Isolamento di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali per studi elettrofisiologici

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'isolamento acuto di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari vitali da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali (Danio rerio), adatti per studi elettrofisiologici.

Abstract

I pesci zebra sono stati a lungo utilizzati come organismo vertebrato modello nella ricerca cardiovascolare. Le difficoltà tecniche di isolare le singole cellule dai tessuti cardiovascolari del pesce zebra sono state limitanti nello studio delle loro proprietà elettrofisiologiche. Sono stati descritti metodi precedenti per la dissezione dei cuori di zebrafish e l'isolamento dei miociti cardiaci ventricolari. Tuttavia, l'isolamento dei miociti atriali e vascolari del pesce zebra per la caratterizzazione elettrofisiologica non è stato dettagliato. Questo lavoro descrive protocolli enzimatici nuovi e modificati che forniscono abitualmente cardiomiociti ventricolari e atriali giovanili e adulti isolati, nonché cellule di muscolo liscio vascolare (VSM) dall'arterioso bulboso, adatte per esperimenti patch-clamp. Non ci sono state prove letterarie di studi elettrofisiologici su tessuti cardiovascolari di zebrafish isolati negli stadi di sviluppo embrionale e larvale. Vengono dimostrate tecniche di dissociazione parziale che consentono esperimenti patch-clamp su singole cellule di cuori larvali ed embrionali.

Introduzione

I pesci zebra sono piccoli pesci teleostei che sono stati a lungo utilizzati come organismo vertebrato modello¹ e recentemente sono venuti alla ribalta come un sistema vertebrato vitale per lo screening ad alto rendimento di geni e farmaci ^2,3. Tuttavia, l'analisi fisiologica dei tessuti zebrafish non è ben sviluppata. Nel sistema cardiovascolare sono stati descritti metodi per la dissezione dei cuori di zebrafish⁴ e l'isolamento dei miociti cardiaci ventricolari ^5,6,7. Ci sono poche descrizioni dettagliate dell'efficace isolamento dei miociti atriali e nessuna segnalazione di preparazioni di muscolatura liscia vascolare (VSM) per studi patch-mord.

Il lavoro attuale descrive la metodologia per l'isolamento dei miociti cardiaci e vascolari del pesce zebra, praticabile per studi elettrofisiologici e funzionali. Questo approccio include modifiche dei protocolli precedentemente riportati per l'isolamento dei miociti ventricolari ^5,6 del pesce zebra e adatta i metodi dagli isolamenti delle cellule VSM dei mammiferi⁸, consentendo l'isolamento delle cellule muscolari lisce vascolari del pesce zebra dall'arterioso bulboso (BA). I protocolli si traducono in rese efficienti di cellule atriali, ventricolari e VSM isolate da zebrafish che possono essere utilizzate in modo affidabile negli studi patch-clamp per un massimo di 8 ore⁹.

Nonostante le loro larve quasi trasparenti si sviluppino interamente al di fuori dell'organismo parentale, esplorare il loro potenziale ontogenetico promesso nello studio dello sviluppo cardiovascolare è stato limitato dalle sfide nell'estrazione e nell'analisi dei tessuti in giovane età. L'articolo attuale affronta questa limitazione dimostrando esperimenti patch-clamp su cuori di zebrafish isolati già 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), utilizzando un metodo di estrazione adattato e pubblicato¹⁰.

Protocollo

Tutti i pesci zebra (ceppo AB di tipo selvatico, sia maschio che femmina) sono stati allevati, mantenuti e gestiti per gli esperimenti seguendo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Washington University (IACUC).

1. Isolamento dell'atrio, del ventricolo e dell'arterioso bulboso da zebrafish adulti, giovani e larvali

1. Eutanasia del pesce usando lo shock a freddo, cioè immergendolo in acqua a 4 °C, per ~10 s.
2. Usando una pinza curva, trasferire il pesce in una grande capsula di Petri parzialmente riempita con tampone di perfusione (PB) (Tabella 1) e metterli sotto un microscopio da dissezione.
   1. Decapitare il pesce appena posteriormente agli occhi, usando un paio di forbici.
3. Usando una pinza curva (pinza fine per pesci larvali), tenere il pesce nella mano non dominante con il lato ventrale rivolto verso il cannocchiale di dissezione. Con il secondo paio di pinze fini (o superfini per i pesci larvali) nella mano dominante, aprire delicatamente i muscoli pettorali e le pinne per rivelare i tessuti cardiovascolari (CV) (atrio, ventricolo e arterioso bulboso, BA) (Figura 1).
4. Posizionando la pinza fine nella mano dominante, tirare delicatamente il BA sulla punta intersecante del BA e dell'aorta ventrale.
   NOTA: Il BA e il cuore usciranno dalla cavità del corpo.
   1. Separare con cura il BA dall'aorta pizzicando la pinza e localizzando la punta dell'atrio in cui convergono più rami venosi (seno venoso). Usando la pinza fine, "strappare" la punta dell'atrio dal veleno sinusale. Questo isola i tessuti CV dal resto del corpo (Figura 1).

2. Dissociazione dei cardiomiociti dal pesce zebra adulto, giovanile e larvale per studi elettrofisiologici

1. Utilizzando la pinza fine, "strappare" l'atrio e il ventricolo dal tessuto CV isolato nella fase precedente.
   NOTA: Il processo consente una dissezione pulita di ciascun tessuto con una contaminazione incrociata minima e sembra simile a raccogliere frutta da un albero.
   1. Fai una leggera lacrima nel ventricolo usando una pinza fine per drenare il sangue in eccesso, che può essere assicurato quando il tessuto cardiaco diventa di colore salmone pallido dal rosso vivo.
2. Raggruppare l'atrio isolato e il ventricolo in provette da centrifuga separate da 1,5 mL contenenti tampone di perfusione (PB; 1,5 ml).
   NOTA: Per garantire una dissociazione efficace dei cardiomiociti atriali adulti (ACM) e dei cardiomiociti ventricolari (VCM), in genere sono necessari quattro atri e tre ventricoli. Nel caso del pesce zebra giovane (28-90 giorni), questo numero è raddoppiato.
   1. Nel caso del pesce zebra larvale (14-28 giorni), raccogliere più tessuto possibile da ~ 30 larve.
3. Sostituire il PB nelle provette con 750 μL di tampone di digestione (DB) (Tabella 1) ciascuno e posizionare i tubi su un termoshaker a 37 °C e 800 giri/min. Consentire la digestione dei tessuti fino a quando non diventano traslucidi (~30 min per gli atri e ~40 min per i ventricoli).
4. Terminare la digestione facendo ruotare delicatamente i tessuti in una mini centrifuga da banco (2.000 x g a temperatura ambiente) per 3-5 s e sostituire il DB surnatante con 750 μL di tampone di arresto (SB) ciascuno (Tabella 1).
   NOTA: questa fase di centrifugazione è facoltativa per l'isolamento VCM.
5. Incubare i tessuti pellettati nell'SB a temperatura ambiente per 15 minuti.
6. Sostituire delicatamente l'SB con 500-750 μL di PB ciascuno (a seconda della densità desiderata delle cellule finali) e triturare i tessuti (~30 volte) usando una pipetta Pasteur lucidata a fiamma per disperdere le cellule.
   NOTA: I cardiomiociti (CM) sono ora pronti per gli studi elettrofisiologici e conservati a temperatura ambiente fino a 8 ore.
7. Per un campionamento uniforme, pipettare delicatamente le cellule su e giù un paio di volte per risospendere prima di aggiungerne una goccia per gli studi corrispondenti.

3. Dissociazione di cellule di muscolatura liscia vascolare (VSM) da zebrafish adulti e giovani per studi elettrofisiologici

1. Prelevare l'arterioso bulboso (BA) dai tessuti CV utilizzando lo stesso approccio della fase 2.1 e raggruppare cinque BA adulti in una provetta da centrifuga da 1,5 mL contenente tampone S1 (1,5 ml) (Tabella 2). Nel caso del novellame di zebrafish, raggruppare dieci BA e, per le larve di età superiore alle 2 settimane, raggruppare 30-40 BA.
   NOTA: Non è praticamente possibile isolare le cellule VSM dalle larve di zebrafish di età inferiore alle 2 settimane.
2. Sostituire S1 con 400 μL di tampone S2 (Tabella 2) e consentire alla papaina (vedi Tabella dei materiali) la digestione dei BA su un termoshaker a 37 °C e 800 giri/min per ~20 minuti.
3. Lasciare sedimentare i BA parzialmente digeriti per 1 minuto e sostituire il surnatante S2 con 500 μL di tampone S3 (Tabella 2) contenente collagenasi. Digerire i tessuti su un termoshaker a 37 °C e 800 giri/min per 3-5 min.
4. Terminare la digestione facendo ruotare delicatamente i tessuti in una mini centrifuga da banco (2.000 x g a temperatura ambiente) per 3-5 s e sostituendo il surnatante S3 con 500 μL di S1.
5. Triturare delicatamente i tessuti pellettati (~ 15 volte) per disperdere le cellule VSM e placcarli su vetrini di dimensioni appropriate.
   NOTA: La dimensione del coverslip è determinata dalla dimensione della camera di registrazione patch-clamp , in questo caso è stato utilizzato 5 x 5 mm).
   1. Tenere i coprivetrini a temperatura ambiente per 30 minuti affinché le celle possano attaccarle e utilizzarle entro le successive 6 ore.

4. Isolamento di cuori da zebrafish embrionale per studi elettrofisiologici

1. Aggiungere tricaina (150 mg/L; 1 ml per capsula di Petri da 100 mm x 20 mm) a ~300 embrioni (2-5 dpf), raccolti dalle loro condizioni di incubazione (Figura 2A).
   1. Concentrare gli embrioni anestetizzati trasferendoli in una provetta da centrifuga da 5 mL utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovendo il mezzo in eccesso (E3) dalla provetta della centrifuga (Figura 2B).
2. Lavare gli embrioni con 3 ml di tampone di perfusione fredda (PB) due volte e risospendere in 2 ml di PB (Figura 2B).
3. Utilizzando l'apparato embrionale di isolamento cardiaco (Figura 2C), aspirare ~1 mL degli embrioni nell'ago della siringa ed espellerli immediatamente nel tubo. Ripetere questo processo 30 volte, ad una velocità di 1 s per movimento della siringa (Figura 2C).
4. Far passare gli embrioni frammentati attraverso un setaccio a filtro cellulare da 100 μm posto in un imbuto e raccogliere i cuori filtrati in un'altra provetta da centrifuga da 5 ml. Risciacquare la siringa con 1 mL di PB e raccogliere anche questo risciacquo nel tubo attraverso il setaccio (Figura 2C).
5. Mescolare bene e separare in provette da centrifuga da 1,5 ml, ciascuna delle quali contiene 1 mL del contenuto. Centrifugare tutti i tubi su una mini centrifuga da banco per 5 s (2.000 x g a temperatura ambiente) e scartare i surnatanti
6. Effettuare la risospensione seriale dei pellet nei tubi utilizzando 1 mL di PB, cioè risospendere il pellet in un tubo utilizzando 1 mL di PB e utilizzare quel PB risospeso per risospendere il pellet nel tubo successivo.
7. Pipettare delicatamente i cuori su e giù due volte prima di aggiungerne una goccia per gli studi corrispondenti.

5. Studi patch-clamp su cellule cardiovascolari isolate

NOTA: Le registrazioni di patch-clamp inside-out e dell'intera cellula dalle cellule isolate possono essere ottenute come precedentemente riportato per le correnti del canale K_ATP nella cardiovascolarizzazione del pesce zebra⁹.

1. Per i cardiomiociti adulti e giovanili, aggiungere le cellule dissociate (dal punto 2) direttamente alla camera di registrazione dalla sospensione. Per le celle VSM, inserire il coprislip contenente le celle VSM placcate (dal punto 3) nella camera di registrazione.
2. Aggiungere cuori embrionali intatti isolati (dal passaggio 4) alla camera dalla sospensione e fare registrazioni patch-clamp dai miociti epicardici (Figura 2D).

Risultati

I suddetti protocolli forniscono in modo affidabile e di routine sufficienti miociti cardiaci e vascolari di qualità costante suscettibili di studi patch-clamp come recentemente riportato in studi approfonditi sui canali del potassio (K ATP) sensibili_all'ATP nella cardiovascolarizzazione del pesce zebra wild-type e mutante⁹. Tracce rappresentative di registrazioni di tale attività del canale K_ATP da cardiomiociti isolati sono mostrate nella Figura 3A-C<...

Discussione

I precedenti metodi per isolare i miociti ventricolari ^5,6 del pesce zebra, volti a generare miociti per studi di coltura o elettrofisiologici, hanno fornito cellule di resa inferiore e hanno comportato lunghi passaggi di centrifugazioni multiple che hanno influito negativamente sulla qualità e sulla vitalità cellulare. I protocolli qui descritti sono affidabili, coprono ciascuno dei tessuti cardiovascolari significativi (ventricolo, atri e VSM) e, soprattutto,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tubes	Eppendorf	22364111
10 mL Syringe	Fisher Scientific	14-955-459
19 Guage Needle	BD	305187
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
5 mL Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	EP0030119479	For embryonic heart isolation
Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer	Molecular Devices		Used for action potential recordings
Benchtop Mini Centrifuge	Southern Labware	MLX-106
Blebbistatin	Sigma-Aldrich	203390
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
Cell-Strainer Sieve	Cole-Parmer	EW-06336-71	100 μm sieve for embryonic heart isolation
Collagenase Type H	Sigma-Aldrich	C8051
Collagenase Type II	Worthington	LS004176
Collagenase Type IV	Worthington	LS004188
Curved Forceps	Fisher Scientific	16-100-110
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EGTA	Sigma-Aldrich	324626
Elastase	Worthington	LS003118
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442
Fine Forceps	Dumont	Style #5	Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643
K2ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Large Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5981	For dissociation
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Kimble Chase	41A2502	Soda lime glass for patch pipettes
Papain	Worthington	LS003118
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-6A
Petri Dish	Sigma-Aldrich	P5606	100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	806552
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Scissors	Fine Science Tools	14090-09	For adult and juvenile zebrafish decapitation
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Super Fine Forceps	Dumont	Style #SF	For isolating larval CV tissues (Need two)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Thermoshaker	ThermoFisher Scientific	13687711
Tricaine Methanesulfonate (MS222)			For anaesthetizing zebrafish larvae
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T6522