ХСН, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, являются незаменимыми.

Поскольку идеальные животные модели очень похожи на человеческое расстройство по структурным и функциональным характеристикам, этиология болезни должна направлять их концепцию. При ИБС это хронический атеросклеротический стеноз коронарных артерий или острая тромботическая окклюзия. Различные методы были разработаны и применены у различных видов лабораторных животных, чтобы вызвать сужение коронарной артерии или окклюзию. Такие стратегии можно в целом разделить на две группы: (1) механическая манипуляция коронарной артерией для индуцирования ИМ и (2) ускорение атеросклероза для облегчения коронарного сужения, приводящего к ИМ. Первая стратегия обычно включает в себя либо перевязку коронарной артерии, либо размещение стента внутри артерии. Второй подход, как правило, полагается на изменение рациона животного, чтобы включить пищу с высоким содержанием жира / холестерина. Некоторые из ограничений этого последнего подхода включают отсутствие контроля над сроками и местом коронарных окклюзий.

Напротив, хирургическая индукция ИМ или ишемии на животной модели имеет несколько преимуществ, таких как местоположение, точное время и степень коронарного события, что приводит к более воспроизводимым результатам. Наиболее широко используемым методом является хирургическое перевязка левой передней нисходящей коронарной артерии (ЛАД). Такие модели повторяют реакцию человека на острое ишемическое повреждение, а также прогрессирование до CHF³. Первоначально разработанная на более крупных животных, хирургия LAD на мелких животных, таких как грызуны, стала более осуществимой с достижениями в^{технологии 4}. При создании таких моделей мышам отдавали предпочтение по разным причинам, включая их относительную доступность, низкие затраты на жилье и их способность к генетическим манипуляциям.

Современные хирургические модели ишемической болезни сердца с использованием окклюзии LAD требуют, чтобы исследователь открыл перикард, чтобы временно или постоянно лигировать артерию⁵. Такие стратегии приводят к нарушению перикардиального пространства, которое играет по существу механическую и смазывающую функцию для обеспечения правильной сердечной функции. Еще одним недостатком вскрытия перикарда является потеря нативной перикардиальной жидкости животного с его различными клеточными и белковыми компонентами ^6,7. В ответ мы разработали метод индуцирования ИМ при сохранении перикарда нетронутым. В дополнение к минимизации возмущения этой гомеостатической среды, этот подход позволяет помечать и отслеживать конкретные клетки после возникновения ИМ. Кроме того, этот подход лучше представляет ишемическое повреждение миокарда в условиях человека.

протокол

Для этих экспериментов использовались самцы и самки мышей C57BL/6J в возрасте 8-14 недель. Этот протокол получил этическое одобрение от Комитета по уходу за животными в Университете Калгари и следует всем рекомендациям по уходу за животными.

1. Подготовка и хирургия мышей

1. Стерилизуйте хирургические инструменты (с помощью бисерного стерилизатора или автоклава).
2. Взвесьте мышь для предоперационного веса и обезболивающей дозы.
3. Поместите мышь в индукционную коробку с 4% изофлурана и 800 мл/мин кислорода. Подтвердите анестезирующую плоскость, зажав пальцы ног и наблюдая за животным на предмет отсутствия рефлекса.
4. Вводят анальгетик подкожно (0,1 мг/кг бупренорфина) (см. Таблицу материалов).
5. Поместите мышь на нагретую хирургическую прокладку во время операции и поддерживайте анестезию с 3% изофлурана, доставляемого через носовой конус. Нанесите офтальмологическую мазь, чтобы избежать сухости глаз к каждому глазу.
6. Сбрить волосы с груди и шеи хирургическими областями.
7. Удержите лапы мыши и расположите их на хирургическом столе.
8. Интубируйте мышь, вставив гладкий катетер весом 23 г в трахею через рот и глоток.
   1. Проветривайте мышь после интубации 2% изофлураном и 100% кислородом в качестве газа-носителя с помощью коммерческого вентилятора (см. Таблицу материалов), установленного со скоростью 110 вдохов / мин, приливным объемом 250 мкл и положительным давлением на конечный выдох (PEEP) 4 мм рт.ст.
9. Переверните мышь на 30% на правый бок, чтобы расположить левую сторону грудной клетки для операции.
10. Очистите хирургическую область 3 чередующимися скрабами из 70% этанола и бетадина круговыми движениями (см.Таблицу материалов). Поместите стерильные хирургические шторы вокруг хирургической области.
11. Сделайте боковой разрез 2-3 см в коже грудной клетки для визуализации грудных мышц с левой стороны. Отрежьте большую и минорную грудную клетку, используя разрез 1 см от средней линии наружу, чтобы визуализировать межреберные мышцы между третьим и четвертым ребрами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать избыточного кровотечения из грудной мышцы путем прижигания кровоточащих сосудов.
12. Сделайте разрез 2 см в левой межреберной мышце, чтобы ввести воздух (пассивным движением воздуха) в грудную полость, чтобы позволить сердцу и легким отпасть от хирургического разреза. Далее расширяйте отверстие с помощью прижигающего устройства (см. Таблицу материалов) для разреза межреберного разреза и предотвращения кровотечения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вентилятор следует временно остановить в период прижигания, чтобы избежать взрывных реакций с кислородом. Следует следить за тем, чтобы не повредить перикардиальный мешок.
13. Используя втягивающие средства, втягивайте ребра, чтобы обнажить сердце.
14. Наблюдайте за перикардом и нижележащим сердцем под стереомикроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перикард мыши достаточно тонкий, чтобы визуализировать сосудистую систему сердца.
15. Осторожно поместите щипцы на поверхность перикарда, чтобы уменьшить его движение и движение нижележащего сердца.
16. Визуально ориентируйте левую переднюю нисходящую (LAD) коронарную артерию, отслеживая ее появление из-под левого придатка.
17. Используя микроигольчатый драйвер, направьте соответствующий шов (см. Таблицу материалов) через перикард, под LAD, при этом шов появляется по другую сторону LAD и перикарда. Завяжите шов, чтобы ограничить кровоток через коронарную артерию и обрезать лишний шов с помощью ножниц (рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При ограничении притока крови к коронарной артерии должно быть видно бланширование передней части левого желудочка. Эта процедура представляет собой модель постоянной перевязки. Тем не менее, переходный подход лигирования с различными периодами ишемии также может быть применен на этом этапе.
18. Ниже места разреза в стерильной области вводят катетер 24 Г чрескожно в грудную клетку (удаляют направляющую иглу после входа в грудную полость). Затем закройте ребра, а затем мышечные слои и кожу с помощью соответствующего шва (коническая игла для мышц, обычная режущая игла для кожи).
19. Как только грудная клетка закрыта, эвакуируйте оставшийся воздух из грудной полости через катетер 24 G, используя мягкое всасывание со шприцем 3 мл и компрессиями грудной клетки. Как только воздух будет удален, выньте катетер 24 G.
20. Снижают изофлуран до 1%.
21. Выключите изофлуран, сохраняя вентиляцию кислородом, чтобы мышь могла восстановиться после анестезии. Как только животное проявит признаки самостоятельного дыхания, извлеките трахеальную трубку 23 г изо рта и поместите мышь в клетку для восстановления, чтобы контролировать ее для возобновления нормального дыхания.
22. Позвольте мыши восстановиться в клетке с частью клетки, помещенной на согревающую площадку, чтобы обеспечить внешний источник тепла.
23. Проводят поддерживающие инъекции анальгетика (бупренорфин 0,1 мг/кг, подкожно) каждые 12 ч в течение 72 ч после операции.
24. Следите за состоянием здоровья мышей ежедневно в течение 7 дней, что включает в себя оценку разрезов и дискомфорта животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за инвазивности этой процедуры (торакотомии) может потребоваться введение антибиотиков.

2. Функциональная оценка сердечной функции методом эхокардиографии (ЭКГ)

1. Индуцировать и поддерживать мышь под общим наркозом с 1,5-2% изофлурана и 800 мл/мин кислорода.
2. Поместите мышь в лежачее положение на нагретой сценической платформе и прикрепите лапы к проводам ЭКГ.
3. Побрейте грудь мыши.
4. Получение эхокардиографических изображений с помощью зонда линейного преобразователя 40 МГц и контактного геля и анализ с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
5. Выключите изофлуран и позвольте мыши восстановиться на нагревательной платформе перед возвращением клетки в активное состояние.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка эхокардиографии является неинвазивной и, таким образом, может быть выполнена продольно на протяжении всего эксперимента для определения изменений до и после коронарной перевязки.

3. Коллекция сердечной ткани для окрашивания фиброзом

1. Приносят в жертву мышей с вдыханием 100%_СО2 и тщательно рассекают сердце.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью ножниц и щипцов это достигается путем разрезания крупных сосудов, входящих (полая вена, легочная вена) и выходящих (легочная артерия, аорта) сердца для освобождения его из кровеносной системы в грудной полости.
2. Фиксируйте сердце в 10% формалине в течение не менее 24 ч.
3. Разрезайте образцы с помощью прямого лезвия бритвы через правый желудочек, межжелудочковую перегородку и левый желудочек, гарантируя, что разрез прошел через центр зоны инфаркта. Затем образцы отправляются в основной объект для встраивания парафина.
4. Вырежьте микротомом участки ткани толщиной 5 мкм и поместите их на стеклянные горки для окрашивания.
5. Депарафинизируйте с использованием коммерческих промывок ксилола и градуированного спирта (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) деионизированной водой, затем регидратируйте.
6. Окрашивание с 0,1% Sirius красным в пикриновой кислоте в течение 2 ч при комнатной температуре.
7. Промыть участки 0,5% уксусной кислоты в течение 3 мин и промыть 70% этанолом в течение 1 мин.
8. Обезвоживать участки, используя обратный порядок промывок, описанный в 3.4, с увеличением и градуированными концентрациями этанола, а затем ксилола.
9. Монтируйте участки тканей монтажным раствором (см. Таблицу материалов) для микроскопической оценки.

4. Проточная цитометрия промывания полости сердца и перикарда

1. Принесите в жертву мышей с вдыханием 100% CO₂ для эффекта.
2. Поместите мышь на спину и закрепите руки и ноги на хирургической доске с помощью ленты.
3. Осторожно откройте левую сторону (правую сторону с точки зрения экспериментатора) грудной полости, начав с разрезания диафрагмы примерно до средней точки и последующего разрезания наружных ребер в сторону грудины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прокалывания крупных кровеносных сосудов, особенно тех, которые проходят параллельно грудине.
4. Втягивайте ребра с помощью гемостата, чтобы обнажить подлежащее сердце и перикард.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перикард очень хрупкий, поэтому не ловите его ножницами во время резки.
5. С помощью трубки PE-10 (см. Таблицу материалов) катетер, вставленный в перикардиальное пространство вблизи соединения левого предсердия и левого желудочка, вводят 100 мкл стерильного физиологического раствора в полость перикарда.
   1. Дайте физиологическому раствору слиться и собраться с задней стороны сердца, стараясь не проколоть или не разорвать перикард в процессе. Повторите этот шаг дважды и поместите промывную жидкость на лед во время обработки сердца.
6. Иссечение сердца путем разрезания основных сосудов (аорты, легочной артерии, вены и полой вены), входящих и выходящих из сердца. Удалите правое и левое предсердия и взвесьте желудочковую сердечную ткань.
7. Измельчите ткань небольшими кусочками по 1 мм² с помощью ножниц и поместите в 10 мл буфера пищеварения, содержащего 450 Ед/мл коллагеназы I, 125 ЕД/мл коллагеназы XI, 60 Ед/мл ДНКазы I и 60 ЕД/мл гиалуронидазы в PBS в течение 1 ч при 37 °C на орбитальном шейкере.
8. Пропустите гомогенаты сердечной ткани через клеточный ситечко 70 мкм (см. Таблицу материалов) и открутите вниз при 60 х г в течение 5 мин при 4 °C для удаления сердечных паренхиматозных клеток.
9. Соберите супернатант, пройдите через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм (см. Таблицу материалов) для одноклеточной суспензии и вращайтесь вниз при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать клетки.
10. Выполняют блокирование фрагментарных кристаллизующихся (Fc) рецепторов и окрашивание клеточных маркеров на перикардиальных и сердечных клетках, как описано ранее⁸.
11. Запускайте образцы на проточном цитометре.

5. Маркировка перикардиального макрофага методом межреберного подхода к плевральному пространству (ICAPS)⁹

1. Стерилизуйте хирургические инструменты (с помощью стерилизатора бусин или автоклава) и распылите 70% этанола перед началом.
2. Индуцировать и поддерживать мышь под общим наркозом с 1,5-2% изофлурана и 800 мл/мин кислорода. Подтвердите анестезирующую плоскость, зажав пальцы ног и наблюдая за животным на предмет отсутствия рефлекса.
3. Вводят анальгетик подкожно (Бупренорфин 0,1 мг/кг).
4. Поместите мышь на нагретую хирургическую прокладку во время операции.
5. Побрейте правую переднебоковую грудную область.
6. Очистите хирургическую область этанолом и бетадином.
7. Сделайте разрез длиной 3 см в коже, а щипцами обнажите грудную клетку.
8. Загрузите 5 мкл флуоресцентных шариков (коммерчески доступные флуоресцентные микросферы, 1 мкм, см. Таблицу материалов) и 45 мкл физиологического раствора в шприцевой катетер PE-10 со скошенным наконечником.
9. Направьте катетер в межреберное пространство, как описано ранее⁹, медленно введите раствор бусины и удалите катетер одним движением.
10. Закройте кожу с помощью скобок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скобы используются вместо швов, чтобы свести к минимуму потенциальное повторное открытие разреза.
11. Выключите изофлуран, поместите мышь в клетку восстановления и следите за осложнениями в течение первых 24 ч.

Результаты

Эта модифицированная модель коронарного лигирования была оптимизирована для достижения воспроизводимости и выживания животных. Однако из-за значительной травмы, вызванной в сердце, некоторые ожидаемые интраоперационные и послеоперационные смерти связаны с процедурой. Стандартная ?...

Обсуждение

Индуцирование ИМ в закрытом перикарде у грызунов уникально и может иметь потенциально значительное применение. Процедура в значительной степени зависит от знакомства хирурга с моделью грызуна и анатомией сердца грызунов. Успех также зависит от ухода, оказываемого на трех критических...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Steri-350 Bead Sterilizer	Inotech	NC9449759
10% Formalin	Millipore Sigma	HT501128-4L
40 µm Cell strainer	VWR	CA21008-949	Falcon, 352340
70 µm Cell strainer	VWR	CA21008-952	Falcon, 352350
ACK Lysis Buffer	Thermo Fisher	A1049201
BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4"	CDMV Inc	108778
Betadine (10% povidone-iodine topical solution)	CDMV Inc	104826
Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11000-12
BNP Ophthalmic Ointment	CDMV Inc	17909
Castroviejo Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12061-01
Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
Collagenase I	Millipore Sigma	SCR103
Collagenase XI	Millipore Sigma	C7657
Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle	Medtronic Canada	GL-890
Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle	Medtronic Canada	SL-1659
Curved Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11009-13
Dako Mounting Medium	Agilen	CS70330-2
DNase I	Millipore Sigma	11284932001
Ethanol, 100%	Millipore Sigma	MFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle	Johnson & Johnson Inc.	2815G
Fiber-Optic Light	Nikon	2208502
Fine Forceps	Fine Science Tools	FST 11150-10
Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm	Polysciences, Inc.	15702
Geiger Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293	Model 150-ST
Hyaluronidase	Millipore Sigma	H4272
Isofluorane Vaporizer	Harvard Apparatus	75-0951
Isoflurane USP, 250 mL	CDMV Inc	108737
Magnetic Fixator Retraction System	Fine Science Tools	18200-20
MX550D- 40 MHz probe	Fujifilm- Visual Sonics
Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12002-12
PE-10 Tubing	Braintree Scienctific, Inc.	PE10 50 FT
Scissors	Fine Science Tools	FST 14184-09
SMZ-1B Stereo Microscope	Nikon	SMZ1-PS
VentElite Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	55-7040
Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine))	CDMV Inc	124918	controlled drug
Vevo 2100 Software	Fujifilm-Visual Sonics