Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

Riepilogo

Qui, descriviamo la costruzione di mutanti nulli di Aeromonas in specifiche glicosiltransferasi o regioni contenenti glicosiltransferasi, i saggi di motilità e la purificazione dei flagelli eseguiti per stabilire il coinvolgimento e la funzione dei loro enzimi codificati nella biosintesi di un glicano, nonché il ruolo di questo glicano nella patogenesi batterica.

Abstract

Lo studio della glicosilazione nei procarioti è un'area in rapida crescita. I batteri ospitano diverse strutture glicosilate sulla loro superficie i cui glicani costituiscono un codice a barre specifico del ceppo. I glicani associati mostrano una maggiore diversità nella composizione e nella struttura dello zucchero rispetto a quelli degli eucarioti e sono importanti nei processi di riconoscimento batterico-ospite e nell'interazione con l'ambiente. Nei batteri patogeni, le glicoproteine sono state coinvolte in diverse fasi del processo infettivo e le modificazioni del glicano possono interferire con le funzioni specifiche delle glicoproteine. Tuttavia, nonostante i progressi compiuti nella comprensione della composizione, della struttura e delle vie di biosintesi del glicano, la comprensione del ruolo delle glicoproteine nella patogenicità o nell'interazione con l'ambiente rimane molto limitata. Inoltre, in alcuni batteri, gli enzimi necessari per la glicosilazione proteica sono condivisi con altre vie biosintetiche dei polisaccaridi, come il lipopolisaccaride e le vie biosintetiche delle capsule. L'importanza funzionale della glicosilazione è stata chiarita in diversi batteri attraverso la mutazione di geni specifici ritenuti coinvolti nel processo di glicosilazione e lo studio del suo impatto sull'espressione della glicoproteina bersaglio e del glicano modificante. Gli Aeromonas mesofili hanno un flagello polare singolo e O-glicosilato. I glicani flagellari mostrano diversità nella composizione dei carboidrati e nella lunghezza della catena tra i ceppi di Aeromonas . Tuttavia, tutti i ceppi analizzati fino ad oggi mostrano un derivato dell'acido pseudaminico come lo zucchero di collegamento che modifica i residui di serina o treonina. Il derivato dell'acido pseudaminico è necessario per l'assemblaggio dei flagelli polari e la sua perdita ha un impatto sull'adesione, sulla formazione di biofilm e sulla colonizzazione. Il protocollo dettagliato in questo articolo descrive come la costruzione di mutanti nulli può essere utilizzata per comprendere il coinvolgimento di geni o regioni del genoma contenenti glicosiltransferasi putative nella biosintesi di un glicano flagellare. Ciò include il potenziale per comprendere la funzione delle glicosiltransferasi coinvolte e il ruolo del glicano. Ciò sarà ottenuto confrontando il mutante carente di glicano con il ceppo wild-type.

Introduzione

La glicosilazione proteica è stata descritta sia nei batteri Gram-positivi che gram-negativi e consiste nell'attaccamento covalente di un glicano a una catena laterale di amminoacidi ^1,2. Nei procarioti, questo processo di solito avviene attraverso due principali meccanismi enzimatici: O- e N-glicosilazione ³. Nella O-glicosilazione, il glicano è attaccato al gruppo ossidrile di un residuo di serina (Ser) o treonina (Thr). Nella N-glicosilazione, il glicano è attaccato all'azoto ammidico della catena laterale di un residuo di asparagina (Asn) all'interno delle sequenze tripeptidiche Asn-X-Ser/Thr, dove X potrebbe essere qualsiasi amminoacido tranne la prolina.

I glicani possono adottare strutture lineari o ramificate e sono composti da monosaccaridi o polisaccaridi legati covalentemente da legami glicosidici. Nei procarioti, i glicani di solito mostrano diversità nella composizione e nella struttura dello zucchero rispetto ai glicani eucariotici⁴. Inoltre, sono state descritte due diverse vie di glicosilazione batterica che differiscono nel modo in cui il glicano viene assemblato e trasferito alla proteina accettore: glicosilazione sequenziale e in blocco ^5,6. Per la glicosilazione sequenziale, il glicano complesso viene costruito direttamente sulla proteina mediante successiva aggiunta di monosaccaridi. Nella glicosilazione in blocco, un glicano preassemblato viene trasferito alla proteina da un oligosaccaride legato ai lipidi da una oligosaccarilstransferasi specializzata (OTasi). Entrambe le vie hanno dimostrato di essere coinvolte nei processi di N- e O-glicosilazione ⁷.

La glicosilazione proteica ha un ruolo nella modulazione delle proprietà fisico-chimiche e biologiche delle proteine. La presenza di un glicano può influenzare il modo in cui la proteina interagisce con il suo ligando, che influenza l'attività biologica della proteina, ma può anche influenzare la stabilità proteica, la solubilità, la suscettibilità alla proteolisi, l'immunogenicità e le interazioni microbo-ospite ^8,9. Tuttavia, diversi parametri di glicosilazione, come il numero di glicani, la composizione del glicano, la posizione e il meccanismo di attaccamento, potrebbero anche influenzare la funzione e la struttura delle proteine.

Le glicosiltransferasi (GT) sono gli enzimi chiave nella biosintesi di glicani complessi e glicoconiugati. Questi enzimi catalizzano la formazione del legame glicosidico tra una porzione di zucchero da una molecola di donatore attivata e uno specifico accettore di substrato. I GT possono utilizzare sia nucleotidi che non nucleotidi come molecole donatrici e colpire diversi accettori di substrato, come proteine, saccaridi, acidi nucleici e lipidi¹⁰. Pertanto, comprendere le GT a livello molecolare è importante per identificare i loro meccanismi d'azione e specificità, e consente anche di capire come la composizione zuccherina dei glicani che modificano le molecole rilevanti sia correlata alla patogenicità. Il database degli enzimi Carboidrati Attivi (CAZy)¹¹ classifica i GT in base alla loro omologia di sequenza, che fornisce uno strumento predittivo poiché, nella maggior parte delle famiglie GT, la piega strutturale e i meccanismi d'azione sono invarianti. Tuttavia, quattro ragioni rendono difficile prevedere la specificità del substrato di molti GT: 1) nessun chiaro motivo di sequenza che determini la specificità del substrato è stato determinato nei procarioti¹², 2) molte GT e OT mostrano promiscuità del substrato^13,14, 3) le GT funzionali sono difficili da produrre ad alta resa in forma ricombinante e 4) l'identificazione dei substrati sia del donatore che dell'accettore è complessa. Nonostante ciò, recenti studi di mutagenesi hanno permesso di ottenere progressi significativi nella comprensione dei meccanismi catalitici e di sottrarre il legame delle GT.

Nei batteri, l'O-glicosilazione sembra essere più diffusa della N-glicosilazione. I siti di O-glicosilazione non mostrano una sequenza di consenso e molte delle proteine O-glicosilate sono secrete o proteine della superficie cellulare, come flagelline, pili o autotrasportatori¹. La glicosilazione della flagellina mostra variabilità nel numero di siti accettori, nella composizione e nella struttura del glicano. Ad esempio, Burkholderia spp flagellins ha un solo sito accettore, mentre in Campylobacter jejuni, flagellins ha ben 19 siti accettori^15,16. Inoltre, per alcuni batteri, il glicano è un singolo monosaccaride, mentre altri batteri possiedono glicani eterogenei compromessi da diversi monosaccaridi per formare oligosaccaridi. Questa eterogeneità si verifica anche tra ceppi della stessa specie. Le flagelline di Helicobacter sono modificate solo dall'acido pseudaminico (PseAc)¹⁷ e le flagelline di Campylobacter possono essere modificate da PseAc, la forma acetamidino dell'acido pseudaminico (PseAm) o dell'acido legionaminico (LegAm), e dai glicani derivati da questi zuccheri con acetil, N-acetilglucosamina o sostituzioni propioniche ^18,19. In Aeromonas, le flagelline sono modificate dai glicani la cui composizione varia da un singolo derivato dell'acido PseAc a un eteropolisaccaride²⁰, e l'attaccamento dei glicani ai monomeri della flagellina avviene sempre tramite un derivato PseAc.

In generale, la glicosilazione delle flagelline è essenziale per l'assemblaggio del filamento flagellare, la motilità, la virulenza e la specificità dell'ospite. Tuttavia, mentre flagellins di C. jejuni¹⁶, H. pylori^{17 e} Aeromonas sp. ²¹ non può essere assemblato in filamento a meno che i monomeri proteici non siano glicosilati, Pseudomonas spp. e Burkholderia spp. ¹⁵ non richiedono glicosilazione per l'assemblaggio dei flagelli. Inoltre, in alcuni ceppi di C. jejuni, i cambiamenti nella composizione zuccherina del glicano flagello influenzano l'interazione batterico-ospite e possono svolgere un ruolo nell'eludere alcune risposte immunitarie¹⁶. L'autoagglutinazione è un'altra caratteristica fenotipica influenzata dalle modifiche nella composizione dei glicani associati alle flagelline. Una minore autoagglutinazione porta ad una riduzione della capacità di formare microcolonie e biofilm²². In alcuni batteri, la capacità dei flagelli di innescare una risposta pro-infiammatoria era legata alla glicosilazione della flagellina. Pertanto, in P. aeruginosa, la flagellina glicosilata induce una risposta pro-infiammatoria più elevata rispetto a²³ non glicosilata.

Aeromonas sono batteri Gram-negativi onnipresenti nell'ambiente, che consente loro di essere all'interfaccia di tutti i componenti One Health ²⁴. Gli Aeromonas mesofili hanno un singolo flagello polare, che è prodotto costitutivamente. Più della metà degli isolati clinici esprime anche flagellina laterale, inducibile in mezzi o piastre ad alta viscosità. Diversi studi hanno correlato entrambi i tipi di flagelli con le prime fasi della patogenesi batterica²⁵. Mentre le flagelline polari riportate fino ad oggi sono O-glicosilate a 5-8 residui di Ser o Thr dei suoi domini immunogenici centrali, le flagelline laterali non sono O-glicosilate in tutti i ceppi. Sebbene i glicani flagella polari di diversi ceppi mostrino diversità nella loro composizione di carboidrati e lunghezza della catena²⁰, lo zucchero di collegamento ha dimostrato di essere un derivato dell'acido pseudaminico.

L'obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere un metodo per ottenere mutanti nulli in specifici GT o regioni cromosomiche contenenti GT per analizzare il loro coinvolgimento nella biosintesi di polisaccaridi rilevanti e nella patogenicità batterica, nonché il ruolo del glicano stesso. Ad esempio, identifichiamo ed eliminiamo una regione cromosomica contenente GT di Aeromonas per stabilire il suo coinvolgimento nella glicosilazione della flagellina polare e analizzare il ruolo del glicano flagellino. Mostriamo come eliminare un GT specifico per stabilirne la funzione nella biosintesi di questo glicano e il ruolo del glicano modificato. Sebbene si utilizzi Aeromonas come esempio, il principio può essere utilizzato per identificare e studiare le isole di glicosilazione dei flagelli di altri batteri Gram-negativi e analizzare la funzione dei GT coinvolti nella biosintesi di altri glicani come il lipopolisaccaride dell'antigene O.

Protocollo

La rappresentazione schematica della procedura è illustrata nella Figura 1.

1. Identificazione bioinformatica dell'isola di glicosilazione dei flagelli (FGI) in Aeromonas

1. Per identificare i cluster biosintetici PseAc nei genomi di Aeromonas , utilizzare lo strumento tblastn dal database NCBI²⁶. In primo luogo, recuperare le proteine ortologhe a PseC e PseI di A. piscicola AH-3 (i codici di identificazione sono OCA61126.1 e OCA61113.1) dai database dei ceppi di Aeromonas sequenziati, quindi utilizzare lo strumento tblastn per cercare le loro sequenze nucleotidiche tradotte.
   NOTA: I geni pse affiancano gli Aeromonas FGIs, con pseB e pseC situati a un'estremità del cluster e pseI all'altra estremità. La posizione del resto dei geni pse può essere diversa da un gruppo FGI all'altro.
2. Dato che quei geni flagellina polari di molti ceppi sono adiacenti alle FGI, usa la tblastna dal database NCBI per trovare proteine ortologhe alle flagelline polari FlaA e FlaB di A. piscicola AH-3 (i codici di identificazione sono OCA61104.1 e OCA61105.1) e ai geni che li codificano.
3. Inoltre, aeromonas FGIs coinvolti nella biosintesi dei glicani eteropolisaccaridici (gruppo II)²⁷ contengono diversi geni che codificano per gli enzimi coinvolti nella sintesi degli acidi grassi, come luxC e luxE. Usa la tblastna dal database NCBI per trovare proteine ortologhe a LuxC di A. piscicola AH-3 (il codice identificativo è OCA61121.1) e il gene che la codifica.

2. Generazione di mutanti nulli nei geni dell'isola di glicosilazione dei flagelli

NOTA: Questo metodo di mutagenesi si basa sullo scambio allelico di prodotti di delezione in-frame della reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando il vettore suicida pDM4²⁸ (GenBank: KC795686.1). La replicazione del vettore pDM4 è lambda pir dipendente e lo scambio allelico completo è forzato utilizzando il gene sacB situato sul vettore.

1. Costruzione di prodotti di cancellazione PCR in-frame.
   1. Progettare due coppie di primer che amplifichino le regioni del DNA a monte (primer A e B) e a valle (primer C e D) del gene o della regione selezionata da eliminare (Figura 2B).
   2. Assicurarsi che i Primer A e D abbiano più di 600 bp a monte dall'inizio e a valle dell'arresto, rispettivamente, del gene o dei geni da eliminare. Questi due primer devono includere all'estremità 5' un sito di restrizione per un'endonucleasi che consenta la clonazione in pDM4.
      NOTA: il sito di restrizione incluso all'estremità 5' dei primer A e D non deve essere lo stesso dei siti all'interno di ampliconi AB o CD.
   3. Assicurarsi che i Primer B e C siano all'interno del gene da eliminare o all'interno del primo e dell'ultimo gene, rispettivamente, della regione da eliminare. Assicurarsi che entrambi i primer (B e C) siano in-frame e situati tra 5-6 codoni all'interno del gene. Inoltre, assicurarsi che entrambi i primer includano all'estremità 5' una sequenza complementare di 21 bp (Tabella 1) che consenta di unire gli ampliconi del DNA AB e CD.
   4. Coltivare il ceppo Aeromonas selezionato in 5 mL di brodo di soia triptico (TSB) durante la notte (O/N) a 30 °C. Utilizzare un kit disponibile in commercio per la purificazione del DNA genomico e seguire le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Quantificare 2 μL del DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro.
      NOTA: Utilizzare acqua doppia distillata come un bianco, con lo strumento impostato per registrare l'assorbanza a 260 nm. Registra l'assorbanza con 2 μL di DNA purificato 3-5 volte e calcola una lettura media dell'assorbanza. Usa la legge di Beer-Lambert per calcolare la concentrazione di DNA, dove A = Ɛ.c.l. in cui "A" è assorbanza, "Ɛ" è il coefficiente di estinzione medio molare per il DNA, "c" è la concentrazione di DNA e "l" è la lunghezza del percorso (fare riferimento alle istruzioni del produttore per la lunghezza del percorso di ogni strumento).
   5. Utilizzare 100 ng di DNA cromosomico purificato come modello in due serie di PCR asimmetriche con primer A-B e C-D (Table of Materials). Utilizzare un rapporto molare 10:1 delle coppie di primer A:B e D:C (Materiale supplementare).
      NOTA: le PCR asimmetriche consentono l'amplificazione preferenziale di un filamento del modello più dell'altro.
   6. Analizzare i prodotti PCR mediante elettroforesi in un gel di agarosio all'1%. Utilizzare TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) come buffer di funzionamento del gel e un'impostazione di potenza di 8 V / cm. Per visualizzare il DNA, aggiungere bromuro di etidio (0,5 μg / mL) al gel e visualizzare i prodotti PCR utilizzando una stazione di bio-imaging (Tabella dei materiali).
   7. Asportare gli ampliconi dal gel con un bisturi, purificarli seguendo il protocollo del produttore (Tabella dei materiali) e quantificarli.
   8. Unire gli ampliconi AB e CD con le loro sequenze sovrapposte di 21 bp nella fine 3' dei prodotti PCR (Figura 3). Mescolare 100 ng di ogni amplicon (AB e CD) in un tubo PCR con reagenti PCR (pre-AD PCR), ma senza primer, ed estendere utilizzando il programma termociclatore (materiale supplementare). Quindi, aggiungere 100 μM di primer A e D alla reazione (AD PCR) e amplificare come un singolo frammento (materiale supplementare).
   9. Analizzare il prodotto PCR (AD amplicon) mediante elettroforesi in un gel di agarosio all'1% utilizzando le condizioni descritte al punto 2.1.6, asportare l'amplicon dal gel, purificare seguendo il protocollo del produttore e quantificare l'amplicon (Tabella dei materiali).
2. Costruzione del plasmide ricombinante pDM4 con delezione in-frame.
   1. Coltivare una coltura O/N di Escherichia coli cc18λ pir contenente pDM4 in brodo di Luria-Bertani (LB) Miller (10 mL) con cloramfenicolo (25 μg/mL) a 30 °C.
   2. Girare la coltura a 5.000 x g a 4 °C e sospendere il pellet in 600 μL di acqua distillata sterile. Eseguire l'estrazione e la purificazione del plasmide pDM4 utilizzando un kit di purificazione del plasmide disponibile in commercio, seguendo le istruzioni del fornitore (Tabella dei materiali).
   3. Digerire 1 μg di pDM4 e 400 ng di AMPLICON AD per 2 ore con un'endonucleasi in grado di digerire entrambe le estremità dell'amplicon AD e del sito di clonazione di pDM4 (Figura 3). Seguire il protocollo del produttore dell'enzima per le condizioni di reazione (Tabella dei materiali).
   4. Pulire il plasmide e l'amplicon digeriti utilizzando un kit di purificazione del DNA e quantificarli seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
   5. Per evitare la rilegabilità del pDM4 linearizzato, rimuovere il gruppo fosfato da entrambe le estremità 5' utilizzando l'enzima fosfatasi alcalina seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Quindi, pulire il plasmide trattato e quantificarlo utilizzando uno spettrofotometro come descritto nel passaggio 2.1.4 (Tabella dei materiali).
   6. Combinare 150 ng di pDM4 alcalino trattato con fosfatasi e fosfatasi con 95-100 ng di amplicone AD digerito in un rapporto vettore molare/inserto di 1:4. Preparare la reazione di legatura in un volume di 15 μL, seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
   7. Incubare O/N a 20 °C o durante il fine settimana a 4 °C. Dopo l'incubazione, inattivare la T4 ligasi a 70 °C per 20 min.
   8. Utilizzare la legatura per introdurre il plasmide nel ceppo Escherichia coli MC1061λpir mediante elettroporazione. Utilizzare batteri elettrocompetenti e cuvette elettroporatorie a 2 mm di gap.
3. Preparazione di E. coli elettrocompetente ed elettroporazione di plasmide ricombinante pDM4
   1. Inoculare una singola colonia di E. coli MC1061ceppo λpir in brodo Luria-Bertani (LB) Miller e coltivare O/N a 30 °C con scuotimento a 200 giri/min.
   2. Diluire 2 mL della coltura batterica in 18 mL di brodo LB e incubare a 30 °C con agitazione (200 rpm) fino a raggiungere una densità ottica (OD₆₀₀) compresa tra 0,4-0,6.
   3. Pellet la coltura batterica mediante centrifugazione a 5.000 x g e 4 °C per 15 min. Scartare il surnatante e sospendere il pellet in 40 ml di H₂O distillato refrigerato.
   4. Ripetere questa fase di pulizia altre due volte per rimuovere tutti i sali di coltura. Infine, sospendere il pellet in 4 mL di H₂O distillato refrigerato e trasferire 1 mL della sospensione a ciascuno dei quattro tubi conici da 1,5 mL di microfuga.
   5. Pellet la coltura batterica mediante centrifugazione a 14.000 x g e 4 °C per 5 min. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e sospendere ogni pellet in 100 μL di H₂O distillato refrigerato.
   6. Aggiungere 3-3,5 μL della miscela di legatura a ciascun tubo e incubare sul ghiaccio per 5 minuti. Quindi, trasferire il contenuto di ciascun tubo in una cuvetta elettroporatoria refrigerata da 2 mm e applicare 2 kV, 129 Ω e una costante di tempo intorno ai 5 ms.
      NOTA: Pre-raffreddare le cuvette elettroporatrici sul ghiaccio. Mantenere i batteri sul ghiaccio durante l'intera procedura.
   7. Dopo l'elettroporazione, aggiungere 250 μL di mezzo SOC a ciascuna delle quattro cuvette per recuperare il loro contenuto, trasferirle in un tubo di coltura (circa 1 mL) e incubare per 1 ora a 30 °C con agitazione (200 rpm).
   8. Placcare le cellule trasformate su piastre di agar Luria-Bertani (LB) integrate con cloramfenicolo (25 μg/mL) per garantire che tutte le colonie che crescono nella piastra abbiano la spina dorsale plasmidica.
   9. Prelevare alcune colonie dalle piastre di agar LB con cloramfenicolo e incubare O/N a 30 °C. Quando le colonie crescono, controllare l'inserimento del costrutto di cancellazione in pDM4 mediante PCR utilizzando primer che fiancheggiano il lato di clonazione pDM4: pDM4for e pDM4rev (Tabella 1) e colonie lisate come modello (Materiale supplementare).
   10. Scegli una colonia con uno stuzzicadenti sterile e immergila in un tubo da 1,5 mL contenente 15 μL di Triton X-100 all'1%, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA pH 8,0. Incubare i tubi a 100 °C per 5 minuti e poi 1 minuto sul ghiaccio.
   11. Ruotare i tubi in un microfugio a 12.000 x g per 10 minuti per pellettare batteri e detriti. Utilizzare 1 μL del surnatante come modello nella reazione PCR (Tabella dei materiali). La temperatura di ricottura della coppia di primer è di 50 °C e la reazione PCR richiede il 10% di DMSO (materiale supplementare).
   12. Inoculare le colonie che hanno amplificato il prodotto di interesse in 10 ml di brodo LB con cloramfenicolo (25 μg/mL) e crescere O/N a 30 °C. Estrarre il plasmide dalle colture come descritto ai passaggi 2.2.1-2.2.2. Sequenziare utilizzando i primer pDM4 seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
4. Trasferimento dell'eliminazione all'interno del frame al Aeromonas sforzo
   NOTA: Il plasmide ricombinante pDM4 deve essere introdotto nel Aeromonas ceppo per accoppiamento triparentale (Figura 4). Aeromonas il ceppo deve essere resistente alla rifampicina per essere selezionato dopo l'accoppiamento triparentale. Pertanto, coltivare i ceppi selezionati O/ N su TSB a 30 °C, centrifugare 2 mL, 4 mL e 6 mL di colture a 5.000 x g per 15 min, sospendere ogni pellet in 100 μL di TSB e piastra in TSA con rifampicina (100 μg/mL).
   1. Preparare colture O/N di E. coli MC1061λpir con il plasmide ricombinante pDM4 su LB agar con cloramfenicolo 25 μg/mL (ceppo donatore), il ceppo Aeromonas resistente alla rifampicina su TSA con rifampicina 100 μg/mL (ceppo ricevente) e l'E. coli HB101 con il plasmide pRK2073 su LB agar con spectinomicina 80 μg/mL (ceppo helper) a 30 °C.
   2. Quando le colonie sono cresciute, sospendere delicatamente lo stesso numero di colonie (10-15 colonie) dei ceppi donatore, ricevente e aiutante con uno stuzzicadenti sterile in tre tubi LB con 150 μL di LB.
   3. Quindi, su una piastra di agar LB, senza antibiotici, mescolare le tre sospensioni batteriche in due gocce in un ricevente: helper: rapporto donatore di 5: 1: 1 (50 μL di ricevente, 10 μL del donatore e 10 μL di aiutante). Incubare la piastra rivolta verso l'alto O/N a 30 °C. Eseguire il controllo negativo della coniugazione utilizzando il ceppo donatore senza plasmide ricombinante.
      NOTA: Il ceppo helper trasporta il plasmide coniugativo pRK2073 e assiste il trasferimento del pDM4 nell'Aeromonas. Non usare vortex per sospendere i ceppi del donatore, del ricevente e dell'aiutante per evitare di rompere il pili.
   4. Raccogli i batteri dalla piastra di agar LB aggiungendo 1 mL di brodo LB e spalmandolo con uno spandivetro sterile per ottenere una sospensione batterica. Utilizzare una pipetta per trasferire vigorosamente la sospensione batterica in un tubo conico da 1,5 mL di microfuga e vortice.
   5. Per selezionare le colonie riceventi contenenti il plasmide ricombinante pDM4, piastra 100 μL della sospensione batterica raccolta su piastre lb agar con rifampicina (100 μg/mL) e cloramfenicolo (25 μg/mL).
   6. Girare verso il basso 200 μL e 600 μL dei campioni in un microfugo a 5.000 x g per 15 min, sospendere il pellet in 100 μL di brodo LB e piastra su LB agar con rifampicina (100 μg/mL) e cloramfenicolo (25 μg/mL). Incubare tutte le piastre per 24-48 ore a 30 °C.
   7. Prelevare le colonie coltivate, trasferirle in piastre LB con rifampicina (100 μg/mL) e cloramfenicolo (25 μg/mL) e incubarle O/N a 30 °C. Quindi, confermare che le colonie sono Aeromonas dal test ossidasi²⁹ e che il plasmide ricombinante pDM4 è stato inserito (prima ricombinazione) nella regione cromosomica specifica mediante PCR utilizzando i primer E e F (Materiale supplementare), che si legano al di fuori della regione amplificati con i primer A e D (Tabella dei materiali). Come descritto nel passaggio 2.3.11, utilizzare 1 μL di colonie lisate come modello.
   8. Per completare lo scambio allelico per la delezione in-frame, costringere le colonie con il plasmide suicida integrato a una seconda ricombinazione. Coltivare le colonie ricombinanti in 2 ml di LB con il 10% di saccarosio e senza antibiotici, O/N a 30 °C.
   9. Piastra 100 μL delle colture batteriche dal passo 2.4.8 su piastra lb agar con saccarosio (10%). Inoltre, piastra 100 μL di diverse diluizioni di coltura (10-2-10-4) e incubare O/N a 30 °C.
   10. Per confermare la perdita di pDM4, prelevare le colonie, trasferirle in piastre LB con e senza cloramfenicolo (25 μg/mL), incubarle O/N a 30 °C, quindi selezionare le colonie sensibili al cloramfenicolo.
   11. Analizzare le colonie sensibili mediante PCR utilizzando la coppia di primer E-F e 1 μL di colonie lisate come modello (Tabella dei materiali e materiale supplementare). Selezionare le colonie il cui prodotto PCR è correlato alla dimensione del costrutto eliminato.

3. Saggi di motilità

NOTA: In alcune specie batteriche con flagelli glicosilati, le modifiche nei livelli di glicosilazione o composizione glicanica influenzano l'assemblaggio delle flagelline, che di solito si riflette come una riduzione della motilità o assenza di motilità. Pertanto, sono stati eseguiti due saggi di motilità con i mutanti nulli.

1. Saggio di motilità in mezzi liquidi
   1. La coltura Aeromonas filtra O/N in 1 mL di TSB a 25-30 °C. Per far aderire un vetrino di copertura del microscopio a un vetrino scavato, raccogliere una piccola quantità di silicone con la punta di uno stuzzicadenti e mettere una piccola goccia sui quattro angoli del vetrino di copertura. Quindi, depositare 1 μL della coltura Aeromonas al centro della diapositiva di copertura e mescolare in una goccia di mezzo TSB fresco (2 μL).
   2. Posizionare una diapositiva scavata sulla diapositiva di copertura. Abbina lo scavo con la goccia depositata, premi delicatamente e capovolgi la diapositiva.
   3. Analizza la motilità del nuoto al microscopio ottico utilizzando un microscopio ottico (Table of Materials) con un obiettivo 100x utilizzando olio ad immersione.
      NOTA: Il ceppo wild-type di Aeromonas deve essere utilizzato come controllo positivo. Come controllo negativo, utilizzare un batterio non flagellato come Klebsiella.
2. Saggio di motilità in mezzi semisolidi
   1. La coltura Aeromonas filtra O/N in TSB (1 mL) a 25-30 °C. Quindi, trasferire 3 μL della coltura sul centro di una piastra di agar morbida (1% triptone, 0,5% NaCl, 0,25% bacto agar) e incubare la piastra rivolta verso l'alto O/N a 25-30 °C.
   2. Usando un righello, misurare la migrazione batterica attraverso l'agar dal centro della piastra verso la periferia.

4. Purificazione dei flagelli

1. Isolamento dei flagelli ancorati alla superficie batterica
   1. La coltura Aeromonas filtra O/N in TSB (10 mL) a 25-30 °C. Quindi, espandere la coltura in un pallone con TSB (900 ml) e lasciarlo crescere O / N a 25-30 ° C con agitazione (200 giri / min).
   2. Centrifugare a 5.000 x g per 20 min a 4 °C. Sospendere il pellet in 20 mL di tampone Tris-HCl da 100 mM (pH 7,8).
   3. Per rimuovere i flagelli ancorati, tagliare la sospensione in un vortice con una barra di vetro (diametro 2-3 mm) per 3-4 minuti, quindi passare ripetutamente (minimo sei volte) attraverso una siringa da 21 G.
   4. Batteri del pellet da due centrifugazioni consecutive a 4 °C: in primo luogo, a 8.000 x g per 30 min. Rimuovere il surnatante e la centrifuga a 18.000 x g per 20 min. Raccogli il surnatante, che contiene flagelli gratuiti.
   5. Ultracentrifugare il surnatante a 100.000 x g per 1 ora a 4 °C e sospendere il pellet in 150 μL di 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) più tampone EDTA da 2 mM. Il pellet contiene filamenti flagelli.
   6. Analizzare 5-10 μL del pellet risospeso dal passaggio 4.1.5 mediante elettroforesi in un gel SDS-Poliacrilammide al 12% e visualizzare le proteine utilizzando la colorazione blu Coomassie.
      NOTA: Seguire le istruzioni del produttore per l'elettroforesi proteica e la colorazione del gel. Come controllo positivo della flagellina glicosilata, utilizzare i flagelli purificati del ceppo wild-type. Purificare la frazione arricchita di flagelli in un gradiente di cloruro di cesio (ClC).
2. Gradiente di cloruro di cesio per purificare i flagelli.
   1. Mescolare 12,1 g di CsCl con 27 ml di H₂O distillato.
   2. Trasferire la frazione arricchita di flagelli (150 μL) in un tubo ultrachiaro a parete sottile (14 mm x 89 mm) (Tabella dei materiali) e riempirlo con 12 mL di soluzione di CsCl.
   3. Ultracentrifugare il tubo a 60.000 x g per 48 ore a 4 °C in un rotore a benna oscillante (Tabella dei materiali).
   4. Raccogliere la banda del flagello nel gradiente CsCl con una siringa e dializzare contro 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) più 2 mM EDTA. Quindi, analizzare i flagelli dializzati mediante elettroforesi in un gel SDS-Poliacrilammide al 12% e colorazione blu Coomassie (fase 4.1.6) o mediante spettrometria di massa.

Risultati

Questa metodologia fornisce un sistema efficace per generare mutanti nulli in geni o regioni cromosomiche di Aeromonas che possono influenzare la glicosilazione dei flagelli e il ruolo del filamento flagello (Figura 1).

Il protocollo inizia con l'identificazione bioinformatica delle FGI putative e dei geni che codificano per le GT presenti in questa regione. In Aeromonas, la posizione cromosomica delle FGI si basa sulla rilevazione di tre tipi di...

Discussione

Il primo passo critico di questo metodo è l'identificazione delle regioni coinvolte nella glicosilazione dei flagelli e dei presunti GT perché questi enzimi mostrano un'elevata omologia e sono coinvolti in molti processi. L'analisi bioinformatica dei genomi di Aeromonas in database pubblici mostra che questa regione è adiacente alla regione dei flagelli polari 2, che contiene i geni flagellina in molti ceppi e contiene geni coinvolti nella biosintesi dell'acido pseudaminico²⁷. Ciò ha ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit	Applied Biosystems	4337455	Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity	Invitrogen	12346-086	Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose	Conda-Pronadise	8008	Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)	Promega	M1821	Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar	Becton Dickinson	214010	Use for motility analysis
BamHI	Promega	R6021	Used for endonuclease restriction
BglII	Promega	R6081	Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System	UVP		Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase	Bioline	BIO-21040	Used for colony screening
Cesium chloride	Applichem	A1126,0100	Used for flagella purification
Chloramphenicol	Applichem	A1806,0025	Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit	Cytivia	28-9034-71	Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA	Applichem	131026.1211	Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap	VWR	732-1133	Used for transformation
Ethidium bromide	Applichem	A1152,0025	Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker	Bioline	BIO-33053	DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit	Invitrogen	10750204	Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar	Condalab	996	Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth	Condalab	1551	Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Techonologies Inc		Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin	Applichem	A2220,0005	Used for triparental mating
SOC Medium	Invitrogen	15544034	Used for electroporation recovery
Spectinomycin	Applichem	A3834,0005	Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman	331362	Used for flagella purification
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224017	Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar	Condalab	1068	Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth	Condalab	1224	Used for Aeromonas grown
Tryptone	Condalab	1612	Use for motility analysis
Tris	Applichem	A2264,0500	Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100	Applichem	A4975,0100	Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman	344059	Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler	Applied Biosystems		Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit	Zymmo research	D4020	Used for isolation of plasmid DNA