Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este estudio detalla los factores cruciales a considerar en diseños experimentales que involucran ratas hembras. En un sentido más amplio, estos datos sirven para disminuir el estigma y ayudar en el desarrollo de herramientas de diagnóstico e intervención más inclusivas.

Resumen

La metodología actual establece un enfoque reproducible, estandarizado y rentable para monitorear el ciclo estral de las ratas adolescentes hembra Sprague Dawley (SD). Este estudio demuestra la complejidad de los ciclos hormonales y el amplio espectro de comprensión requerido para construir una técnica de monitoreo confiable y válida. A través de un examen en profundidad de los principales elementos de diseño experimental y procedimiento, esta descripción del ciclo y sus principios fundamentales proporciona un marco para una mayor comprensión y deconstruye conceptos erróneos para su futura replicación.

Junto con un esquema del proceso de recolección de muestras que emplea el lavado vaginal, el procedimiento describe el mecanismo de categorización de datos en el modelo de cuatro etapas de proestro, estro, metestro y diestro. Estas etapas se caracterizan por un nuevo enfoque propuesto, utilizando los 4 determinantes de categorización de la condición del fluido vaginal, tipo (s) de célula (s) presente, disposición celular y cantidad de células en el momento de la recolección. Las variaciones de cada etapa, las muestras favorables y desfavorables, la distinción entre ciclicidad y aciclicidad, y las representaciones gráficas de los componentes de categorización recopilados se presentan junto con prácticas interpretativas y organizativas efectivas de los datos. En general, estas herramientas permiten la publicación de rangos de datos cuantificables por primera vez, lo que lleva a la estandarización de los factores de categorización tras la replicación.

Introducción

Contribuciones novedosas
El ciclo estral de roedores ha sido identificado como un indicador esencial de bienestar. Sin embargo, los sesgos inconscientes de los investigadores y las interpretaciones inexactas con respecto al cuerpo femenino obstaculizan a la comunidad científica. La etimología misma de la palabra "estro" implica un sentido de inferioridad y negatividad. Eurípides usó el término para describir un "frenesí" o locura, Homero para describir el pánico y Platón para describir un impulso irracional. Este estudio destaca cómo estas perspectivas primigenias influyen en la comunidad científica actual y aborda estas preocupaciones a través de un nuevo paradigma de mosaico: una combinación actualizada de métodos previamente estudiados, ampliados en alcance para un enfoque más integral.

El estudio y el uso de esta técnica son necesarios, en primer lugar, ya que no existe una técnica de monitoreo estandarizada y completa, y las prácticas de interpretación de datos pueden no estar claras. En segundo lugar, aunque las características del ciclo estral dependen de las ratas individuales que se están estudiando, a menudo se universalizan. En tercer lugar, si bien los ciclos hormonales son procesos rutinarios y beneficiosos, están rodeados de estigmas peligrosos explorados en la sección "Traducción a humanos". Este estudio tiene como objetivo abordar estos tres problemas de tres maneras: (A) describiendo una técnica de monitoreo del ciclo estral en profundidad y aclarando cómo se pueden interpretar los resultados, (B) delineando métodos que mantienen la integridad e individualidad de cada ciclo, y (C) llamando la atención sobre conceptos erróneos que perpetúan prácticas sin fundamento.

Este estudio también es único en su enfoque en ratas adolescentes, un período marcado por cambios cruciales en el desarrollo que arrojan luz sobre diversas manifestaciones conductuales, anatómicas y fisiológicas en la edad adulta1. La construcción de un diseño experimental estandarizado para monitorear los ciclos hormonales en una población poco investigada mientras se deconstruyen los sesgos comunes permitirá el desarrollo de correlaciones hormonales confiables y válidas 2,3,4 y la determinación de interrupciones del ciclo dependientes de la condición 5,6,7,8,9,10 . En última instancia, estas novedades sirven para ampliar los criterios de diagnóstico, tratamientos e intervenciones de diversas preocupaciones de bienestar.

Definiciones y usos fundamentales
El ciclo estral es una colección de procesos fisiológicos dinámicos que ocurren en respuesta a las tres hormonas esteroides sexuales femeninas oscilantes: estradiol, hormona leuteinizante (LH) y progesterona (Figura 1A, B). Las interacciones entre el sistema endocrino y el sistema nervioso central regulan el ciclo, que con mayor frecuencia persiste durante 4-5 días y se repite desde el inicio de la maduración sexual hasta la senescencia reproductiva y / o el cese. Se divide en categorías separadas basadas en los niveles hormonales, más comúnmente en las 4 etapas de diestro (DIE), proestro (PRO), estro (EST) y metestro (MET), que progresan de manera circular. El número de divisiones puede variar de 3 etapas11 a 13 etapas12, dependiendo de la naturaleza del estudio13. El menor número de divisiones a menudo excluye el MET como una etapa y lo clasifica como un período de transición de corta duración. El número más alto generalmente incluye subsecciones que permiten una inspección más cercana de fenómenos como el desarrollo tumoral o el pseudoembarazo espontáneo, el estado fisiológico del embarazo sin implantación embrionaria 12,14,15.

En este estudio, las etapas se identificaron a través de componentes del canal vaginal, llamados los 3 determinantes de categorización: tipo(s) de célula(s) presente(s), disposición celular y cantidad de células (Figura 2A-D). Si bien la condición del fluido vaginal no se monitoreó en este estudio, se recomienda incluirlo como un cuarto componente de categorización. Se puede encontrar más información sobre el examen del fluido vaginal en la lista dereferencias 16. Los componentes de categorización se pueden examinar mediante la extracción de células a través del lavado vaginal, la técnica principal recomendada en el monitoreo del ciclo estral moderno. Si bien los procesos fisiológicos en profundidad dentro de cada etapa están fuera del alcance de este estudio, se puede encontrar más información en la literatura17.

El uso y desarrollo continuo de esta técnica de monitoreo del ciclo estral se basa en las conexiones entre las hormonas esteroides sexuales y la función de los sistemas corporales como el sistema cardiovascular18, el sistema endocrino8 y el sistema nervioso central 19,20,21. Al mismo tiempo, el monitoreo del ciclo estral puede no ser siempre necesario cuando los roedores hembra están involucrados 22,23,24,25. Más bien, es importante considerar primero si se han reportado diferencias de sexo en el área específica de estudio, que pueden explorarse más a fondo en las revisiones publicadas22,23. Aunque el monitoreo del ciclo estral es vital en un amplio espectro de investigaciones de investigación, no debe verse como un obstáculo para incluir roedores hembra en los experimentos. Si bien esta técnica puede parecer compleja y llevar mucho tiempo, el procedimiento en sí puede tardar menos de 15 minutos en completarse, dependiendo del investigador, y es rentable. En general, la inclusión de roedores hembra en estudios científicos es ventajosa para la comprensión de los sistemas corporales, diversas afecciones y patologías, y el bienestar general, ya que estos desarrollos se han basado principalmente en la plantilla corporal masculina.

Parámetros universales y variabilidades naturales en el roedor
El establecimiento de rangos para aspectos vistos como "típicos" es necesario para definir patrones de ciclo estándar, establecer parámetros con fines comparativos y analíticos, y detectar anomalías y valores atípicos. Al mismo tiempo, también es importante reconocer que el ciclo de cada rata es único, y se esperan desviaciones basadas en la tensión animal, los procesos fisiológicos y las condiciones ambientales. De hecho, uno de los aspectos más "normales" del ciclo estral es la variabilidad. Esto se ve en la duración total del ciclo, con un rango de 3-38 días 26,27; la edad de maduración sexual que puede variar de 32-34 días a múltiples semanas 28,29,30; lo que se considera acíclico11, y los patrones determinantes de categorización 11,13. En general, no existe una plantilla universal para el ciclo estral, y traducir eso tanto a la comunidad científica como al público en general es una parte importante del proceso experimental.

Puntos de tiempo experimentales y edad de desarrollo
Reconocer este principio de variabilidad ayuda a construir un diseño experimental confiable y válido. Por ejemplo, el inicio del monitoreo del ciclo estral se basa en el desarrollo anatómico y fisiológico de las ratas, que varía según los factores ambientales y fisiológicos. El monitoreo no puede comenzar hasta el desarrollo de la abertura vaginal (VO), que es el orificio vaginal externo rodeado por la vulva que conduce a la porción interior del canal vaginal (Figura 3A-D). Si bien el VO a menudo se desarrolla completamente entre las edades de 32 y 34 días, permanece individualizado para cada sujeto, y mucho sobre el proceso sigue siendo desconocido. Esta abertura se ha utilizado para identificar el inicio de la maduración sexual, que se ha relacionado con el aumento del estradiol31, la maduración del eje hipotalámico-hipofisario-ovárico32 y la primera ovulación en ratas 17,33,34,35. Sin embargo, publicaciones recientes han encontrado que es solo un marcador indirecto del desarrollo reproductivo, ya que puede desacoplarse de las ocurrencias hormonales y de desarrollo en ambientes desfavorables31 y puede representar cambios en los niveles de estradiol en lugar de la maduración sexual33. Por lo tanto, se recomienda no confiar únicamente en el VO para determinar la edad de desarrollo y como calificador para el monitoreo del ciclo estral36, sino también utilizar la aparición de la primera etapa EST y la cornificación de las células epiteliales30 para marcar el inicio de la maduración sexual.

El peso corporal se correlaciona notablemente con la edad de desarrollo durante el período adolescente en roedores30,37 y, por lo tanto, también puede ayudar a determinar la edad de desarrollo en este período. Los mecanismos propuestos relacionados con este fenómeno incluyen la estimulación de hormonas necesarias para el desarrollo reproductivo, como la hormona del crecimiento, y la inhibición del eje suprarrenal hipotalámico-hipofisario (HPA) por el regulador del apetito, la leptina30. Sin embargo, no se recomienda utilizar esta medida como el único indicador de la edad de desarrollo debido a la gran varianza observada entre las ratas entre las especies y los proveedores de proveedores38. La variabilidad observada en el desarrollo de la VO y el peso corporal ejemplifican la importancia del concepto en el proceso experimental general.

Traducción a humanos: contextos culturales y científicos
La relación traslacional de los estudios reproductivos de animales a humanos es bidireccional. Los resultados de estudios basados en animales influyen en cómo se evalúan, abordan y analizan los procesos humanos39. La percepción del sistema reproductivo humano y sus procesos relacionados influyen en cómo se estudian los animales. De hecho, una de las indicaciones más fuertes para futuras investigaciones en esta área proviene de creencias socioculturales sesgadas relacionadas con los ciclos hormonales que influyen en el proceso científico. Muchas de estas convenciones se derivan de una aversión cultural general a discutir la menstruación, lo que ha llevado a una brecha de datos en el conocimiento bien fundamentado40,41. Esto tiene un espectro de consecuencias que van desde menores hasta letales, desde la altura de las estanterías y el tamaño del teléfono inteligente hasta el ajuste de la armadura corporal de la policía y los diagnósticos de cáncer perdidos42.

La descripción de la menstruación como insalubre, destructiva y tóxica, vista en textos venerados, medios de comunicación, diccionarios y enseñanzas médicas, se conserva en publicaciones científicas. Esto ocurre a través de descripciones inexactas y sesgadas de los ciclos hormonales, el aislamiento del sistema reproductivo de sus contrapartes neuroendocrinas e influencias ambientales, y la perspectiva reduccionista de la finalización de un ciclo como un "fracaso en la concepción"43,44. Esto conduce a la creación de prácticas experimentales poco sólidas, como la omisión de variables externas que influyen en los ciclos hormonales, la determinación de los inicios y puntos finales basados únicamente en los desarrollos anatómicos y la medición del avance del ciclo de una manera lineal en lugar de circular. A pesar de la correlación directa entre los factores socioculturales y las consecuencias biológicas, a menudo no se considera en la literatura científica. A través de la inspección de publicaciones más holísticas 43,44,45, los investigadores pueden deconstruir estos estigmas y crear diseños experimentales más confiables y válidos.

Protocolo

Todos los métodos de manejo y procedimiento descritos en este protocolo se alinean con las pautas de cuidado y uso de animales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pepperdine y el Comité de Investigación Animal (ARC) del Canciller de UCLA.

1. Cuidado y uso de animales

  1. Adquirir ratas hembra, en número según el análisis de potencia, y ratas macho para promover el efecto Whitten o ciclos más consistentes46. Determinar la cepa en base al objetivo del estudio en bases de datos conocidas47.
    NOTA: Los datos actuales reflejan los de las hembras adolescentes del Programa Internacional de Normalización Genética (IGS) SD en presencia de ratas SD macho ubicadas en los laboratorios de la Universidad de Pepperdine y UCLA como parte de un estudio colaborativo. Estas ratas llegaron en grupos separados a los 28 días de edad, y la progresión del ciclo estral se monitoreó durante 10 o 20 días para demostrar diferencias en los niveles agudos y crónicos, comenzando a los 34 días de edad (después de un período de aclimatación de 7 días).
  2. Antes de la manipulación, permita una cuarentena y / o un período de aclimatación para la estabilización fisiológica después del transporte y el ajuste al nuevo entorno.
    NOTA: Se ha citado un período mínimo de 3 días, con un período de 7 días recomendado 48,49,50,51,52. En general, esto depende de las condiciones de transporte, la tensión animal y los objetivos del estudio.
  3. Asegúrese de que el estrés se reduzca con el uso de un período de aclimatación, ya que el estrés puede interrumpir el funcionamiento adecuado del sistema reproductivo53. Sin embargo, no compense en exceso al intentar eliminarlo, ya que una cantidad moderada de estrés es beneficiosa para el bienestar de los animales51.
  4. Ratas anfitrionas en un ambiente de temperatura (68-79 ° F, es decir, 20-26 ° C) y humedad controlada (30-70%) contactando al vivero o a los gerentes de laboratorio y asegurando estas características. Distribuya agua y chow ad libitum con los componentes nutritivos que figuran en el sitio web de la compañía y la limpieza de jaulas una vez a la semana.
    NOTA: En este estudio, las ratas fueron alojadas en grupos de 2 separados por sexo en jaulas de plástico transparente reutilizables de 19" x 10" x 8" y tuvieron acceso a ropa de cama de mazorca de maíz que se cambiaba una vez a la semana. La temperatura se mantuvo a 70 ° F y la humedad al 35-79%, con un promedio del 62%.
  5. Verifique el desarrollo de necrosis isquémica o de cola anular de la cola y los dedos de los pies para detectar evidencia de bajos niveles de humedad relativa y temperaturas extremas, que pueden causar la alternancia de respuestas biológicas.
    NOTA: La temperatura y la humedad son importantes para el sistema reproductivo, la maduración sexual y la ciclicidad estral 54,55,56,57,58.
  6. Asegure una iluminación adecuada y equilibrada en todo el espacio de la carcasa depositando cantidades iguales de fuentes de luz en todo el espacio del laboratorio que actúan sobre un sistema de luz:oscuridad controlado por el tiempo.
    NOTA: Aquí, un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h, con luces encendidas de 06:00 a 18:00 h, fue controlado por bombillas LED lineales de 2.550 lúmenes.
  7. Siga los requisitos de lux proporcionados52 en función de las variaciones de la pigmentación, la edad, la cepa, el sexo y el estado hormonal de los animales.
    NOTA: Cuando los investigadores categorizan las muestras celulares recolectadas, la iluminación consistente permitirá una detección visual adecuada y una estadificación confiable59. La duración e intensidad de la luz están directamente relacionadas con el sistema reproductivo, la maduración sexual y el ciclo estral 54,55,56,57,60,61.

2. Preparación de equipos y experimentos

  1. Revise los determinantes de categorización (vistos en la Figura 2A): cómo identificar cada etapa del ciclo estral y cómo operar el microscopio y el equipo de la cámara.
  2. Asegúrese de que cada sujeto a ser monitoreado haya alcanzado la maduración sexual y muestre indicadores apropiados de desarrollo: VO, peso corporal y edad. Pese las ratas y examínelas en busca de VO entre las mismas horas todos los días para obtener comparaciones precisas y transfiéralas con un método de manejo aprobado. Consulte al veterinario afiliado a la universidad si un animal pierde más del 20% de su peso corporal anterior.
    NOTA: El VO permanece caudal a la abertura uretral y craneal al ano, ubicado entre los dos, como se muestra en la Figura 3.
  3. Como estos factores dependen de la tensión, consulte con el proveedor las especificaciones y considere los factores ambientales específicos del laboratorio62.
    NOTA: En general, esto ocurrirá entre los 32-34 días de edad y un peso corporal promedio que oscila entre 75-150 gramos63 para ratas SD y está indicado por una abertura de forma circular previamente cubierta por una vaina membranosa.
  4. Seleccione un período de recolección de muestras apropiado para el grupo de ratas que se está monitoreando para evitar la recolección de muestras de transición. Primero, muestree algunos animales en 2 o 3 puntos de tiempo diferentes a lo largo del día para determinar el momento en que están presentes la mayoría de las etapas del ciclo (por ejemplo, muestreo a las 12:00 horas, 13:00 horas y 14:00 horas para diferentes animales). Complete el lavado vaginal a la misma hora todos los días para una estadificación consistente y confiable.
    NOTA: Se ha informado que las horas entre las 12:00 y las 14:00 h son las mejores para capturar todas las etapas. En este estudio, el monitoreo del ciclo estral ocurrió entre las 12:00 y las 14:00 h, manejado con la retención de estilo de compresión (ver paso 3.4). La importancia del tiempo de monitoreo del ciclo estral en relación con otras intervenciones experimentales (por ejemplo, acondicionamiento conductual, medicación) es un área de investigación en desarrollo y se puede explorar más a fondo11. La determinación de la duración del monitoreo del ciclo estral depende del estudio y puede explorarse más a fondo en estudios publicados11,33.
  5. Retire la cubierta protectora del microscopio y conecte la cámara a la computadora quitando la cubierta protectora de la lente de la cámara y colocando la lente sobre el ocular del microscopio.
  6. Luego, abra el software preseleccionado en la computadora. Para utilizar el software seleccionado en este estudio, seleccione la cámara conectada al USB ubicada en el lado izquierdo de la pantalla, debajo de la pestaña etiquetada Lista de cámaras. Asegúrese de que la cámara USB esté conectada correctamente a la computadora, que leerá Sin dispositivo en la pestaña etiquetada Lista de cámaras, si no es así.
  7. Una vez que se haya seleccionado la cámara USB debajo de la pestaña, encienda el interruptor de luz del microscopio ubicado en la base.
  8. Cree una carpeta en el equipo designada para las fotos de ejemplo de celda. Cree una carpeta de archivos para cada día separado en que se recopilen los datos, preparados previamente antes de tomar las imágenes.
  9. Con el equipo preparado, recupere la jaula del sujeto de su lugar de retención y llévela a la estación de recolección de muestras.

3. Recolección de células vaginales

  1. Recupere una jeringa desechable y llene cada una de las jeringas con 0,2 ml de NaCl estéril al 0,9%. Si hay burbujas de aire, mueva suavemente la jeringa del barril hasta que todas las burbujas de aire hayan alcanzado la punta abierta de la jeringa y expulse el aire. Si todavía hay burbujas de aire presentes, expulse la solución de nuevo en el receptáculo de NaCl y vuelva a llenarla hasta que no haya ninguna.
    NOTA: El movimiento excesivo puede resultar en la formación de más burbujas de aire.
  2. Devuelva cada jeringa a la envoltura de plástico para mantener un campo estéril, con la punta de la jeringa dentro de la parte sellada de la envoltura.
  3. Abra la jaula y levante suavemente al sujeto por la base de la cola o el tronco del cuerpo, cerrando la tapa de la jaula para evitar que otros salgan. Seleccione un método de retención de los que se enumeran a continuación en función de las preferencias personales y la respuesta del animal.
  4. Use la sujeción de estilo de compresión para ratas adolescentes colocando al sujeto contra la región superior del pecho, con la nariz del sujeto apuntando hacia el suelo. Antes de comenzar el hisopo, asegúrese de que el sujeto esté lo suficientemente comprimido como para evitar el movimiento, pero que sea cómodo y seguro en la bodega. Exponga el canal vaginal del sujeto flexionando suavemente la cola antes de insertar la jeringa.
  5. Use el levantamiento de patas traseras para ratas adultas colocando las patas delanteras del animal en la parte superior o lateral de la jaula, mientras que la cola y las extremidades posteriores se sujetan con una sujeción suave entre el primer y segundo dedo, dejando el pulgar libre para operar la jeringa64.
  6. Permita que los animales se aclimaten al manejo y monitoreo. Maneje a los animales con suavidad pero de forma segura para reducir el exceso de estrés y proteger al investigador de agresiones como morder.
    NOTA: Los primeros días de monitoreo pueden no producir los resultados deseados a medida que los animales se aclimatan a sus condiciones. El manejo de los animales para recoger el peso corporal durante el período de aclimatación puede ayudar a esta transición33.
  7. Mientras mantiene la jeringa firme con el dedo índice y el dedo medio, inserte la punta de la jeringa (no más de 2 mm) en un ángulo paralelo al canal vaginal. Expulse lentamente el NaCl hacia el canal empujando el émbolo hacia adentro. No inserte la jeringa más en el canal, ya que hacerlo puede interrumpir el ciclo estral.
  8. Extraiga el NaCl del canal vaginal tirando del émbolo de la jeringa lejos del revestimiento epitelial (hacia arriba). Si hay dificultad para mantener al sujeto en la bodega durante este proceso, colóquelo de nuevo en la jaula durante un corto período de descanso antes de intentar la extracción de NaCl.
  9. Una vez que se haya recolectado la muestra celular, coloque al sujeto de nuevo en la jaula y repita este procedimiento para cada animal antes de que todas las muestras se evalúen bajo el microscopio.
    NOTA: Alternativamente, cada muestra puede ser recolectada y evaluada antes de pasar al siguiente animal. Un animal puede requerir un segundo lavado si la muestra no se puede clasificar. La misma jeringa de la colección inicial se puede reutilizar si no entra en contacto con la solución salina directamente en el recipiente y solo para el mismo animal.

4. Evaluación de la muestra

  1. Comience la categorización examinando la muestra de fluido vaginal extraída. Registre la viscosidad como viscosa o no viscosa y la coloración como opaca o transparente en el documento de descripción u otro sistema de registro.
    NOTA: Esta sección del protocolo se puede realizar en el momento de la recolección de muestras o más tarde.
  2. Expulse 2-3 gotas del líquido en un portaobjetos de microscopio y coloque un vidrio de cubierta de microscopio en la parte superior del portaobjetos. Coloque el vidrio de la cubierta en el portaobjetos del microscopio desde la parte superior del portaobjetos hasta la parte inferior o de un lado del portaobjetos al otro para evitar la formación de burbujas de aire. Si es posible, deje aproximadamente la mitad de la muestra recolectada en la jeringa si se requiere un examen adicional y para evitar que se coloque una cantidad excesiva de líquido en el portaobjetos.
  3. Localice las células recolectadas moviendo el portaobjetos del microscopio a través del escenario. Si hay muy pocas células o una gran cantidad de escombros, expulse el líquido restante a un nuevo portaobjetos y vuelva a examinarlo. Si la cantidad de muestra que queda en la jeringa es insuficiente, o si la segunda gota presenta problemas similares, recoja otra muestra del sujeto antes de intentar identificar la etapa del ciclo estral.
  4. Una vez que las celdas hayan sido localizadas y antes de tocar la computadora o el teclado de la computadora, retire el guante para evitar ensuciar el teclado.
  5. Adquiera imágenes de las muestras de celdas haciendo clic en la función etiquetada Snap en el lado izquierdo del panel de software.
  6. Luego, guarde el archivo haciendo clic en Guardar como debajo del icono Archivo en la esquina superior izquierda de la página. Guarde la foto en una carpeta preetiquetada en la computadora.
    NOTA: Plantilla de etiqueta de ejemplo: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective lente utilizada.
  7. Tome más de una foto en cada lente objetivo si no hay muchas celdas dentro de cada marco.
    NOTA: Etiquetas de ejemplo para varias imágenes: #1_01/09/2021_EST_4x1 y #1_01/09/2021_EST_4x2.
  8. Repita el procedimiento para cada muestra recolectada bajo lentes de objetivos múltiples. Incluya al menos una objetivación más pequeña, como 4x, y al menos una objetivación más grande, como 20x.
  9. Cargue las imágenes en una unidad / carpeta compartida o en un disco duro externo para que todos los investigadores involucrados tengan acceso a los archivos y haya copias de seguridad disponibles.

5. Categorización de etapas

  1. Configure la pantalla de la computadora para ver simultáneamente las fotos tomadas y la hoja de grabación (Figura 4A-C).
    NOTA: Esto permitirá que la documentación se produzca mientras se visualiza la muestra recopilada. Esta parte del protocolo se puede completar en el momento de la recolección de muestras o más tarde.
  2. Determine qué tipos de celdas están presentes en la muestra. Seleccione entre las cuatro opciones enumeradas en los pasos 5.2.1-5.2.4 utilizando los criterios y registre los hallazgos.
    1. Células epiteliales queratinizadas anucleadas (AKE)/epiteliales cornificadas
      1. Busque células dentadas o de bordes angulares, como se ve en la Figura 2B y la Figura 5C, que a pesar de la falta de núcleos, pueden mostrar áreas redondas ligeras (fantasmas nucleares) dentro de la célula que representan dónde una vez estuvo presente un núcleo. Use un aumento más alto, como 20x y superior, para diferenciar entre tales células nucleadas y anucleadas.
      2. Use un aumento más alto para distinguir la porción queratinizada o cornificada de la célula, una capa delgada de células que carecen de núcleos y llenas de queratina, si lo desea.
        NOTA: Además de su apariencia irregular, estos también se pueden distinguir por cómo pueden plegarse o desmontarse, creando estructuras dentadas y alargadas conocidas como barras de queratina.
    2. Células epiteliales nucleadas grandes (LNE)
      1. Busque estas células típicamente redondas a poligonales encerradas por bordes irregulares, irregulares o angulares.
      2. Observe cómo sus núcleos pueden tomar diversas formas, que van desde intactas hasta degeneradas o picónicas, relacionadas con la condensación irreversible de cromatina en el núcleo de una célula que sufre muerte o deterioro, como se ve en la Figura 2B y la Figura 5D1,2. Tome nota de cómo estos núcleos ocupan menos espacio que el citoplasma dentro de la célula, con una relación nuclear a citoplasmática (N: C) más baja que las células epiteliales pequeñas. Esté atento a los gránulos citoplasmáticos que se pueden ver a aumentos más altos13.
    3. Leucocitos (LEU)/neutrófilos/células polimorfonucleares
      1. Busque estas células compactas y esféricas con núcleos multilobulados (por lo tanto, conocidas como células polimorfonucleares), que desaparecen a medida que la célula madura (Figura 2B y Figura 5A). Se puede usar un aumento más alto (por ejemplo, 40x) para observar los núcleos multilobulados.
        NOTA: Tras la recolección y preparación, estas células pueden condensarse, plegarse o romperse.
    4. Células epiteliales nucleadas pequeñas (SNE)
      1. Esté atento a estas células de forma redonda a ovalada que son más grandes que los neutrófilos descritos anteriormente.
      2. Observe los núcleos redondos de estas células epiteliales no queratinizadas (Figura 2B), que ocupan una mayor cantidad de espacio que el citoplasma dentro de la célula, creando una mayor proporción de N: C en relación con las células epiteliales grandes.
        NOTA: Tras la recolección y preparación, estas celdas pueden plegarse o superponerse para crear una forma que se asemeje a una cadena o barra, como se muestra en la Figura 5B1.
  3. Examine cómo se organizan las celdas presentes en la muestra para cada objetivación. Utilice la objetivación inferior, como 4x, para ver una vista representativa de la disposición general de las celdas. Registre si las células están agrupadas juntas (C), dispersas uniformemente (ED) o dispersas aleatoriamente (RD) (consulte la Figura 4C), y observe la organización específica de cada tipo de célula (por ejemplo, las células epiteliales nucleadas pequeñas se agrupan y los neutrófilos se distribuyen uniformemente).
  4. A continuación, estime visualmente y registre la cantidad total de células (una pizca, moderada, numerosa) y las cantidades de células individuales (porcentaje de cada tipo de célula presente).
    NOTA: Un smidge representa el número más pequeño de celdas presentes que se pueden utilizar para determinar la categorización de la muestra, numeroso representa la presencia de un número incontable de celdas que representan la mayoría, si no todo, del espacio en la diapositiva o están apiladas una encima de la otra, y un número moderado de celdas representa un número comparativamente promedio de celdas (ejemplos vistos en la Figura 5A-D y la Figura 6A-D).
  5. Tenga en cuenta si hay alguna desviación de los criterios enumerados o de los aspectos que son típicos para el tema específico en la categoría de "anomalías" y consulte con un veterinario si es necesario.
  6. Determine qué etapa del ciclo estral se presenta en la muestra utilizando los componentes de categorización y las descripciones a continuación.
    1. Morir
      1. Busque LEU como el tipo de célula dominante o único presente, dispuesto de manera agrupada al comienzo de DIE pero más disperso en las últimas etapas.
        NOTA: Durante la transición a DIE, la cantidad de células puede disminuir a medida que las células epiteliales comienzan a descomponerse, como se ve en la Figura 6D1. Al mismo tiempo, el número de LEU comienza a aumentar, y tienden a organizarse de manera agrupada inicialmente y dispersarse con el tiempo.
      2. Tenga en cuenta que la cantidad total de células puede ser comparativamente baja, con mayor frecuencia en las últimas etapas del período DIE, en el segundo o tercer día.
      3. Observe la alta cantidad de moco que puede estar presente en esta etapa, que se presenta como hebras concentradas de LEU (Figura 5A1). Esté atento a los pequeños grupos o hebras celulares de células SNE que acompañan a las LEU durante las fases tardías de la transición a PRO (Figura 5A1,2).
      4. Observe la apariencia viscosa y opaca del fluido vaginal cuando se realiza la transición, la transición completa y la transición fuera de DIE.
        NOTA: La duración media de esta etapa es de 48 h durante un ciclo de 4 días y posiblemente de 72 h durante un ciclo de 5 días.
    2. Pro
      1. Busque células SNE como las células dominantes y células LEUs, LNE y / o AKE que se pueden ver en números bajos. Utilice una alta objetivación para observar la apariencia granular de las células SNE que normalmente están dispuestas en grupos, hojas o hebras durante esta etapa (Figura 5B1,2).
      2. Observe la apariencia viscosa y opaca del fluido vaginal al pasar de DIE a PRO, y cómo se vuelve no visual y transparente una vez que pasa completamente a la etapa PRO (duración promedio de 14 h en ratas).
    3. Est
      1. Busque el dominio de las células AKE, una disminución de las células SNE en EST y un aumento en el número y tamaño de las células a medida que EST continúa11,13.
      2. Tome nota de la característica distintiva de la disposición a menudo agrupada de las células AKE, en forma de barras de queratina o que contienen núcleos fantasmas, que pueden dispersarse más aleatoriamente en la transición de PRO (Figura 6B) a MET (Figura 6C).
      3. Observe el fluido vaginal no visual y transparente característico, que se puede esperar a medida que las ratas están en transición, completamente en transición y fuera de EST.
        NOTA: La progresión de EST incluye mucha diversificación (Figura 5C y Figura 6B, C). La etapa generalmente ocurre durante un promedio de 24 h en un ciclo de 4 días o posiblemente 48 h en un ciclo de 5 días.
    4. Conocido
      1. Busque un mayor número de células SNE y LNE a medida que la rata está haciendo la transición a MET, ya sea dominante en términos de proporción celular dentro del canal o cerca de la misma proporción a las LEU11,13. Además, tome nota de la mayor cantidad de desechos en MET y las transiciones que en otras etapas debido a la desintegración de las células epiteliales después de EST y pasando a DIE.
      2. Observe la falta de disposición consistente ya que se ven todos los tipos de células y en varias cantidades (Figura 5D1-3). Sin embargo, busque las LEU que están empaquetadas o agrupadas cerca de las células epiteliales en las etapas iniciales que pueden volver a la disposición agrupada cuando se hace la transición a DIE.
      3. Observe la apariencia no visual y transparente del fluido vaginal en esta etapa y el cambio a una apariencia más viscosa y opaca mientras se mueve hacia DIE.
        NOTA: La duración media de esta etapa es de 6-8 h.
  7. Etiquete las muestras en transiciones con la etapa hacia la que se mueve el sujeto, con la transición entre paréntesis para rastrear cuándo se recolectan. Se puede encontrar más información sobre cómo distinguir entre estas 4 etapas y sus transiciones en los Resultados Representativos.
    NOTA: Como las muestras recogidas son estáticas y el ciclo es dinámico, las diapositivas pueden representar transiciones entre etapas (véase en la Figura 6A-D).
  8. Complete este proceso para cada animal hasta que se complete la fase de monitoreo.
  9. En el día 11 (45 días de edad) o 21 (55 días de edad), eutanasiar a las ratas con 5% de isoflurano y 2% de oxígeno antes de una decapitación de guillotina. Estos puntos de tiempo pueden variar dependiendo de la naturaleza del estudio.

Resultados

Los datos actuales reflejan los de las hembras adolescentes del Programa Internacional de Normalización Genética (IGS) SD en presencia de ratas SD macho. Estos animales fueron localizados en los laboratorios de la Universidad de Pepperdine y ucla como parte de un estudio colaborativo. La Figura 5 presenta múltiples variaciones de las 4 etapas del ciclo. La Figura 5A1 se identificó como una muestra de diestro con varios tipos de células pres...

Discusión

Pasos clave y consideraciones importantes
Ciertos pasos críticos en el protocolo proporcionado requieren énfasis, especialmente dentro de la recolección de células vaginales. Durante la extracción de líquido vaginal, garantizar el ángulo y la profundidad adecuados de la inserción de la jeringa es clave para producir resultados satisfactorios y, en última instancia, prevenir la irritación, lesiones o estimulación cervical del animal. La estimulación del cuello uterino puede ser una fuente d...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este estudio se realizó a través de una colaboración financiada por los NIH entre el Centro de Investigación de Lesiones Cerebrales de la Universidad de California en Los Ángeles (BIRC).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB CameraAmScopePart Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV&
keywords=usb+camera+for+microscope&
qid=1572477663&s=industrial
&sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short BevelFischer Scientific14-815-526https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8NEWCO93009https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glassFischer Scientific12-553-7Ahttps://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover GlassesFischer Scientific12-553-464https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-PlyFischer Scientific06-666https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001 NEWCO Specialty and LabDiet5012https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lmGrainger36UX10https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_
LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7
zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4
cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696
!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id=
CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW
1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ
Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo
Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc=
PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%Live Action SafetyABB079830939https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH SuppliesBH SuppliesASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7&
keywords=1ml+sterile+syringe&qid=
1572478649&s=industrial
&sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa=
ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy
PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm
VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ
yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy
eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM
0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h
bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja
1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2
xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimenAllentownLV40326013https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable UnderpadMedlineEAN: 0480196288558
 Global Trade Identification Number: 40080196288558		https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853&
sr=8-4

Referencias

  1. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell and Tissue Research. 354 (1), 99-106 (2013).
  2. Camacho-Arroyo, I., Montor, J. M. Beyond reproductive effects of sex steroids. MiniReviews in Medicinal Chemistry. 12 (11), 1037-1039 (2012).
  3. Shah, S. I. A. Systemic non-reproductive effects of sex steroids in adult males and females. Human Physiology. 44, 83-87 (2018).
  4. Wierman, M. E. Sex steroid effects at target tissues: mechanisms of action. Advances in Physiology Education. 31 (1), 26-33 (2007).
  5. An, G., et al. Pathophysiological changes in female rats with estrous cycle disorder induced by long-term heat stress. BioMed Research International. 2020, 4701563 (2020).
  6. Donato, J., et al. The ventral premammillary nucleus links fasting-induced changes in leptin levels and coordinated luteinizing hormone secretion. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5240-5250 (2009).
  7. Fortress, A. M., Avcu, P., Wagner, A. K., Dixon, C. E., Pang, K. Experimental traumatic brain injury results in estrous cycle disruption, neurobehavioral deficits, and impaired GSK3β/β-catenin signaling in female rats. Experimental Neurology. 315, 42-51 (2019).
  8. Hatsuta, M., et al. Effects of hypothyroidism on the estrous cycle and reproductive hormones in mature female rats. European Journal of Pharmacology. 486 (3), 343-348 (2004).
  9. Jaini, R., Altuntas, C. Z., Loya, M. G., Tuohy, V. K. Disruption of estrous cycle homeostasis in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 279, 71-74 (2015).
  10. Tropp, J., Markus, E. J. Effects of mild food deprivation on the estrous cycle of rats. Physiology and Behavior. 73 (4), 553-559 (2001).
  11. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Research. Part B, Developmental and Reproductive Toxicology. 80 (2), 84-97 (2007).
  12. Thung, P. J., Boot, L. M., Muhlbock, O. Senile changes in the oestrous cycle and in ovarian structure in some inbred strains of mice. Acta Endocrinologica. 23 (1), 8-32 (1956).
  13. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  14. . Biochemical and endocrinological studies of normal and neoplastic tissue: The metabolism of estrogen-producing ovarian tumors and other malignancies in the mouse Available from: https://www.translatetheweb.com/?from=nl&to=en&ref=SERP&dl=en&rr=UC&a=https%3a%2f%2frepository.tudelft.nl%2fislandora%2fobject%2fuuid%253A8776d58a-6695-4a38-99ca-0abf607480f0 (2021)
  15. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta Physiologica Pharmacologica Neerlandica. 4 (3), 442-444 (1955).
  16. Paccola, C., Resende, C., Stumpp, T., Miraglia, S., Cipriano, I. The rat estrous cycle revisited: a quantitative and qualitative analysis. Animal Reproduction. 10 (4), 677-683 (2013).
  17. Ojeda, S. R., Urbanski, H. F., Knobil, E., Neill, J. D. Puberty in the rat. The Physiology of Reproduction. , 363-409 (1994).
  18. Schallmayer, S., Hughes, B. M. Impact of oral contraception and neuroticism on cardiovascular stress reactivity across the menstrual cycle. Psychology, Health & Medicine. 15 (1), 105-115 (2010).
  19. Barreto-Cordero, L. M., et al. Cyclic changes and actions of progesterone andallopregnanolone on cognition and hippocampal basal (stratum oriens) dendritic spinesof female rats. Behavioural Brain Research. 379, 112355 (2020).
  20. de Zambotti, M., Trinder, J., Colrain, I. M., Baker, F. C. Menstrual cycle-related variation in autonomic nervous system functioning in women in the early menopausal transition with and without insomnia disorder. Psychoneuroendocrinology. 75, 44-51 (2017).
  21. Maghool, F., Khaksari, M., Khachki, A. S. Differences in brain edema and intracranial pressure following traumatic brain injury across the estrous cycle: Involvement of female sex steroid hormones. Brain Research. 1497, 61-72 (2013).
  22. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex as a biological variable: Who, what, when, why, and how. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 386-396 (2017).
  23. Becker, J. B., Prendergast, B. J., Liang, J. W. Female rats are not more variable than male rats: a meta-analysis of neuroscience studies. Biology of Sex Differences. 7, 34 (2016).
  24. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  25. Joel, D., McCarthy, M. M. Incorporating sex as a biological variable in neuropsychiatric research: where are we now and where should we be. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 379-385 (2017).
  26. Long, J. A., Evans, H. M. The oestrous cycle in the rat and its associated phenomena. Memoirs of the University of California. 6, 1 (1922).
  27. Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: A practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
  28. Lenschow, C., Sigl-Glöckner, J., Brecht, M. Development of rat female genital cortex and control of female puberty by sexual touch. PLoS Biology. 15 (9), 2001283 (2017).
  29. Lewis, E. M., Barnett, J. F., Freshwater, L., Hoberman, A. M., Christian, M. S. Sexual maturation data for Crl Sprague-Dawley rats: Criteria and confounding factors. Drug and Chemistry Toxicology. 25 (4), 437-458 (2002).
  30. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 24 (4), 417-463 (2000).
  31. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: the puberty ovarian maturation score (pub-score). Scientific Reports. 7, 46381 (2017).
  32. da Silva Faria, T., da Fonte Ramos, C., Sampaio, F. J. Puberty onset in the female offspring of rats submitted to protein or energy restricted diet during lactation. Journal of Nutritional Biochemistry. 15 (2), 123-127 (2004).
  33. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. 48 (1), 1 (2009).
  34. Engelbregt, M. J., et al. Delayed first cycle in intrauterine growth-retarded and postnatally undernourished female rats: follicular growth and ovulation after stimulation with pregnant mare serum gonadotropin at first cycle. Journal of Endocrinology. 173 (2), 297-304 (2002).
  35. Pescovitz, O. H., Walvoord, E. C. . When puberty is precocious: Scientific and clinical aspects. , (2007).
  36. . Standard Evaluation Procedure Test Guidelines 890.1450: Pubertal development and thyroid function in intact juvenile/peripubertal female rats assay Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/final_890.1450_female_pubertal_assay_sep_8.24.11.pdf (2011)
  37. Kennedy, G. G., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. Journal of Physiology. 166 (2), 408-418 (1963).
  38. Sengupta, S., Arshad, M., Sharma, S., Dubey, M., Singh, M. M. Attainment of peak bone mass and bone turnover rate in relation to estrous cycle, pregnancy and lactation in colony-bred Sprague-Dawley rats: Suitability for studies on pathophysiology of bone and therapeutic measures for its management. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 94 (5), 421-429 (2005).
  39. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
  40. Koff, E., Rierdan, J., Stubbs, M. L. Conceptions and misconceptions of the menstrual cycle. Women & Health. 16 (3-4), 119-136 (1990).
  41. Sahay, N. Myths and misconceptions about menstruation: A study of adolescent school girls of Delhi. Journal of Women's Health and Development. 3 (3), 154-169 (2020).
  42. . The deadly truth about a world built for men - from stab vests to car crashes Available from: https://www.theguardian.com/lifeandstyle/2019/feb/23/truth-world-built-for-men-car-crashes (2019)
  43. Chrisler, J. C., Denmark, F. L., Paludi, M. A. The menstrual cycle in a biopsychosocial context. Women's Psychology. Psychology of Women: A Handbook of Issues and Theories. , 193-232 (2008).
  44. . Re-cycling the menstrual cycle: A multidisciplinary reinterpretation of menstruation Available from: https://scholarworks.wmich.edu/masters_theses/3942 (1998)
  45. Sato, J., Nasu, M., Tsuchitani, M. Comparative histopathology of the estrous or menstrual cycle in laboratory animals. Journal of Toxicologic Pathology. 29 (3), 155-162 (2016).
  46. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
  47. Smith, J. R., et al. The year of the rat: The Rat Genome Database at 20: a multi-species knowledgebase and analysis platform. Nucleic Acids Research. 48 (1), 731-742 (2020).
  48. Capdevila, S., Giral, M., Ruiz de la Torre, J. L., Russell, R. J., Kramer, K. Acclimatization of rats after ground transportation to a new animal facility. Laboratory Animals. 41 (2), 255-261 (2007).
  49. Conour, L., Murray, K., Brown, M. Preparation of animals for research-issues to consider for rodents and rabbits. ILAR journal. 47 (4), 283-293 (2006).
  50. National Academies Press (US) Committee on Guidelines for the Humane Transportation of Laboratory Animals. Guidelines for the Humane Transportation of Research Animals. National Academies Press. , (2006).
  51. Obernier, J., Baldwin, R. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR Journal. 47 (4), 364-369 (2006).
  52. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. US) . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. , (2011).
  53. Pantier, L. K., Li, J., Christian, C. A. Estrous cycle monitoring in mice with rapid data visualization and analysis. Bio-protocol. 9 (17), 1-17 (2019).
  54. Cohen, I., Mann, D. Seasonal changes associated with puberty in female rats: effect of photoperiod and ACTH administration. Biology of Reproduction. 20 (4), 757-776 (1979).
  55. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J Mice: I. cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
  56. Pennycuik, P. R. Seasonal changes in reproductive productivity, growth rate, and food intake in mice exposed to different regimens of day length and environmental temperature. Australian Journal of Biological Sciences. 25 (3), 627-635 (1972).
  57. Piacsek, B. E., Hautzinger, G. M. Effects of duration, intensity and spectrum of light exposure on sexual maturation time of female rats. Biology of Reproduction. 10 (3), 380-387 (1974).
  58. Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of the estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
  59. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2020).
  60. Campbell, C., Schwartz, N. The impact of constant light on the estrous cycle of the rat. Endocrinology. 106 (4), 1230-1238 (1980).
  61. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Osterburg, H. H., Finch, C. E. Altered profiles of estradiol and progesterone associated with prolonged estrous cycles and persistent vaginal cornification in aging C578L/6J mice. Biology of Reproduction. 24 (4), 784-794 (1981).
  62. Rivest, R. W. Sexual maturation in female rats: Hereditary, developmental and environmental aspects. Experientia. 47 (10), 1026-1038 (1991).
  63. CD® (Sprague Dawley) IGS Rat. Charles River Laboratories Available from: https://www.criver.com/products-services/find-model/cd-sd-igs-rat?region=3611 (2021)
  64. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. JoVE. , (2020).
  65. Circulatory System. Biology Corner Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_circulatory.html (2021)
  66. Urogenital System. n.d.). Biology Corner Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_circulatory.html (2021)
  67. . Anatomical foundations of neuroscience: Mini-atlas of rat's brain. Anatomy and Cell Biology 9535b Available from: https://instruct.uwo.ca/anatomy/530/535downs.htm (2008)
  68. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7 (4), 1-5 (2012).
  69. Marcondes, F. K., Bianchi, F. J., Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).
  70. Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
  71. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6 (5), (2020).
  72. Bartos, L. Vaginal impedance measurement used for mating in the rat. Laboratory Animals. 11 (1), 53-55 (1977).
  73. Belozertseva, I. V., Merkulov, D. D., Vilitis, O. E., Skryabin, B. V. Instrumental method for determining the stages of the estrous cycle in small laboratory rodents. Laboratory Animals for Scientific Research. (4), (2018).
  74. Ramos, S. D., Lee, J. M., Peuler, J. D. An inexpensive meter to measure differences in electrical resistance in the rat vagina during the ovarian cycle. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 667-670 (2001).
  75. Singletary, S. J., et al. Lack of correlation of vaginal impedance measurements with hormone levels in the rat. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (6), 37-42 (2005).
  76. Bretveld, R. W., Thomas, C. M., Scheepers, P. T., et al. Pesticide exposure: the hormonal function of the female reproductive system disrupted. Reproductive Biology Endocrinology. 4 (30), (2006).
  77. MacDonald, J. K., Pyle, W. G., Reitz, C. J., Howlett, S. E. Cardiac contraction, calcium transients, and myofilament calcium sensitivity fluctuate with the estrous cycle in young adult female mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 306 (7), 938-953 (2014).
  78. Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Biolog aN mero 174mujeradolescenteSprague Dawleyratahormonas esteroides sexualesciclo estrallavado vaginal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados