Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Resumen

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Resumen

Estudiar las propiedades fisiológicas de sinapsis específicas en el cerebro y cómo sufren cambios plásticos es un desafío clave en la neurociencia moderna. Las técnicas electrofisiológicas in vitro tradicionales utilizan la estimulación eléctrica para evocar la transmisión sináptica. Un inconveniente importante de este método es su naturaleza inespecífica; Todos los axones en la región del electrodo estimulante se activarán, lo que dificulta atribuir un efecto a una conexión aferente particular. Este problema se puede superar reemplazando la estimulación eléctrica con estimulación basada en la optogenética. Describimos un método para combinar la optogenética con registros in vitro de patch-clamp. Esta es una herramienta poderosa para el estudio tanto de la transmisión sináptica basal como de la plasticidad sináptica de conexiones sinápticas precisas definidas anatómicamente y es aplicable a casi cualquier vía en el cerebro. Aquí, describimos la preparación y el manejo de un vector viral que codifica la proteína canalrodopsina para la inyección quirúrgica en una región presináptica de interés (corteza prefrontal medial) en el cerebro de roedores y la fabricación de cortes agudos de regiones diana aguas abajo (corteza entorrinal lateral). También se presenta un procedimiento detallado para combinar las grabaciones de patch-clamp con la activación sináptica por estimulación lumínica para estudiar la plasticidad sináptica a corto y largo plazo. Discutimos ejemplos de experimentos que logran la especificidad de la vía y la célula combinando optogenética y etiquetado celular dependiente de Cre. Finalmente, se describe la confirmación histológica de la región presináptica de interés junto con el etiquetado de biocitina de la célula postsináptica, para permitir una mayor identificación de la ubicación precisa y el tipo de célula.

Introducción

Comprender la fisiología de las sinapsis y cómo sufren cambios plásticos es fundamental para comprender cómo funcionan las redes cerebrales en el cerebro sano¹ y cómo funcionan mal en los trastornos cerebrales. El uso de cortes cerebrales agudos ex vivo permite el registro de la actividad eléctrica de las sinapsis de neuronas individuales con una alta relación señal-ruido utilizando grabaciones de pinza de parche de células enteras. El control del potencial de membrana y la manipulación farmacológica directa permiten el aislamiento de los subtipos de receptores. Estos registros pueden realizarse con exquisita especificidad para identificar la neurona postsináptica, incluyendo la posición laminar y subregional², la morfología celular³, la presencia de marcadores moleculares⁴, sus proyecciones aferentes⁵, o incluso si estuvo activa recientemente⁶.

Sin embargo, lograr la especificidad de las entradas presinápticas es algo más difícil. El método convencional ha utilizado electrodos de estimulación para excitar los axones que corren en una lámina particular. Un ejemplo de esto es en el hipocampo donde la estimulación local en el estrato radiático activa sinapsis que se proyectan desde el CA3 hasta el subcampo^{CA1 7}. En este caso, la especificidad presináptica se logra ya que la entrada CA3 representa la única entrada excitatoria ubicada dentro del estrato radiátum que se proyecta a las células piramidales CA1⁸. Este alto grado de especificidad de entrada alcanzable con la activación presináptica eléctrica convencional de los axones CA3-CA1 es, sin embargo, una excepción que se refleja en el intenso estudio al que ha sido sometida esta sinapsis. En otras regiones del cerebro, los axones de múltiples vías aferentes coexisten en la misma lámina, por ejemplo, en la capa 1 del neocórtex⁹, lo que hace imposible la estimulación presináptica específica de entrada con electrodos estimulantes convencionales. Esto es problemático ya que diferentes entradas sinápticas pueden tener propiedades fisiológicas divergentes; Por lo tanto, su coestimulación puede conducir a una caracterización errónea de la fisiología sináptica.

El advenimiento de la optogenética, la codificación genética de proteínas de membrana fotosensibles (opsinas) como la canalrodopsina-2 (ChR2), ha permitido una gran expansión de las posibilidades para estudiar proyecciones sinápticas aisladas entre regiones cerebrales^10,11. Aquí describimos una solución generalizable y de bajo costo para estudiar la fisiología sináptica de largo alcance y la plasticidad. Las construcciones optogenéticas se entregan de una manera altamente específica utilizando vectores virales que permiten un control extremadamente preciso de la región presináptica de interés. Las proyecciones eferentes expresarán el canal activado por la luz que permite la activación de estas fibras en una región objetivo. Por lo tanto, se pueden estudiar vías anatómicamente difusas de largo alcance que no pueden activarse independientemente mediante la estimulación eléctrica tradicional no específica.

Describimos, como vía de ejemplo, la transducción de la corteza prefrontal medial (mPFC) con virus adenoasociados (AAV) que codifican opsinas excitatorias de canales catiónicos. Luego describimos la preparación de cortes agudos de la corteza entorrinal lateral (LEC), registros de parche y pinza de neuronas piramidales LEC de capa 5 y activación evocada por luz de proyecciones glutamatérgicas mPFC-LEC (Figura 1). También describimos la evaluación histológica del lugar de inyección para confirmar la ubicación de la región presináptica de interés y la identificación de la morfología celular postsináptica.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales del Reino Unido (1986) y las directrices asociadas, así como las directrices institucionales locales.

1. Inyección viral estereotáxica

NOTA: El protocolo actual requiere especificidad anatómica, pero no de tipo celular postsináptico.

1. Elige el animal apropiado. En este protocolo se utilizaron ratas con capucha Lister macho de tipo salvaje (300-350 g, aproximadamente 3 meses de edad).
2. Elija la construcción viral adecuada. Hay varios factores a considerar (ver Discusión). El protocolo actual utiliza un virus para expresar el canal optogenético ChETA_TC 12, para transducir neuronas excitadoras (AAV9 - CaMKIIa - ^ChR2(E123T/T159C) - mCherry; título: 3.3 x^{10 13} genomas virales/mL).
3. Establecer las coordenadas y el volumen de inyección utilizando un atlas cerebral como se describió anteriormente³⁵.
4. Inyección estereotáxica de la preparación viral
   NOTA: Deben seguirse todas las directrices nacionales e institucionales pertinentes para el uso y cuidado de los animales. Los vectores virales se inyectan estereotaxicamente como se describió anteriormente¹³ con las siguientes modificaciones.
   1. Mantenga la preparación viral en hielo durante la anestesia y la preparación del animal.
   2. Inducir anestesia en una cámara de inducción anestésica con isoflurano al 4%. Controle el nivel de anestesia indicado por una frecuencia respiratoria regular más lenta (1 Hz) y la ausencia de reflejos pedaleales y corneales (prueba pellizcando los dedos de los pies y tocando ligeramente la esquina del ojo, respectivamente; no se debe detectar respuesta).
   3. Administrar analgésico preoperatorio como meloxicam al menos 30 minutos antes del procedimiento invasivo.
   4. Cuando el animal esté completamente anestesiado, use tijeras para eliminar el pelaje del cuero cabelludo. Cambie el flujo de isoflurano al cono de la nariz del marco estereotáxico y monte la rata en el marco. Aplique gel lubricante para los ojos en los ojos para evitar la sequedad durante el procedimiento.
   5. La cirugía debe realizarse en condiciones asépticas. Use guantes e instrumentos estériles durante todo el procedimiento. Aplique ungüento de lidocaína (5% p/p) antes de desinfectar el cuero cabelludo con solución de clorhexidina al 4% p/v, y luego cubra el cuerpo con un paño estéril. Usando un bisturí, haga una incisión longitudinal de aproximadamente 15 mm de longitud en el cuero cabelludo para exponer el bregma.
   6. Cargue una jeringa Hamilton en una bomba de jeringa de microinyección conectada a un brazo móvil montado en el marco estereotáxico.
   7. Coloque una alícuota de 5 μL del virus en un tubo de 0,2 ml y gire durante unos segundos hasta que todo el volumen esté en el fondo del tubo. Pipetear 2 μL de la preparación viral en la tapa del tubo.
   8. Llene la jeringa con la preparación viral observando primero la punta de la aguja con un microscopio quirúrgico, y luego coloque manualmente el bolo del virus en la punta de la aguja y retire el émbolo de la jeringa usando los controles de la bomba.
   9. Ajuste el volumen de inyección de la bomba a 300 nL y el caudal a 100 nL/min. Haga funcionar la bomba y confirme el flujo adecuado observando la gota del virus en la punta de la aguja. Absorba el virus en un bastoncillo de algodón y limpie suavemente la aguja con etanol al 70%.
   10. Usando los tornillos del ajustador en el marco estereotáxico, navegue por la punta de la aguja hasta bregma (el punto en el cráneo donde se encuentran las suturas coronal y sagital) y tome nota de las mediciones estereotáxicas observadas en las tres escalas vernier en el marco. Las coordenadas relativas al bregma de mPFC de rata son anterior-posterior + 3,1 mm, mediolateral ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm; Sume/reste (como se indica) estas distancias desde las coordenadas Bregma, y luego navegue la aguja hasta las coordenadas anterior-posterior y mediolateral y baje suavemente la aguja sobre la superficie del cráneo.
       NOTA: Las coordenadas mPFC dadas anteriormente son apropiadas para ratas macho con capucha de 300-350 g; los cambios en la cepa de rata, el tamaño pueden requerir alteraciones en estas coordenadas (ver Discusión).
   11. Levante la aguja de la superficie del cráneo y marque este punto con un rotulador permanente de punta fina. Haga un orificio de rebabas en este punto usando un micro taladro montado en el brazo estereotáxico.
   12. Inserte la aguja en el cerebro en la coordenada dorsoventral predeterminada e infunda un volumen predeterminado (para mPFC: 300 nL). Deje la aguja in situ durante 10 minutos para permitir la difusión del bolo. Al retirar la aguja, encienda la bomba para asegurarse de que la aguja no esté bloqueada.
       NOTA: Inserte y retire la aguja lentamente (~ 3 mm / min) para minimizar el daño al tejido cerebral y el reflujo del virus hacia el tracto de la aguja.
   13. Administrar 2,5 ml de solución calentada de cloruro de sodio (0,9% p/v) y glucosa (5% p/v) por vía subcutánea para mantener la hidratación.
   14. Repita el paso 1.4.12. para el segundo hemisferio.
   15. Suture la incisión del cuero cabelludo y, al finalizar el procedimiento, administre 2,5 ml de solución de cloruro de sodio y glucosa y un analgésico apropiado, recomendado institucionalmente, para el manejo del dolor, por ejemplo, buprenorfina o meloxicam. No deje al animal desatendido mientras esté inconsciente. Coloque la rata en una caja de recuperación calentada hasta que recupere completamente la conciencia. Solo regrese a la jaula de la casa con otros animales una vez que esté completamente recuperado.
   16. Siga las pautas institucionales para el cuidado postoperatorio y los procedimientos de alojamiento para roedores transfectados por virus. Espere al menos 2 semanas para que el transgén opsina se exprese adecuadamente antes de comenzar el experimento.
       NOTA: El tiempo requerido para la transducción depende de la distancia y la fuerza de la conexión entre las regiones pre y post-sináptica. Para mPFC a LEC, se requieren 4-6 semanas.

2. Preparación de cortes cerebrales agudos

NOTA: Aquí describimos un método simple para la preparación de cortes de cerebro que en nuestras manos es suficiente para lograr cortes corticales, hipocampales y talámicos de alta calidad de ratones y ratas adultos.

1. Preparar las soluciones para la disección.
   1. Llene un vaso de precipitados de 250 ml con ~200 ml de solución de corte de sacarosa helada (189 mM de sacarosa, 26 mM NaHCO 3, 10 mM de D-glucosa, 5 mM de MgSO 4,₃ mM de KCl, 1,25 mM de_NaH2PO₄ y 0,2 mM de CaCl 2 fabricados en agua ultrapura (UPW) con resistividad de 18,2 MΩ cm a 25 °C) o un volumen suficiente para llenar la cámara de tejido del vibratomo. Burbuja con carbógeno (95% O2, 5%_CO2) y mantener en hielo.
   2. Llene una cámara de recolección de cortes con líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glucosa,₃ mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1.25 mM NaH₂ PO 4 y 1 mM MgSO₄ fabricado en UPW) a temperatura ambiente, burbujeado con carbogen. La cámara de recolección de rodajas¹⁴ está hecha a medida de una rejilla de tubos de microcentrífuga pegada a una lámina de malla de nylon y colocada en un vaso de precipitados en el que se sumerge en un CSF (Figura 2A).
   3. Llene un tubo de 50 ml con paraformaldehído (PFA) al 4% en tampón fosfato (PB; 75,4 mM Na2 HPO 4,7H2O y 24,6 mM NaH₂PO₄. H₂O).
      PRECAUCIÓN: PFA es tóxico. Usar en campana extractora.
2. Disección del cerebro.
   1. Anestesiar a la rata en una cámara de inducción usando isoflurano al 5% hasta que la respiración sea lenta y regular (~1 Hz). Asegurar un nivel suficiente de prueba de anestesia para la ausencia de pedales y reflejos corneales.
   2. Decapitar al animal usando una guillotina.
   3. Diseccionar rápidamente todo el cerebro como se describió anteriormente¹⁵ y transferirlo a una solución de corte de sacarosa. Complete el paso dentro de los 90 s posteriores a la decapitación para obtener una buena calidad de corte y una grabación exitosa de células completas.
   4. Con una cucharadita de metal, levante el cerebro, deseche el exceso de solución de corte y colóquelo en un pedazo de papel de filtro en la mesa de trabajo.
   5. Con un bisturí o una cuchilla de afeitar, retire rápidamente el cerebelo y corte el cerebro en el plano coronal aproximadamente a la mitad de su longitud; la mitad posterior es el bloque de tejido LEC. Asegúrese de incluir un poco de exceso de tejido además de la región a cortar para los próximos pasos. Devuelva tanto este bloque de tejido como el resto del cerebro a la solución de corte de sacarosa.
   6. Coloque una gota de pegamento de cianoacrilato sobre una etapa de tejido de vibratomo. Extiéndalo en una capa delgada con un área ligeramente más grande que el bloque de tejido creado en el paso anterior.
   7. Recoja el bloque de tejido LEC con una cucharadita, deseche el exceso de solución y transfiéralo al parche de pegamento de manera que el corte coronal anterior se haya adherido.
   8. Instale la etapa en la cámara de tejido de vibratomo y vierta rápidamente una cantidad suficiente de solución de corte de sacarosa para sumergir el tejido; Burbuja esta solución con Carbogen. Oriente el bloque de tejido LEC con la superficie ventral hacia la cuchilla. Si bien la iluminación ambiental de la habitación es insuficiente para activar la opsina, evite usar fuentes de luz adicionales que puedan estar presentes en el vibratomo.
   9. Corte cortes de 350 μm de espesor de ventral a dorsal utilizando una alta velocidad de oscilación de la hoja (100 Hz) y una velocidad de avance lenta de la hoja (0,06 mm/s). Típicamente, se pueden obtener siete rebanadas LEC por hemisferio.
   10. Transfiera las rodajas a la cámara de recolección de rebanadas. Una vez finalizada la recolección de rodajas, transfiera la cámara de recolección a un baño de agua a 34 °C durante 1 h antes de volver a la temperatura ambiente. Burbuja con carbogen continuamente. Las rodajas estarán lo suficientemente sanas para grabar durante al menos 6 h.
   11. Colocar el resto del cerebro en PFA durante 48 h para el examen post-hoc del lugar de inyección (ver sección 4).

3. Electrofisiología y estimulación optogenética

1. Identificación de la célula diana.
   1. Colocar el corte en una cámara de grabación sumergida a 34 °C perfundida con aCSF a una velocidad de 2 mL/min mediante una bomba peristáltica. Inmovilice la rebanada con un anclaje de rebanada.
   2. Bajo el objetivo de bajo aumento (4x) de un microscopio de campo amplio que utiliza iluminación infrarroja oblicua, navegue hasta la capa 5 de LEC. Mida la distancia desde la superficie pial hasta la capa requerida.
      NOTA: La iluminación infrarroja oblicua se logró colocando un LED infrarrojo cercano aproximadamente 3 mm por debajo del cubreobjetos de la cámara de grabación en un ángulo de ~55° con respecto al plano del cubreobjetos (Figura 2B). El contraste de interferencia diferencial es una técnica de imagen alternativa y comúnmente utilizada para la electrofisiología de corte.
   3. Cambiar a un objetivo de inmersión en agua de alto aumento (40x) e identificar neuronas piramidales. Marque la posición de la celda en el monitor de la computadora con cinta adhesiva.
      NOTA: Las neuronas piramidales tienen una morfología aproximadamente triangular con dendritas apicales prominentes que se proyectan hacia la superficie pial del corte (Figura 3A). La salud celular puede evaluarse mediante la ausencia de un núcleo condensado y visible y la inspección de la membrana plasmática que debe aparecer lisa. Es poco probable que el marcado fluorescente claro de los axones por la proteína de fusión opsina-fluoróforo sea visible cuando se utiliza un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Para visualizar proyecciones axonales, realice inmunohistoquímica post-hoc utilizando un anticuerpo primario contra el fluoróforo de la opsina y amplíe con un anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo de la misma longitud de onda o similar.
2. Formación de patch-clamp de células enteras.
   1. Fabricar una micropipeta de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de pipeta y llenar con una solución de registro intracelular filtrada (120 mM k-gluconato, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA y 0,25% de biocitina producida en UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Coloque la micropipeta llena en el soporte del electrodo en el cabezal del amplificador de abrazadera de conexión, asegurándose de que el cable del electrodo esté en contacto con la solución intracelular.
   2. Aplique presión positiva por la boca soplando con fuerza en una boquilla (como una jeringa de 1 ml sin émbolo) conectada por un tubo al puerto lateral del soporte del electrodo y mantenga la presión cerrando una válvula de tres vías en línea. Eleve el objetivo del microscopio de tal manera que se forme un menisco e inserte el electrodo en el menisco hasta que se pueda ver en el microscopio.
   3. Abra la ventana Prueba de sellado en WinLTP¹⁶ (u otro software de adquisición/osciloscopio) y con el amplificador en el modo de pinza de voltaje, aplique un pulso cuadrado de 5 mV para determinar si la resistencia de la pipeta es de 3-6 MΩ.
   4. Acérquese y toque la celda identificada con la punta de la pipeta; esto debería dar lugar a una hendidura en la membrana celular (Figura 3A; panel derecho) y un pequeño aumento de la resistencia de la pipeta (0,1 MΩ).
   5. Libere la presión positiva y aplique presión negativa aplicando succión moderada en la boquilla; esto debería resultar en un gran aumento en la resistencia de la pipeta (>1000 MΩ). La presión ahora se puede dejar neutral. Aplique presión negativa en una rampa que aumente gradualmente hasta que la membrana celular se rompa, lo que resulta en transitorios de capacitancia de células enteras.
3. Registrar eventos sinápticos evocados optogenéticamente.
   1. Introduzca la configuración de abrazadera de corriente.
      NOTA: En la mayoría de los casos, la transmisión sináptica de largo alcance es glutamatérgica, por lo tanto, el registro en potenciales de membrana cercanos al potencial de reversión del cloruro aislará mejor la transmisión mediada por el receptor AMPA (AMPAR) y minimizará la medición de cualquier inhibición de alimentación (FFI) evocada. La reversión del cloruro depende de la composición de la solución de registro intracelular y del LCRa y se puede calcular mediante la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz; para las soluciones anteriores, esto fue de -61.3 mV. Las neuronas piramidales LEC de capa 5 tenían un potencial de membrana en reposo promedio de -62 mV y, cuando fue necesario, se mantuvieron en este potencial mediante inyección de corriente constante. Alternativamente, las celdas se pueden sujetar al voltaje al potencial deseado. Para registrar proyecciones inhibitorias de largo alcance¹⁶ o para registrar FFI, pinza de voltaje en el potencial de reversión catiónica para aislar la conductancia del cloruro GABAérgico. Cuando las neuronas de pinzamiento de voltaje en potenciales de membrana por encima del umbral de potencial de acción, se utiliza una solución intracelular a base de cesio que contiene bloqueadores de los canales de sodio dependientes de voltaje para mejorar la pinza de voltaje y prevenir el inicio de potenciales de acción (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 cloruro,₄ mM MgATP, 0.5 mM EGTA, 0.3 mM NaGTP, 0.25% biocitina producida en UPW, pH 7.25, 285-300 mOsm).
   2. Usando el software de adquisición de datos, envíe señales de lógica de transistor-transistor (TTL) a un controlador LED para activar un LED de 470 nm montado. El LED montado se dirige a la trayectoria de la luz del microscopio utilizando cubos de filtro y óptica apropiada (Figura 2B) para aplicar pulsos de luz a la rebanada a través del objetivo 40x para evocar potenciales postsinápticos excitatorios optogenéticos (oEPSP).
      NOTA: Los pulsos de luz se pueden aplicar perisomáticamente / sobre las dendritas, lo que resultará en la activación de opsinas en los axones y el bouton presináptico, o el investigador puede mover el objetivo a los axones lejos de la célula registrada para evitar la estimulación excesiva (ver Discusión). La amplitud máxima de oEPSP depende de la fuerza de la proyección sináptica, la eficacia de las inyecciones virales y la opsina utilizada. Los oEPSP pueden ajustarse a la amplitud deseada variando la intensidad de la luz y/o la duración¹⁸; variar la duración de los pulsos de luz (duración típica entre 0,2-5 ms a la potencia máxima de salida del LED, lo que resulta en una densidad de luz de 4,4 mW / mm¹⁹) proporciona amplitudes oEPSP más consistentes que alterar la potencia de salida del LED.
   3. Investigar las propiedades de liberación presináptica (cambio en el voltaje) mediante la entrega de trenes de múltiples pulsos de luz con diferentes intervalos interestímulo (Figura 3E); Se debe tener cuidado al interpretar la transmisión optogenéticamente evocada (ver Discusión).
   4. Investigar la plasticidad a largo plazo, ya sea evocando repetidamente oEPSPs¹⁹ o aplicando ligandos. Monitoree la amplitud de oEPSP durante 5-10 min para garantizar la estabilidad antes de la inducción de la plasticidad, y luego monitoree hasta que se alcance una amplitud estable (típicamente 30-40 min).
      NOTA: La mayoría de las opsinas actuales no son capaces de evocar de manera confiable múltiples potenciales de acción a altas frecuencias, por ejemplo, 100 estímulos entregados a 100 Hz, como se usa típicamente para inducir LTP.
   5. Para confirmar que los oEPSP son monosinápticos, realice la activación por encima de la vía transducida posicionando el objetivo sobre el cenador dendrítico y estimulando en presencia de tetrodotoxina 0,5 μM y aminopiridina 100 μM. La aplicación de tetrodotoxina abolirá la transmisión si las respuestas son dependientes del potencial de acción y la inclusión posterior de aminopiridina restaurará parcialmente la transmisión si los oEPSP se generan monosinápticamente^19,20.
   6. Para permitir que la biocitina llene la neurona, espere al menos 15 minutos después de ingresar a la configuración de células completas. En voltaje-abrazadera, monitoree la capacitancia de la membrana y la resistencia de entrada.
   7. Retire lentamente la pipeta a lo largo del ángulo de aproximación lejos del soma de la célula, observando la lenta desaparición de los transitorios de capacitancia y la corriente de membrana que indica el nuevo sellado de la membrana celular y la formación de un parche de afuera hacia afuera en la punta de la pipeta. Tenga en cuenta la orientación del sector y la ubicación de las celdas dentro del sector. Poner la rodaja en PFA en una placa de 24 pocillos e incubar durante la noche a 4 °C, y luego transferir a 0,1 M PB.
      NOTA: Las rebanadas se pueden almacenar hasta por una semana. Si se requiere un almacenamiento más prolongado, cambie el PB regularmente o use PB que contenga azida de sodio (0.02% -0.2% de azida de sodio).

4. Histología

1. Lugar de inyección de corte
   1. Después de la fijación, crioproteger el tejido en sacarosa al 30% (p/v) en PB hasta que se hunda (inicialmente flotará en la solución de sacarosa), generalmente durante la noche a temperatura ambiente o 24-48 h a 4 °C.
   2. Usando un medio de temperatura de corte óptima (OCT), conecte un bloque de tejido al disco de la muestra de criostato. Congelar el bloque de tejido siguiendo los pasos 4.1.3 a 4.1.4.
   3. Coloque el isopentano en un recipiente apropiado. Sumerja solo el disco de la muestra, asegurándose de que el tejido esté por encima del nivel del isopentano. Baje el recipiente de isopentano en nitrógeno líquido (o hielo seco) y permita que el tejido se congele.
   4. Una vez completamente congelado (todo el bloque de tejido se vuelve pálido y duro), deje el bloque de tejido en la cámara de criostato a -20 ° C durante 30 minutos para permitir que la temperatura del bloque se equilibre.
   5. Cortar secciones de 40 μm de espesor en el criostato a -20 °C. Use un pincel fino para guiar las secciones de la hoja. Adhiera las secciones congeladas a un portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos de poli-L-lisina a temperatura ambiente tocando el portaobjetos con las secciones.
   6. Agregue alrededor de 150 μL de medio de montaje a cada diapositiva y cubra con un cubreobjetos; Retire cualquier burbuja de aire presionando suavemente el cubreobjetos. Cubra los portaobjetos para protegerlos contra el fotoblanqueo y seque al aire a temperatura ambiente durante al menos 12 h (o durante la noche). Usando un microscopio de fluorescencia, examine la ubicación del sitio de inyección viral.
2. Protocolo de tinción de biocitina
   NOTA: Este protocolo se puede aplicar a secciones gruesas; No es necesario volver a seccionar los sectores.
   1. Lave las rodajas de cerebro con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4y 1.8 mM KH₂PO₄) seis veces durante 10 minutos por lavado. Utilice una pipeta de transferencia para vaciar los pocillos después de cada paso.
   2. Incubar las rodajas en 3%_H2O2(p/v) en PBS durante 30 min para bloquear cualquier actividad peroxidasa endógena. Esto genera burbujas de oxígeno.
   3. Lave las rebanadas de cerebro con PBS seis veces durante 10 minutos por lavado o hasta que no se vean más burbujas de oxígeno. Incubar las rodajas de cerebro en una solución de complejo HRP (ABC) de avidina-biotinilada al 1% (v/v) en PBS que contenga 0,1% (v/v) de Triton X-100 a temperatura ambiente durante 3 h.
   4. Lave las rebanadas de cerebro con PBS seis veces durante 10 minutos por lavado.
   5. Incubar cada rodaja en solución de 3,3′-diaminobencidina (DAB) durante varios minutos hasta que se haga visible la tinción biocitina de las estructuras neuronales (toma alrededor de 5-10 min).
      PRECAUCIÓN: DAB es tóxico. Usar en campana extractora.
      NOTA: Los tiempos de incubación de DAB pueden ser impredecibles, monitoree el tejido de cerca a medida que se desarrolla el color.
   6. Detenga la reacción transfiriendo las rodajas a PBS frío (4 °C). Lave las rebanadas de cerebro con PBS seis veces durante 10 minutos por lavado. Use un cepillo para montar las rodajas de cerebro en portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos de poli-L-lisina.
   7. Retire todo el exceso de PBS con un pañuelo limpio. Cubra cada rodaja con aproximadamente 200 μL de medio de montaje; Cubra con cubreobjetos y presione suavemente el cubreobjetos para expulsar las burbujas de aire. Secar al aire a temperatura ambiente durante al menos 12 h (o durante la noche). Usando un microscopio óptico, examine la ubicación y los detalles morfológicos de la(s) célula(s).
      NOTA: La biocitina se puede visualizar alternativamente utilizando estreptavidina conjugada con fluoróforos; Sin embargo, las imágenes pueden requerir resección o el uso de un microscopio confocal²¹.

Resultados

En este protocolo, describimos cómo estudiar la fisiología sináptica de largo alcance y la plasticidad utilizando la administración viral de construcciones optogenéticas. El protocolo se puede adaptar muy fácilmente para estudiar casi cualquier conexión de largo alcance en el cerebro. Como ejemplo, describimos la inyección de AAV que codifican una opsina en mPFC de rata, la preparación de cortes agudos de LEC, registros de patch-clamp de neuronas piramidales LEC de capa 5 y activación evocada por luz de termina...

Discusión

El protocolo presentado aquí describe un método para explorar proyecciones sinápticas de largo alcance altamente específicas utilizando una combinación de cirugía estereotáxica para administrar AAV que codifican construcciones optogenéticas y electrofisiología en cortes cerebrales agudos (Figura 1). Juntas, estas técnicas ofrecen herramientas para caracterizar la fisiología y la plasticidad de los circuitos cerebrales con alta precisión en vías de largo alcance y anatómicamente...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tube	Fisher Scientific Ltd	12134102
10 µL pipette	Gilson	FD10001
24 well plate	SARSTEDT	83.3922
3 way luer valve	Cole-Parmer	WZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate	Vector Laboratories	SK-4105
40x objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4-aminopyridine	Hello Bio	HB1073
4x objective	Olympus	PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry	Addgene	35512	Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lens	Edmund Optics	49363	Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifuge	Benchmark Scientific	C1005*
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Borosillicate glass capillary	Warner Instruments	G150F-6
Burr	Fine science tools	19008-07
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Camera - Qimaging Retiga Electro	Photometrics	01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	2810
Chlorhexidine surgical scrub	Vetasept	XHG008
Clippers	Andis	22445	AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lens	ThorLabs	ACL2520-A
Coverslips	Fisher Scientific Ltd	10011913
Cryostat	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
Cyanoacrylate glue	Rapid Electronics Ltd	84-4557
Data acquisition device	National Instruments	USB-6341 BNC
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dichroic mirror 500 nm long-pass	Edmund Optics	69899
Dichroic mirror 600 nm long-pass	Edmund Optics	69901
Dichroic mirror cube	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	Millpore	324626
Electrode holder with side port	HEKA	895150
Emission filter	Chroma	59022m
Excitation filter	Chroma	ET570/20x
Eye gel	Dechra	Lubrithal
Fine paint brush	Scientific Laboratory Supplies	BRU2052
Guillotine	World Precision Instruments	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009	30% (w/w)
Isoflurane	Henry Schein	988-3245
Isopentane	Sigma-Aldrich	M32631
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
k-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
Kinematic fluorescence filter cube	ThorLabs	DFM1T1
LED driver	ThorLabs	LEDD1B
Lidocaine ointment	Teva	80007150
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Micro drill	Harvard Apparatus	75-1887
Microelectrode puller	Sutter instruments	P-87
Microinjection syringe	Hamilton	7634-01/00
Microinjection syringe needle	Hamilton	7803-05	Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments	UMP3T-1
Mounted blue LED	ThorLabs	M470L5
Mounted green LED	ThorLabs	M565L3
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
NIR LED	OSRAM	SFH4550	Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT medium	VWR International	RAYLLAMB/OCT	Optimal cutting temperature medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	700A
Peristaltic pump	World Precision Instruments	Ministar
Poly-L-lysine coated microscope slides	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Scalpel blade	Swann Morton	#24
Slice anchor	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
Stereotaxic frame	Kopf	Model 902
Stereotaxic holder for micro drill	Harvard Apparatus	75-1874
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Surgical Microscope	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Suture	Ethicon	W577H
Syringe filter for intracellular recording solution	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
Tetrodotoxin citrate	Hello Bio	HB1035
Transfer pipettes	Fisher Scientific Ltd	10458842
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Upright fluorescence microscope	Leica	DM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kit	Vector Laboratories	PK-4000
Vibratome	Campden Instruments	7000smz-2
WinLTP	https://www.winltp.com/	Version 2.32	Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?