Abordaje quirúrgico estereotáxico para microinyectar el tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la Cisterna Magna en ratones

Resumen

La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones comúnmente implica el acceso a través de los huesos del cráneo y es guiada por puntos de referencia del cráneo. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo para apuntar al tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la cisterna magna que se basa en la visualización directa de los puntos de referencia del tronco encefálico.

Resumen

La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones es comúnmente guiada por puntos de referencia del cráneo. El acceso se obtiene a través de agujeros de rebaba perforados a través del cráneo. Este enfoque estándar puede ser un desafío para los objetivos en el tronco encefálico caudal y la médula cervical superior debido a desafíos anatómicos específicos, ya que estos sitios están alejados de los puntos de referencia del cráneo, lo que lleva a la imprecisión. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo a través de la cisterna magna que se ha utilizado para apuntar a regiones discretas de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. La cisterna magna se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas (es decir, el segundo hueso vertebral), está llena de líquido cefalorraquídeo y está cubierta por duramadre. Este enfoque proporciona una ruta de acceso reproducible a estructuras seleccionadas del sistema nervioso central (SNC) que de otro modo serían difíciles de alcanzar debido a las barreras anatómicas. Además, permite la visualización directa de puntos de referencia del tronco encefálico muy cerca de los sitios objetivo, lo que aumenta la precisión al administrar pequeños volúmenes de inyección a regiones restringidas de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. Finalmente, este enfoque brinda la oportunidad de evitar el cerebelo, que puede ser importante para los estudios motores y sensoriomotores.

Introducción

La cirugía estereotáxica estándar para atacar los sitios cerebrales en ratones¹ comúnmente implica la fijación del cráneo utilizando un conjunto de barras para los oídos y una barra bucal. Las coordenadas se estiman entonces en función de los atlas de referencia ^2,3 y los puntos de referencia del cráneo, a saber, bregma (el punto donde se unen las suturas de los huesos frontal y parietal) o lambda (el punto donde se unen las suturas de los huesos parietal y occipital; Figura 1A,B). A través de un orificio de rebaba en el cráneo por encima del objetivo estimado, se puede llegar a la región objetivo, ya sea para la entrega de microinyecciones o instrumentación con cánulas o fibras ópticas. Debido a la variación en la anatomía de estas suturas y errores en la localización de bregma o lambda ^4,5, la posición de los puntos cero en relación con el cerebro varía de un animal a otro. Si bien los pequeños errores en la focalización, que resultan de esta variabilidad, no son un problema para objetivos grandes o cercanos, su impacto es mayor para áreas de interés más pequeñas que están alejadas de los puntos cero en los planos anteroposterior o dorsoventral y / o cuando se estudian animales de tamaño variable debido a la edad, la tensión y / o el sexo. Hay varios desafíos adicionales que son únicos para la médula oblonga y el cordón cervical superior. En primer lugar, pequeños cambios en las coordenadas anteroposteriores se asocian con cambios significativos en las coordenadas dorsoventrales en relación con la duramadre, debido a la posición y forma del cerebelo (Figura 1Bi)^2,6,7. En segundo lugar, el cordón cervical superior no está contenido dentro del cráneo². En tercer lugar, la posición inclinada del hueso occipital y la capa suprayacente de los músculos del cuello² hace que el enfoque estereotáxico estándar sea aún más desafiante para las estructuras ubicadas cerca de la transición entre el tronco encefálico y la médula espinal (Figura 1Bi). Finalmente, muchas dianas de interés en el tronco encefálico caudal y la médula cervical son pequeñas², requiriendo inyecciones precisas y reproducibles ^8,9.

Un enfoque alternativo a través de la cisterna magna elude estos problemas. La cisterna magna es un gran espacio que se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas (Figura 1A, es decir, el segundo hueso vertebral)¹⁰. Está lleno de líquido cefalorraquídeo y cubierto por la duramadre¹⁰. Este espacio entre el hueso occipital y el atlas se abre al anteroflexionar la cabeza. Se puede acceder navegando entre los vientres pareados suprayacentes del músculo longus capitis, exponiendo la superficie dorsal del tronco encefálico caudal. Las regiones de interés pueden ser atacadas en función de los puntos de referencia de estas regiones si se encuentran cerca de la superficie dorsal; o mediante el uso del obex, el punto donde el canal central se abre en el ventrículo IV, como un punto cero para que las coordenadas alcancen estructuras más profundas. Este enfoque se ha utilizado con éxito en una variedad de especies, incluidas la rata¹¹, el gato¹², el ratón ^8,9 y el primate no humano¹³ para atacar el grupo respiratorio ventral, la formación reticular medial medular, el núcleo del tracto solitario, el área postrema o el núcleo hipogloso. Sin embargo, este enfoque no se utiliza ampliamente, ya que requiere conocimientos de anatomía, un conjunto de herramientas especializado y habilidades quirúrgicas más avanzadas en comparación con el enfoque estereotáxico estándar.

Aquí describimos un enfoque quirúrgico paso a paso para llegar al tronco encefálico y la médula cervical superior a través de la cisterna magna, visualizar puntos de referencia, establecer el punto cero (Figura 2) y estimar y optimizar las coordenadas objetivo para la entrega estereotáxica de microinyecciones en las regiones discretas del tronco encefálico y la médula espinal de interés (Figura 3). A continuación, discutimos las ventajas y desventajas relacionadas con este enfoque.

Protocolo

El autor declara que el protocolo sigue las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico Beth Israel Deaconess.

1. Preparación de instrumentos quirúrgicos y marco estereotáxico

NOTA: La cirugía se realiza en condiciones asépticas. La esterilidad se mantiene mediante la técnica de punta estéril.

1. Instale el brazo estereotáxico con una micropipeta o jeringa llena de un inyectable de su elección (virus adenoasociado (AAV) o trazador convencional) en el marco estereotáxico y prepare el adaptador de ratón (Figura 2A).
2. Preparar instrumentos quirúrgicos en autoclave (Tabla de materiales) y colocarlos sobre una superficie estéril.

2. Inducción de anestesia y preparación del ratón

1. Encienda O₂ a 0.5 L/min y ajuste el vaporizador de isoflurano a 4.0, asegurándose de que el flujo de O₂ sea a la caja de inducción.
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la caja de inducción de isoflurano se coloque en una capucha y que el isoflurano se retire del sitio quirúrgico.
2. Coloque el ratón (macho C57BL/6J de 10 semanas de edad) en la cámara de inducción.
3. Una vez que la respiración se haya ralentizado, abra la cámara de inducción y levante ligeramente el ratón. Use cortapelos para eliminar el vello de la cabeza a los hombros.

3. Posicionamiento del ratón en el marco estereotáxico

1. Mueva el ratón al marco estereotáxico y coloque la nariz en un cono nasal flexible. En esta etapa, asegúrese de que el flujo de O₂ ahora se dirija al cono de la nariz.
2. Coloque el ratón en el marco estereotáxico utilizando únicamente las barras para los oídos.
   NOTA: Asegúrese de que las barras para los oídos estén uniformes y que la cabeza esté nivelada.
3. Anteroflex la cabeza del ratón a un ángulo de 90° guiando manualmente la nariz. Para asegurar esta posición, coloque una barrera de plástico entre los pilares de la barra auditiva del adaptador del mouse, paralela a los pilares. La parte plana del cráneo sirve como referencia, similar al enfoque de cráneo plano en la cirugía estereotáxica convencional.
   NOTA: No flexione demasiado la cabeza (es decir, más allá de un ángulo de 90 ° entre el plano del hueso frontal del cráneo y el plano de la superficie de la mesa) ya que esto impide el flujo de aire a través de las vías respiratorias superiores. Si se impide el flujo de aire, reposicione el ratón, asegurándose de que el cuerpo esté apoyado debajo del tronco y se coloque una tarjeta de plástico a 90 ° entre el plano del hueso frontal del cráneo y el plano de la superficie de la mesa como se describe en la Figura 2A, C.
4. Coloque la almohadilla térmica debajo del mouse y luego asegúrese de que el cuello y el resto del cuerpo estén colocados al mismo nivel (es decir, a aproximadamente 180 ° o paralelos a la mesa). La caja de herramientas que sostiene las tijeras de resorte se puede utilizar para levantar el cuerpo a esta posición.
   NOTA: Este paso es importante ya que el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior se mueven dependiendo de la posición, en contraste con las partes más rostrales del SNC que se mantienen en su lugar por el cráneo.
5. Inyecte una dosis única de 4 mg/kg de Meloxicam de liberación lenta (SR) por vía subcutánea (c.s.) a un volumen de 2 μL/g de peso corporal y coloque lubricante en los ojos.
6. Limpie el sitio de la incisión quirúrgica primero con una almohadilla de preparación de alcohol al 70%, luego con una almohadilla de preparación de betadina y luego nuevamente con una almohadilla de preparación de alcohol y deje secar.
7. Coloque una cortina debajo del cuerpo.
8. Desinfecte las manos y póngase guantes estériles.
9. Coloque una cortina en el sitio quirúrgico.

4. Cirugía para acceder a la cisterna magna

1. Asegúrese de que el ratón esté anestesiado adecuadamente pellizcando los dedos de los pies o revisando el reflejo corneal.
2. Reducir el isoflurano a niveles de mantenimiento (2.0).
3. Haga una incisión de 1-1.2 cm con la cuchilla quirúrgica # 10 desde el borde del hueso occipital hacia los hombros en un movimiento suave.
4. Haga una incisión en el rafe de la línea media del músculo trapecio. Esto expone los músculos pareados de longus capitis.
   NOTA: En ratones, el músculo trapecio es un músculo muy delgado, casi transparente. Asegúrese de permanecer en la línea media y no corte los músculos subyacentes, ya que esto causará sangrado innecesario.
5. Coloque ambos ganchos retractores entre los músculos de longus capitis emparejados, uno orientado a la izquierda y el otro a la derecha. El peso de los hemostáticos proporciona tensión a los ganchos retractores que pueden modificarse reajustando la posición de los hemostáticos.
6. Coloque el microscopio quirúrgico en su lugar para visualizar mejor el campo quirúrgico.
7. Use las pinzas de laminectomía roma para separar los vientres izquierdo y derecho del músculo longus capitis emparejado, comenzando desde el occipucio, donde la línea media es fácilmente visible. Guíe las pinzas romas a través del hueso del occipucio en la línea media hasta donde se encuentra con la duramadre cisternal, y luego continúe a través de la duramadre hasta el atlas.
   NOTA: No hay necesidad de cortar a través de los músculos de la capitis larga emparejados, ya que nada los mantiene unidos en la línea media; hacerlo causará sangrado innecesario.
8. Reposicionar los retractores y ajustar la tensión reposicionando los hemostáticos, abriendo la vista de la cisterna magna.
9. Use las pinzas de laminectomía roma para separar los músculos más en la línea media para obtener una buena ventana de visualización del tronco encefálico y el cerebelo.
10. Repita los pasos 4.7-4.9 según sea necesario hasta que el cerebelo y el tronco encefálico aparezcan a la vista debajo de la duramadre.
11. Usando fórceps de laminectomía contundentes, limpie la duramadre de las pequeñas hebras de tejido conectivo moviendo los fórceps desde la línea media en una dirección lateral, hasta que haya una vista clara del tronco encefálico y para crear más espacio lateral, según sea necesario para el objetivo.

5. Apertura de la membrana cisternal

1. Use las pinzas Dumont en ángulo (# 4/45) para agarrar la duramadre, que se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas. Agarre la duramadre cerca del hueso occipital y use las tijeras de resorte para hacer una pequeña abertura (~ 0.5 a 1.5 mm) en la duramadre.
   NOTA: En esta ubicación rostral, el espacio entre el tronco encefálico y la duramadre suprayacente es más amplio, proporcionando un amplio espacio para la manipulación segura de la duramadre.
2. Use las tijeras de resorte para levantar la duramadre y abrir más la duramadre. El tamaño de la ventana depende del objetivo.
   NOTA: Se necesitará una ventana más grande al realizar múltiples inyecciones longitudinales o inyecciones bilaterales; una pequeña ventana será suficiente al realizar inyecciones unilaterales o de línea media únicas.
3. Una vez que se abre la duramadre, drene el exceso de líquido cefalorraquídeo con una punta de taco estéril.

6. Identificación de puntos de referencia y punto cero

1. Vea la superficie dorsal del tronco encefálico con puntos de referencia detallados a través de la duramadre abierta. El obex, el punto donde el canal central se abre en el ventrículo IV, es el punto cero estándar anterior-posterior y mediolateral.

7. Coordenadas objetivo

NOTA: Para varios objetivos, hemos incluido una lista de coordenadas estándar con coordenadas anteriores posteriores (AP) y mediolaterales (ML) relativas a bregma de punto cero y coordenadas cisterna magna con coordenadas AP y ML relativas a obex de punto cero para facilitar la transición entre metodologías (Tabla 1). Las coordenadas dorsoventrales (DV) son relativas a la superficie del cerebro o cerebelo (enfoque estándar) o la superficie del tronco encefálico o del cordón cervical superior (enfoque cisterna magna) en el punto de entrada de AP y ML. La planificación debe hacerse antes de la cirugía.

1. Utilice los tres conjuntos de coordenadas para determinar el objetivo: AP, ML y DV. Debido a la posición de la cabeza, la orientación relativa de las estructuras del tronco encefálico varía según la ubicación.
   1. Para la distancia objetivo >0,4 mm desde el caudal hasta el obex (Figura 1B, verde) realice lo siguiente.
      1. AP: Utilice cualquier atlas de referencia estereotáxico estándar (por ejemplo, atlas de Paxinos y Franklin²) o serie de tejido cortada en el plano transversal para estimar la distancia AP entre el obex y el objetivo.
      2. ML: Utilice cualquier atlas de referencia estereotáxico estándar o serie de tejido cortada en el plano transversal para estimar la distancia ml entre el obex y el objetivo.
      3. DV: Estimar las coordenadas relativas a la superficie del cerebro o cerebelo en el punto objetivo AP y ML. Utilice cualquier atlas de referencia estereotáxico estándar o serie de tejido cortada en el plano transversal para estimar la distancia entre la superficie del tronco encefálico en las coordenadas AP y ML deseadas y el objetivo.
   2. Para la distancia objetivo <0,4 mm desde el caudal hasta el obex (Figura 1B, naranja) realice lo siguiente.
      1. AP: Ajuste las coordenadas para tener en cuenta la anteroflexión del tronco encefálico. Para las coordenadas ventrales y rostrales, el punto de entrada del tronco encefálico AP será más caudal en relación con la coordenada AP objetivo en el plano estándar.
      2. ML: Derivar coordenadas objetivo a partir de un atlas de referencia estereotáxico estándar o una serie de tejidos cortadas en el plano transversal. Las coordenadas serán relativas a la línea media visualizada en el nivel de AP de destino.
      3. DV: Estimar las coordenadas relativas a la superficie del tronco encefálico en el punto objetivo AP y ML. Ajuste la DV para tener en cuenta la anteroflexión del tronco encefálico. Para las coordenadas ventrales y rostrales, las coordenadas DV serán mayores que la distancia desde la superficie dorsal del tronco encefálico en el plano estándar.

8. Inyección del objetivo

1. Baje la pipeta o jeringa hasta el objetivo utilizando el brazo estereotáxico e inyecte la solución como para los enfoques estereotáxicos estándar. Dejar en su lugar durante 1-5 min después de la inyección, para evitar un seguimiento de la aguja cuando se utilizan volúmenes entre 3-50 nL. Luego, levante la pipeta o la jeringa con el brazo estereotáxico.
2. Repita el paso 8.1. para múltiples objetivos.

9. Cierre del campo quirúrgico

1. Retire los ganchos con cuidado del campo quirúrgico. Los músculos del longus capitis emparejados volverán a caer en una posición neutral, cubriendo completamente la cisterna magna. No cierre el músculo trapecio y la duramadre en la línea media, ya que son demasiado frágiles para sostener las suturas.
2. Cierre la piel con tres suturas de nylon o polipropileno (5-0 o 6-0).

10. Cuidados postoperatorios

1. Apague el isoflurano y retire el ratón del marco estereotáxico. Coloque el ratón en una jaula limpia en una almohadilla térmica y observe hasta que esté despierto y en movimiento.
2. Controle el estado de salud, el peso y las suturas en los días postoperatorios 1-3. Retire las suturas el día 10 si aún no se han retirado.

Resultados

El enfoque cisterna magna permite apuntar a las estructuras del tronco encefálico caudal y del cordón cervical superior que de otro modo serían difíciles de alcanzar a través de enfoques estereotáxicos estándar o que son propensas a una orientación inconsistente. La cirugía para llegar a la cisterna magna requiere incisiones de la piel, una capa delgada de músculo trapecio y la abertura de la duramadre y, por lo tanto, es bien tolerada por los ratones. Es especialmente eficiente y menos invasivo cuando...

Discusión

La cirugía estereotáxica estándar comúnmente se basa en puntos de referencia del cráneo para calcular las coordenadas de los sitios objetivo en el SNC¹. Luego se accede a los sitios objetivo a través de orificios de rebaba que se perforan a través del cráneo¹. Este método no es ideal para el tronco encefálico caudal, ya que los sitios objetivo se encuentran distantes de los puntos de referencia del cráneo en los planos anteroposterior y dorsoventral

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window