Analisi citometrica a flusso di parametri mitocondriali multipli in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali

Riepilogo

Questo studio riporta un nuovo approccio per misurare più parametri funzionali mitocondriali basati sulla citometria a flusso e sulla doppia colorazione con due reporter fluorescenti o anticorpi per rilevare cambiamenti nel volume mitocondriale, potenziale di membrana mitocondriale, livello di specie reattive dell'ossigeno, composizione della catena respiratoria mitocondriale e DNA mitocondriale.

Abstract

I mitocondri sono importanti nella fisiopatologia di molte malattie neurodegenerative. I cambiamenti nel volume mitocondriale, il potenziale di membrana mitocondriale (MMP), la produzione mitocondriale di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) sono spesso caratteristiche di questi processi. Questo rapporto descrive un nuovo approccio basato sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in diversi tipi di cellule, tra cui cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e cellule neurali e gliali derivate da iPSC. Questa strategia basata sul flusso utilizza cellule vive per misurare il volume mitocondriale, i livelli di MMP e ROS, nonché cellule fisse per stimare componenti della catena respiratoria mitocondriale (MRC) e proteine associate al mtDNA come il fattore di trascrizione mitocondriale A (TFAM).

Co-colorando con reporter fluorescenti, tra cui MitoTracker Green (MTG), tetrametilrodamina estere etilico (TMRE) e MitoSox Red, i cambiamenti nel volume mitocondriale, MMP e ROS mitocondriale possono essere quantificati e correlati al contenuto mitocondriale. La doppia colorazione con anticorpi contro le subunità del complesso MRC e la translocasi della membrana mitocondriale esterna 20 (TOMM20) consente la valutazione dell'espressione della subunità MRC. Poiché la quantità di TFAM è proporzionale al numero di copie del mtDNA, la misurazione del TFAM per TOMM20 fornisce una misurazione indiretta del mtDNA per volume mitocondriale. L'intero protocollo può essere eseguito entro 2-3 ore. È importante sottolineare che questi protocolli consentono la misurazione dei parametri mitocondriali, sia a livello totale che a livello specifico per volume mitocondriale, utilizzando la citometria a flusso.

Introduzione

I mitocondri sono organelli essenziali presenti in quasi tutte le cellule eucariotiche. I mitocondri sono responsabili dell'approvvigionamento energetico producendo adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa e agiscono come intermediari metabolici per la biosintesi e il metabolismo. I mitocondri sono profondamente coinvolti in molti altri importanti processi cellulari, come la generazione di ROS, la morte cellulare e la regolazione intracellulare di Ca²⁺. La disfunzione mitocondriale è stata associata a varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Alzheimer (AD), la malattia di Huntington (HD), l'atassia di Friedreich (FRDA) e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)¹. Si ritiene inoltre che l'aumento della disfunzione mitocondriale e l'anomalia del mtDNA contribuiscano all'invecchiamento umano ^2,3.

Vari tipi di disfunzione mitocondriale si verificano nelle malattie neurodegenerative e cambiamenti nel volume mitocondriale, depolarizzazione MMP, produzione di ROS e alterazioni nel numero di copie del mtDNA sono comuni 4,5,6,7. Pertanto, la capacità di misurare queste e altre funzioni mitocondriali è di grande importanza quando si studiano i meccanismi della malattia e si testano potenziali agenti terapeutici. Inoltre, in considerazione della mancanza di modelli animali che replicano fedelmente le malattie neurodegenerative umane, stabilire adeguati sistemi modello in vitro che ricapitolino la malattia umana nelle cellule cerebrali è un passo importante verso una maggiore comprensione di queste malattie e lo sviluppo di nuove terapie 2,3,8,9.

Le iPSC umane possono essere utilizzate per generare varie cellule cerebrali, comprese le cellule neuronali e non neuronali (cioè le cellule gliali), e il danno mitocondriale associato alla malattia neurodegenerativa è stato trovato in entrambi i tipi di cellule 3,10,11,12,13. I metodi appropriati per la differenziazione delle iPSC in linee neurali e gliali sono disponibili^14,15,16. Queste cellule forniscono una piattaforma uomo/paziente unica per la modellazione in vitro della malattia e lo screening dei farmaci. Inoltre, poiché questi sono derivati dai pazienti, i neuroni derivati da iPSC e le cellule gliali forniscono modelli di malattia che riflettono ciò che sta accadendo negli esseri umani in modo più accurato.

Ad oggi, sono disponibili pochi metodi convenienti e affidabili per misurare più parametri funzionali mitocondriali nelle iPSC, in particolare i neuroni viventi e le cellule gliali. L'uso della citometria a flusso fornisce allo scienziato un potente strumento per misurare i parametri biologici, compresa la funzione mitocondriale, in singole cellule. Questo protocollo fornisce dettagli per la generazione di diversi tipi di cellule cerebrali, tra cui cellule staminali neurali (NSC), neuroni e astrociti gliali da iPSC, nonché nuovi approcci basati sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in diversi tipi di cellule, tra cui iPSC e cellule neurali e gliali derivate da iPSC. Il protocollo fornisce anche una strategia di co-colorazione per l'utilizzo della citometria a flusso per misurare il volume mitocondriale, MMP, livello di ROS mitocondriale, complessi MRC e TFAM. Incorporando misure del volume o della massa mitocondriale, questi protocolli consentono anche la misurazione sia del livello totale che del livello specifico per unità mitocondriale.

Protocollo

NOTA: Vedere la tabella dei materiali e la tabella supplementare S1 per le ricette di tutti i supporti e le soluzioni utilizzate in questo protocollo.

1. Differenziazione delle iPSC umane in NCS, neuroni dopaminergici (DA) e astrociti

1. Preparare piastre rivestite di matrice.
   1. Scongelare un flaconcino di 5 mL di matrice sul ghiaccio durante la notte. Diluire 1 mL di matrice con 99 mL di freddo Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (concentrazione finale 1%). Preparare 1 mL di aliquote e conservarle a -20 °C.
   2. Scongelare la soluzione della matrice a 4 °C (tenerla fredda) e rivestire 6 pozzetti (1 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
   3. Posizionare la piastra rivestita di matrice in un incubatore d'aria umidificato al 5% di CO₂/95% a 37 °C per 1 ora. Estrarre la piastra dall'incubatore e lasciarla equilibrare a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Si consiglia di utilizzare la piastra entro 3 giorni dal rivestimento. Tuttavia, la piastra rivestita può essere conservata fino a 2 settimane a 4 °C. Ricordati solo di estrarlo e lasciarlo riscaldare a RT prima dell'uso. Per una conservazione prolungata, aggiungere 1 mL di terreno di coltura iPSC alla piastra rivestita per evitare l'essiccazione della matrice.
2. Scongelamento delle iPSC
   1. Preriscaldare le piastre rivestite di matrice a RT o nell'incubatore a 37 °C per 20-30 minuti. Preriscaldare la quantità richiesta di terreno di coltura iPSC a RT.
   2. Miscelare 6 ml di terreno di coltura iPSC preriscaldato con 12 μL di inibitore ROCK Y-27632 per ottenere una concentrazione finale di 10 μM.
   3. Scongelare parzialmente il flaconcino congelato di iPSC a 37 °C a bagnomaria fino a quando rimane un piccolo pezzo di ghiaccio.
   4. Aggiungere lentamente 1 mL di terreno di coltura iPSC preriscaldato con 12 μL di inibitore ROCK a goccia per goccia alle cellule. Trasferire il contenuto liquido del flaconcino con iPSC goccia a goccia in un pozzetto di una piastra preverniciata a 6 pozzetti utilizzando una pipetta da 5 ml.
   5. Spostare la piastra in direzioni perpendicolari per mescolare il contenuto del pozzetto e riportare la piastra nell'incubatore. Cambiare il terreno di coltura iPSC dopo 24 ore dopo il lavaggio con soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
      NOTA: Non aggiungere inibitore ROCK alle poppate successive. Cambiare il terreno di coltura iPSC ogni giorno.
3. Subcoltura di iPSC
   1. Preriscaldare le piastre rivestite di matrice a RT o nell'incubatore a 37 °C per 20-30 minuti. Preriscaldare la quantità richiesta di terreno di coltura iPSC a RT.
   2. Aspirare il terreno di coltura dalle piastre contenenti le cellule. Risciacquare le iPSC con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
   3. Aggiungere EDTA (0,5 mM) (1 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Incubare le placche a 37 °C fino a quando i bordi delle colonie iniziano a sollevarsi dal pozzo (di solito 3-5 minuti). Aspirare l'EDTA.
   4. Aggiungere terreno di coltura iPSC preriscaldato (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e staccare con forza le colonie di iPSC usando una pipetta sterile da 10 mL una volta. Non pipetta su e giù in quanto ciò potrebbe rompere i grumi di cellule in singole cellule.
   5. Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in due singoli pozzetti in una piastra a 6 pozzetti rivestita di matrice (2 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e incubare a 37 °C. Non generare bolle nella sospensione durante il pipettaggio.
      NOTA: Agitare delicatamente la piastra prima di tenerla nell'incubatore. Il rapporto di divisione può essere 1:2 (un pozzo in 2 nuovi pozzi) a 1:4 (un pozzo in 4 nuovi pozzi).
   6. Sostituire il mezzo ogni giorno fino a quando le colonie raggiungono il 60% di confluenza con buone dimensioni e connessioni.
4. Induzione neurale e generazione di progenitori neurali
   1. Preparare 500 ml di terreno definito chimicamente (CDM), 500 ml di mezzo di induzione neurale (NIM) e 500 ml di mezzo privo di siero di cellule staminali neurali (NSC SF).
   2. Risciacquare le cellule con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e aggiungere NIM (3 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Imposta come Giorno 0.
   3. Sostituire il NIM (3 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) il giorno 1, il giorno 3 e il giorno 4 e osservare al microscopio ogni giorno.
   4. Il giorno 5, staccare le rosette neurali in coltura di sospensione come descritto di seguito.
      1. Lavare una volta delicatamente con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Aggiungere collagenasi IV (1 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e conservare in un incubatore per 1 minuto. Aspirare delicatamente la collagenasi IV e lavare una volta con DPBS (1x) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
      2. Aggiungere 2 ml di NSC SF Medium per pozzetto a una piastra a 6 pozzetti. Staccare le celle raschiando il fondo dei pozzetti disegnando griglie utilizzando una punta per pipetta da 200 μL.
      3. Raccogliere la sospensione cellulare dalla piastra a 6 pozzetti in un piatto non aderente da 10 cm. Portare il volume a 12 mL con NSC SF Medium.
      4. Agitare il piatto non aderente a 65-85 giri / min su uno shaker orbitale in un'incubatrice per evitare l'aggregazione.
5. Differenziazione dei neuroni DA
   1. Il giorno 7, aggiungere 12 ml di CDM integrato con 100 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti-8b (FGF-8b) e posizionare il piatto sullo shaker orbitale nell'incubatore.
   2. Nei giorni 8-13, cambiare il mezzo ogni 2 giorni e osservare al microscopio ogni giorno.
   3. Il giorno 14, aggiungere 12 ml di CDM integrato con 100 ng/mL FGF-8b e 1 μM di purmorfinamina (PM). Posizionare il piatto sullo shaker orbitale nell'incubatore.
   4. Nei giorni 15-20, cambiare il mezzo ogni 2 giorni e osservare quotidianamente le cellule al microscopio.
   5. Far passare meccanicamente le sfere utilizzando punte da 1000 μL per rompere le sfere più grandi.
      NOTA: Il rapporto può essere 1:2 (un piatto in 2 nuovi piatti).
6. Cessazione della differenziazione
   1. Rivestire una piastra a 6 pozzetti o coprivetrini con poli-L-ornitina (PLO) e laminina come descritto di seguito.
      1. Rivestire una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di PLO per pozzetto e incubare la piastra a 37 °C per 20 minuti. Aspirare la soluzione OLP.
      2. Sterilizzare la piastra sotto UV per 20 minuti. Risciacquare i pozzetti due volte con DPBS (1x) (4 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
      3. Aggiungere 5 μg/mL di soluzione di laminina (1 mL per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti) nel pozzetto e incubare a 37 °C per 2 ore. Aspirare la laminina e lavare brevemente i pozzetti con DPBS (1x) (4 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) una volta prima della placcatura.
   2. Raccogliere tutte le sfere (dal punto 1.5.5) in provette da 50 mL e rabboccare con DPBS (1x). Girare a 300 × g per 5 min. Aspira il surnatante.
   3. Incubare con 2 mL di reagente di dissociazione cellulare (vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti a 37 °C a bagnomaria, seguita da una leggera triturazione con una pipetta da 200 μL (20-50 volte a seconda delle dimensioni delle sfere, evitando la formazione di bolle).
   4. Neutralizzare il reagente di dissociazione cellulare con 2 mL di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con siero bovino fetale al 10% (FBS) e centrifugare il tubo conico da 50 mL contenente le cellule a 300 × g per 5 minuti a RT. Aspirare il surnatante.
   5. Aggiungere 1 mL di CDM integrato con 10 ng/mL Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) e 10 ng/mL Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor (GDNF) per risospendere i pellet cellulari pipettando delicatamente su e giù per ottenere sospensioni monocellulari.
   6. Aspirare la soluzione di laminina dalla piastra (punto 1.6.1.3), lavare brevemente con DPBS (1x) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e seminare le cellule (dal punto 1.6.5) nelle piastre prerivestite o nei vetrini di copertura in 3 mL di CDM integrato con 10 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF. Nutrire le cellule ogni 4 giorni.
      NOTA: Le colture differenzianti possono essere mantenute per molte settimane fino a 3 mesi. La morfologia neurale di solito appare dopo 2 settimane dalla terminazione e può essere utilizzata per analisi a valle da quel punto in poi. BDNF e GDNF non sono necessari per la coltura per una manutenzione più lunga (fino a 2 mesi).
7. Generazione NSC
   1. Piastre a matrice di rivestimento.
   2. Raccogliere tutte le sfere neurali (generate dal punto 1.4) in provette da 50 mL e rabboccare con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-free). Girare a 300 × g per 5 min. Aspirare i surnatanti
   3. Incubare i pellet con 2 ml di reagente di dissociazione cellulare per 10 minuti a 37 °C a bagnomaria, seguito da una triturazione delicata con una pipetta da 200 μL (20-50 volte a seconda delle dimensioni delle sfere, evitando la formazione di bolle).
   4. Neutralizzare con 2 mL di DMEM con FBS al 10% e centrifugare le provette coniche da 50 mL contenenti le cellule a 300 × g per 5 minuti a RT. Aspirare i surnaanti. Risospendere i pellet cellulari mediante pipettaggio delicato su e giù per ottenere sospensioni monocellulari.
   5. Aspirare la soluzione della matrice da una piastra preverniciata e seminare le cellule nelle piastre prerivestite in NSC SF Medium (3 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Nutrire le cellule ogni 2-3 giorni e dividere le cellule quando confluenti.
      NOTA: da questa fase in poi, i NSC possono essere espansi e congelati.
8. Differenziazione degli astrociti glia
   1. Differenziazione degli astrociti dalle NSC
      1. Preparare 500 ml di terreno di differenziazione astrocitaria.
      2. NSC di semi su piastre/coprivetrini rivestiti di poli-D-lisina (PDL) con NSC SF Medium.
      3. Il giorno seguente, sciacquare le cellule con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e aggiungere Astrocyte Differentiation Medium (3 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Imposta come Giorno 0.
      4. Osservare quotidianamente le NSC al microscopio e sostituire il mezzo di differenziazione degli astrociti (3 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) ogni 2 giorni dai giorni 1 ai giorni 27.
   2. Maturazione degli astrociti
      1. Preparare il mezzo di maturazione degli astrociti.
      2. Il giorno 28, sciacquare le cellule con DPBS (1x) (4 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e aggiungere il mezzo di maturazione degli astrociti (3 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
      3. Dal giorno 29 in poi, osservare quotidianamente le cellule al microscopio e sostituire il terreno di maturazione degli astrociti (3 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) ogni 2 giorni.
      4. Dopo un mese di maturazione, espandere le cellule e crioconservarle da questa fase in poi.
         NOTA: Durante questa fase, il numero di celle aumenterà. Quando si dividono le celle, i coprivetrini rivestiti in PDL non sono necessari per la coltivazione.

2. Caratterizzazione cellulare mediante immunocitochimica e colorazione con immunofluorescenza

1. Alla fine del periodo di coltura, trasferire i vetrini di copertura con le cellule su una piastra a 12 pozzetti.
   Risciacquare le cellule con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (1x) due volte e incubare per 10 minuti in paraformaldeide al 4% (PFA) (0,5 ml per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti) a RT.
   NOTA: Il campione fisso può essere coperto con 2 ml di PBS (1x) e conservato a 4 °C fino a quando non è necessario per l'immunocolorazione. Il PFA è tossico ed è sospettato di causare il cancro. Prevenire l'esposizione della pelle e degli occhi e lavorare sotto una cappa aspirante chimica.
2. Bloccare e permeabilizzare le cellule e incubare con tampone bloccante contenente PBS (1x), 0,3% Triton X-100 e 10% siero di capra normale per 1 ora a RT.
3. Incubare con anticorpi primari nel tampone bloccante per una notte a 4 °C: iPSC coloranti con fattore di trascrizione 4 anti-ottamero-legante (Oct4) e anti-antigene-embrionale specifico anti-stadio (SSEA4), NSC con regione anti-determinazione del sesso Y box-2 (Sox2) e anti-Nestin, sfere neurali con anti-accoppiato box-6 (Pax6) e anti-Nestin, astrociti con proteina acida fibrillare anti-gliale (GFAP) e proteina legante il calcio anti-S100 β (S100β) e neuroni DA con anti-tirosina idrossilasi (TH), tubulina anti-β III (Tuj 1), anti-sinaptofisina e anti-PSD-95 (0,5 ml di soluzione anticorpale primaria per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti; vedere la tabella dei materiali per i dettagli).
4. Lavare i campioni con PBS (1x) tre volte per 10 minuti ciascuno con un leggero dondolo.
5. Incubare con soluzione anticorpale secondaria (1:800 in tampone bloccante, 0,5 ml di soluzione di anticorpi secondari Alexa Fluor per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti) per 1 ora a RT con un leggero dondolio.
6. Incubare le cellule con Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 mL per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti) in PBS (1x) per 15 minuti a RT per marcare i nuclei.
7. Montare le cellule con il mezzo di montaggio e asciugarle durante la notte a RT per l'imaging al microscopio a fluorescenza al buio. Vedere la Figura supplementare S1 per le impostazioni e i parametri del microscopio.

3. Misurazione della citometria a flusso del volume mitocondriale, MMP e ROS mitocondriale in cellule vive

1. Seminare le cellule separatamente in 4 pozzetti in una piastra a 6 pozzetti fino a quando le cellule raggiungono il 50% -60% di confluenza. Etichetta questi quattro pozzi come #1, #2, #3 e #4.
2. Alla fine del periodo di coltura, preparare 5 singole soluzioni coloranti (500 μL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) come segue: #1 solo terreno di coltura (al pozzetto #1 contenente solo cellule per il controllo); #2-1 contenente FCCP (100 μM); #2-2 contenente FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) in terreno di coltura; #3 contenente TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) in terreno di coltura; #4 contenente MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) in PBS (1x) con il 10% di FBS. Vedere la Figura 1A, la Tabella supplementare S2 e la Tabella dei materiali per i dettagli su questi composti e la configurazione della citometria a flusso.
   NOTA: Utilizzare il terreno di coltura per preparare la soluzione colorante. Riscaldare il mezzo e PBS (1x) a RT prima dell'uso. FCCP è tossico; prevenire l'esposizione della pelle e degli occhi e lavorare sotto una cappa di fumi chimici.
3. Aspirare il mezzo dal pozzetto #2 e aggiungere la soluzione #2-1 (solo FCCP). Incubare le cellule a 37 °C per 10 minuti.
4. Aspirare il mezzo dai pozzetti #2 e #3 e aggiungere la soluzione #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) nel pozzetto #2 e la soluzione #3 (TMRE + MTG) in #3. Incubare le cellule a 37 °C per 45 minuti.
5. Aspirare il mezzo dal pozzetto #4 e aggiungere la soluzione #4 (MitoSox Red + MTG). Incubare le cellule a 37 °C per 15 minuti.
6. Aspirare il mezzo da tutti i pozzi. Lavare con PBS (1x) (4 ml per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti). Staccare le cellule usando 1 mL di reagente di dissociazione cellulare (1 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) a 37 °C per 5 minuti. Neutralizzare il reagente di dissociazione cellulare in 1 mL di DMEM con FBS al 10% (2 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
7. Raccogliere il contenuto di tutti i pozzetti in tubi conici da 15 ml. Centrifugare i tubi a 300 × g per 5 min. Lavare il pellet con PBS (1x) una o due volte.
8. Aspirare i surnatanti ma lasciare circa 100 μL nelle tube. Risospendere i pellet cellulari in 300 μL di PBS (1x). Trasferire le cellule in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Tieni i tubi al buio a RT.
9. Analizzare le cellule utilizzando un citometro a flusso (con una configurazione laser 3 blu e 1 rosso). Rileva MTG nel filtro 1 (FL1) utilizzando un filtro passa banda 530/30, TMRE nel filtro 2 (FL2) utilizzando il filtro passa-banda 585/40 e MitoSox Red nel filtro 3 (FL3) utilizzando un filtro passa banda 510/580.

4. Misura della citometria a flusso di subunità del complesso MRC e TFAM in celle fisse

1. Alla fine del periodo di coltura, staccare le cellule (~10⁶) aggiungendo il reagente di dissociazione cellulare; quindi, pellet e raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml. Lavare le celle mediante centrifugazione con PBS (1x) due volte centrifugando a 300 × g per 5 minuti.
2. Fissare le cellule in 1,6% PFA (1 mL di 1,6% PFA in un tubo da 15 ml) a RT per 10 minuti. Lavare le celle mediante centrifugazione con PBS (1x) due volte centrifugando a 300 × g per 5 minuti.
3. Permeabilizzare le cellule con metanolo ghiacciato al 90% (1 mL di metanolo al 90% in un tubo da 15 ml) a -20 °C per 20 minuti.
4. Bloccare i campioni in tampone bloccante contenente 0,3 M di glicina, siero di capra al 5% e albumina sierica bovina all'1% (BSA) - Frazione V in PBS (1x) (1 mL di tampone bloccante in una provetta da 15 ml). Lavare le celle mediante centrifugazione con PBS (1x) due volte (come al punto 3.7).
5. Incubare le cellule con i seguenti anticorpi primari per 30 minuti: anti-NDUFB10 (1:1.000) per la misurazione della subunità del complesso I, subunità A del complesso flavoproteico del complesso anti-succinato deidrogenasi (SDHA, 1:1.000) per la misurazione della subunità del complesso II e anti-COX IV (1:1.000) per la misurazione della subunità IV complessa e anticorpo anti-TFAM coniugato con Alexa Fluor 488 (1:400). Colorare lo stesso numero di cellule separatamente con l'anticorpo anti-TOMM20 coniugato con Alexa Fluor 488 (1:400) per 30 minuti (1 mL di soluzione anticorpale primaria in un tubo da 15 ml; vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sugli anticorpi).
6. Lavare le celle con PBS (1x) una volta con centrifugazione a 300 × g per 5 minuti. Aggiungere anticorpi secondari (1:400) in provette di NDUFB10, SDHA e COX IV e incubare le cellule con queste soluzioni per 30 minuti.
7. Lavare le celle con PBS (1x) una volta centrifugando a 300 × g per 5 minuti. Aspirare i surnatanti lasciando circa 100 μL nelle tube. Risospendere i pellet cellulari in 300 μL di PBS (1x). Trasferire le cellule in provette di microcentrifuga da 1,5 ml tenute al buio sul ghiaccio.
8. Analizzare le cellule sul citometro a flusso (con una configurazione laser 3 blu e 1 rossa). Rileva i segnali nel filtro 1 (FL1) utilizzando un filtro passa banda 530/30. Vedere la Figura supplementare S2 per le impostazioni e i parametri del microscopio.

5. Acquisizione e analisi della citometria a flusso

1. Utilizzare il tubo di controllo non colorato per impostare i grafici di dispersione dell'area di dispersione diretta (FSC-A) e dell'area di dispersione laterale (SSC-A) in base alle dimensioni e alla complessità della popolazione cellulare analizzata. Vedere la Figura supplementare S2 per le impostazioni e i parametri del microscopio.
   NOTA: impostare controlli non colorati per i singoli tipi di celle.
2. Utilizzare i tubi di controllo antimacchia per selezionare i gate positivi e utilizzare tubi di controllo monocolore per compensare la sovrapposizione spettrale di fluorescenza tra MTG (fluoroforo-1 [FL-1]) e TMRE (FL-2) nella citometria a flusso multicolore. Utilizzare il controllo isotipo per il controllo negativo per monitorare la colorazione di sfondo nei campioni MRC e TFAM. Utilizzare il tubo FCCP come controllo di depolarizzazione per la colorazione TMRE.
3. Eliminare i detriti estranei per selezionare le celle vive e il gating principale dal grafico a dispersione anteriore e laterale (Figura 2A). Gate out doppiette utilizzando un grafico di densità FSC-A (FSC-H) rispetto a (vs.) FSC-A per escludere doppietti e costruire anche un'altezza di dispersione laterale (SSC-H) rispetto al grafico SSC-A (Figura 2A).
4. Acquisizione dati (citometro a flusso)
   1. Utilizzando i campioni non colorati o isotipi come controllo negativo, creare un gate sopra la popolazione principale degli eventi a cella singola durante la visualizzazione di SSC-A e dei vari filtri (FL1, FL2, FL3, FL4) (Figura 1B e Figura 2B).
5. Analisi dei dati (software CFlow)
   1. Copiare la posizione delle porte sui campioni di cellule colorate e registrare la quantità di cellule colorate positivamente per la colorazione positiva.
   2. Per ogni sottopopolazione cellulare, selezionare un grafico a istogramma e analizzare l'intensità mediana della fluorescenza (MFI) dei diversi canali filtranti (FL1, FL2, FL3, FL4) (asse x).
      1. Calcolare i livelli di TMRE sottraendo l'MFI di FL2 di #2 cellule trattate con FCCP dall'MFI di FL2 da #3 campioni colorati con TMRE in un istogramma, come in Eq (1) di seguito.
         Livelli di TMRE = MFI di FL2 da #3 campioni colorati con TMRE - MFI di FL2 di #2 cellule trattate con FCCP (1)
      2. Calcolare i valori specifici per MMP e ROS mitocondriale mediante MFI in TMRE o MitoSox Red, dividendo l'indicatore di volume mitocondriale MTG.
      3. Calcolare il valore specifico per la subunità complessa e la TFAM utilizzando MFI in espressione complessa o TFAM, dividendo l'indicatore di volume mitocondriale TOMM20.

Risultati

Una descrizione schematica del metodo di differenziazione e delle strategie citometriche a flusso è mostrata nella Figura 3. Le iPSC umane sono differenziate in rosette neurali e quindi sollevate in coltura di sospensione per la differenziazione in sfere neurali. Le sfere neurali sono ulteriormente differenziate e maturate in neuroni DA. Le sfere neurali sono dissociate in singole cellule per generare astrociti gliali, riplaccate in monostrati come NSC e quindi differenziate in astrociti. Q...

Discussione

Qui sono protocolli per generare neuroni e astrociti derivati da iPSC e valutare molteplici aspetti della funzione mitocondriale utilizzando la citometria a flusso. Questi protocolli consentono un'efficiente conversione delle iPSC umane sia in neuroni che in astrociti gliali e la caratterizzazione dettagliata della funzione mitocondriale, principalmente nelle cellule viventi. I protocolli forniscono anche una strategia basata sulla citometria a flusso di co-colorazione per l'acquisizione e l'analisi di più funzioni mito...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Oct4	Abcam	ab19857, RRID:AB_445175	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4	Abcam	ab16287, RRID:AB_778073	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2	Abcam	ab97959, RRID:AB_2341193	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6	Abcam	ab5790, RRID:AB_305110	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927, RRID:AB_627994	Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP	Abcam	ab4674, RRID:AB_304558	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442, RRID:AB_2722596	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1	Abcam	ab78078, RRID:AB_2256751	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin	Abcam	ab32127, RRID:AB_2286949	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95	Abcam	ab2723, RRID:AB_303248	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A	PeproTech	120-14E	Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium	Lonza	CC-3187	Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack	Lonza	CC-4123	Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF	PeproTech	450-02	DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer	BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0314	Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12103C	Medium ingredient
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31765027	Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human	Sigma-Aldrich	SRP3055	Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human	Sigma-Aldrich	I3769	Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	12660012	Basal medium for NSC culture
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048	Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1	Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement	Thermo Fisher Scientific	A10508-01	Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific	12604013	Cell dissociation reagent
Transferrin	Roche	652202	CDM ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE	Abcam	ab113852	Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA