Un modello di trapianto renale ortotopico di ratto per il rigetto dell'allotrapianto renale

Riepilogo

Il modello di trapianto renale ortotopico di ratto contribuisce a studiare il meccanismo di rigetto dell'allotrapianto renale. Il modello attuale aumenta la sopravvivenza dei riceventi senza interferenze con l'afflusso di sangue e il reflusso venoso della parte inferiore del corpo utilizzando un'anastomosi end-to-end dell'impianto renale e un metodo "tunnel" end-to-side di anastomosi uretere-vescica.

Abstract

Il rigetto dell'allotrapianto renale limita la sopravvivenza a lungo termine dei pazienti dopo trapianto renale. Il trapianto renale ortotopico di ratto è un modello essenziale per studiare il meccanismo di rigetto dell'allotrapianto renale negli studi pre-clinici e potrebbe aiutare nello sviluppo di nuovi approcci per migliorare la sopravvivenza a lungo termine degli alloinnesti renali. L'impianto di rene del donatore nel trapianto renale ortotopico di ratto viene comunemente eseguito mediante anastomosi end-to-side all'aorta dei riceventi e alla vena cava inferiore. In questo modello, il rene del donatore è stato impiantato utilizzando l'anastomosi end-to-end all'arteria renale e alla vena renale dei riceventi. L'uretere del donatore è stato anastomosizzato alla vescica del ricevente in un metodo "tunnel" end-to-side. Questo modello contribuisce a una migliore guarigione dell'anastomosi uretere-vescicale e aumenta la sopravvivenza dei riceventi evitando interferenze con l'afflusso di sangue e il reflusso venoso della parte inferiore del corpo. Questo modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi di rigetto immunitario e patologico acuto e cronico degli alloinnesti renali. Qui, lo studio descrive i protocolli dettagliati di questo trapianto renale ortotopico tra ratti.

Introduzione

Il trapianto renale è diventato l'approccio terapeutico più efficace per i pazienti con insufficienza renale allo stadio terminale. Tuttavia, il rigetto acuto mediato dalle cellule T e il rigetto immunitario umorale mediato da alloanticorpi provocano il danno patologico degli alloinnesti renali e limitano la sopravvivenza a breve e lungo termine dei pazienti dopo trapianto di rene ^1,2,3. Sfortunatamente, mancano ancora i farmaci efficaci che impediscono il rigetto degli alloinnesti renali, perché non sono chiari gli esatti meccanismi di rigetto immunitario e patologico degli alloinnesti renali. Di conseguenza, gli studi preclinici che chiariscono i meccanismi di rigetto immunitario e patologico degli alloinnesti renali contribuiscono a trovare nuovi bersagli e a sviluppare farmaci efficaci rilevanti per prevenire il rigetto degli alloinnesti renali ed eventualmente prolungare la sopravvivenza dei pazienti.

Molti potenziali meccanismi immunologici e fisiopatologici del rigetto dell'allotrapianto renale sono stati recentemente proposti in studi su modelli di ratto di trapianto renale ortotopico ^4,5,6,7,8. Questi risultati propongono diversi nuovi bersagli e approcci interferenti rilevanti come terapie promettenti per sopprimere il rigetto dell'allotrapianto renale, come i fattori regolatori del complemento e gli anticorpi anti-CD59⁶, l'immunoproteasoma e gli inibitori dell'epossichetone ^7,8. Pertanto, il trapianto renale ortotopico di ratto è un modello preclinico ideale per studiare i meccanismi di rigetto immunitario e danno patologico degli alloinnesti renali dopo trapianto di rene.

Il trapianto di rene di ratto è gradualmente passato dall'impianto eterotopico dei reni del donatore⁹ all'impianto renale ortotopico utilizzando l'anastomosi end-to-side dei vasi o utilizzando l'anastomosi end-to-end dell'uretere utilizzando un metodo di^cuffia 10,11,12. Il presente studio descrive protocolli dettagliati del trapianto renale ortotopico tra ratti utilizzando l'anastomosi end-to-end all'arteria renale e alla vena renale dei riceventi e un metodo "tunnel" end-to-side di anastomosi uretere-vescicale, che evita l'ischemia della parte inferiore del corpo e la trombosi della vena cava inferiore e riduce la perdita di urina postoperatoria e la torsione dell'uretere.

Protocollo

I ratti maschi F344 e Lewis di 8-10 settimane (da 200 g a 250 g) sono stati ottenuti commercialmente. Il trapianto allogenico di rene sinistro è stato eseguito tra ratti maschi F344 e Lewis. I ratti F344 sono stati usati come donatori e riceventi singenici, e i ratti Lewis sono stati utilizzati come riceventi allogenici. Tutte le procedure di manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicate dal NIH e tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Ospedale universitario per il cancro di Chongqing. Tutte le forniture utilizzate durante l'intervento chirurgico, compresi gli strumenti chirurgici e le soluzioni, sono sterili. Uno schema del protocollo è mostrato nella Figura 1.

1. Procedura del donatore

1. Indurre l'anestesia generale nel ratto per inalazione di isoflurano al 5% utilizzando una camera di induzione. Quindi, iniettare per via sottocutanea buprenorfina a 0,1 mg/kg per eseguire un'analgesia preventiva concomitante.
2. Posizionare il ratto sulla schiena e mantenere l'anestesia con inalazione di isoflurano al 2% usando una maschera facciale sul naso e sulla bocca. Applicare lubrificante per gli occhi sugli occhi per evitare l'essiccazione della cornea. La frequenza respiratoria e il ritmo lenti, la scomparsa del riflesso corneale e la mancanza di risposta al pizzico della punta indicano l'efficacia dell'anestesia.
3. Rasare i peli addominali con un rasoio elettrico e sterilizzare la pelle con lo 0,5% di iodio e il 70% di alcol.
4. Iniettare per via sottocutanea lo 0,5% di lidocaina lungo la linea mediana dalla sinfisi pubica al sottossifoide per analgesici locali, quindi incidere l'addome e aprire l'incisione usando un divaricatore.
5. Estrarre l'intestino dal lato destro dell'incisione e avvolgerli con una garza inumidita per evitare che si secchino. Quindi, esporre il rene sinistro.
6. Separare i tessuti adiposi dal rene sinistro e dall'uretere usando tamponi di cotone, quindi dissociare l'arteria renale sinistra e la vena usando la microforza al microscopio operatorio con ingrandimento 20x. Coagulare qualsiasi sanguinamento usando l'elettrocoagulazione, se necessario.
7. Eseguire la legatura dell'aorta a circa 5 mm sopra l'arteria renale sinistra con una sutura monofilamento in poliammide 4-0. Quindi, transettare la vena renale sinistra distale alla congiunzione della vena genitale sinistra e della vena surrenale.
8. Lavare il rene con una soluzione UW ghiacciata integrata con eparina (100 U / mL) usando un ago del cuoio capelluto da 24 G dall'aorta sotto l'arteria renale sinistra fino a quando il sangue svanisce di colore. Il tempo di ischemia calda è di 5 minuti in media.
9. Dopo aver transettato l'arteria renale sinistra di circa 2 mm accanto all'aorta, dissociare il rene e l'uretere con l'aiuto di micro-pinze (preservare i tessuti connettivi periferici per garantire l'afflusso di sangue all'uretere). Quindi, trascorrere l'uretere vicino alla vescica e preservare il rene sinistro del donatore in una soluzione UW ghiacciata.
10. Sacrificare il ratto donatore con perdita di sangue trasettando l'aorta e successivamente mettendolo in una scatola di CO₂ per garantire la morte.

2. Procedura del destinatario

1. Ripetere la procedura descritta nei passaggi 1.1-1.5 per il ratto ricevente.
2. Dissociare il rene sinistro e l'uretere, nonché l'arteria renale sinistra e la vena renale del ratto ricevente utilizzando tamponi di cotone e microforze al microscopio operatorio con ingrandimento 20x.
3. Agganciare l'arteria renale sinistra e la vena renale alla radice con morsetti micro-vascolari non invasivi. Ligate l'uretere sinistro a circa 2-3 cm sotto il rene con un 8-0 sutura monofilamento in poliammide e transetto alla legatura.
4. Resecare il rene sinistro nativo del ricevente transectando l'arteria renale sinistra a 2 mm di distanza dal morsetto micro-vascolare e trasezionando la vena renale prossimale alla congiunzione della vena genitale sinistra e della vena surrenale. Coagulare la vena surrenale usando l'elettrocoagulazione, se necessario.
5. Impiantare il rene del donatore nella fossa renale sinistra del ratto ricevente e mettere il ghiaccio attorno al rene del donatore impiantato. Anastomosi dell'arteria renale e della vena renale del donatore all'arteria renale e alla vena renale del ricevente in un modello end-to-end utilizzando 10-0 suture monofilamenti in poliammide al microscopio operatorio con ingrandimento 45x, come segue.
6. Anastomosi dell'arteria renale con suture interrotte.
   1. Posizionare le suture di soggiorno a ore 12 e 6 posizioni di anastomosi, rispettivamente. Sutura equidistante un lato dell'anastomosi tra le due suture di soggiorno con 2-3 punti utilizzando una sutura monofilamento in poliammide 10-0.
   2. Capovolgere le suture di soggiorno e allo stesso modo suturare l'altro lato dell'anastomosi tra le due suture di soggiorno con 2-3 punti.
7. Anastomosi della vena renale con suture continue.
   1. Posizionare le suture di soggiorno a ore 6 e 12 di anastomosi, rispettivamente. Suturare un lato dell'anastomosi dalla posizione a ore 12 con 4-5 punti usando le suture correnti, quindi legare la sutura corrente alla sutura di soggiorno a ore 6 con una sutura monofilamento in poliammide 10-0.
   2. Capovolgere le suture di soggiorno e allo stesso modo suturare l'altro lato dell'anastomosi dalla posizione a ore 6, e infine legare la sutura in esecuzione alla sutura di permanenza a ore 12.
8. Ri-perfondere il rene donatore rilasciando prima il morsetto micro-vascolare non invasivo della vena renale; quindi, identificare i siti di sanguinamento e fare ulteriori punti.
9. Rilasciare il morsetto micro-vascolare non invasivo dell'arteria renale, identificare i siti di sanguinamento e fare ulteriori punti. Il tempo di ischemia fredda è di 45 minuti in media.
10. Cucire l'estremità dell'uretere donatore con una sutura monofilamento in poliammide 4-0 come rimorchio per trascinare l'estremità attraverso il "tunnel" della vescica del ricevente al microscopio operatorio con ingrandimento 20x. Successivamente, trasportare l'estremità dell'uretere donatore con la sutura all'esterno della vescica del ricevente. Lasciare che l'uretere donatore si riduca nella vescica del ricevente.
11. Fissare l'uretere donatore con la vescica del ricevente cucendo l'avventizia dell'uretere donatore con lo strato muscolare della vescica del ricevente all'esterno in quattro posizioni equidistanti usando un 8-0 sutura monofilamento in poliammide al microscopio operatorio con ingrandimento 45x.
12. Riposizionare l'intestino nella cavità addominale e chiudere l'incisione addominale con suture continue nello strato muscolare prima e poi nello strato cutaneo con una sutura monofilamento in poliammide 4-0.
13. Posizionare il ratto ricevente su una piastra riscaldante a 37°C in una gabbia asciutta e pulita. Attendere fino a quando il ratto si riprende dall'anestesia.
14. Iniettare per via sottocutanea buprenorfina (0,05 mg/kg) nel ratto ricevente ogni 6 ore per 48 ore per analgesia post-operatoria. Iniettare per via intramuscolare la penicillina (50.000 U/kg) nel ratto ricevente una volta al giorno per 3 giorni per la prevenzione dell'infezione. Il ratto ricevente viene sacrificato mettendolo in una scatola di CO₂ per osservare il rigetto cronico dell'allotrapianto renale dopo 10 settimane di trapianto.

Risultati

In questo modello di trapianto renale ortotopico di ratto, i ratti riceventi si muovono normalmente dopo l'operazione. Per osservare il rigetto cronico dell'allotrapianto renale, i ratti riceventi vengono allevati per 10 settimane dopo il trapianto e il tasso di sopravvivenza totale dei ratti riceventi in questo momento è di circa il 90%. Le principali cause di morte sono il sanguinamento e la perdita di urina dopo l'operazione. Le altre principali complicanze includono sanguinamento durante l'operazione, trombosi nei v...

Discussione

Il trapianto renale nel ratto è un lavoro impegnativo che richiede un alto livello di tecniche di microchirurgia e le tecniche operative sono state ottimizzate più volte. Fin dall'inizio, Gonzalez et al. hanno impiantato il rene del donatore nel collo del ricevente e hanno anastomosizzato l'uretere del donatore sulla pelle⁹. Tuttavia, a causa dell'alta incidenza di infezioni urinarie e stenosi dell'uretere donatore, l'operazione è stata abbandonata in breve tempo. Successivamente, l'operazione ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
4-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C1048451
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Electrocoagulator	ZJ1099
F344 and Lewis rats	Center of Experimental Animals (Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China)	NA
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
Injection syringe (1 ml and 10 ml)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Penicillin G Sodium	Wuhan HongDe Yuexin pharmatech co.,Ltd	69-57-8
Scalp needle (24 G)	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science	R500
Small Animal Surgery Kit	Beyotime	FS500
Sodium chloride injection	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274
Tape	Minnesota Mining Manufacturing Medical Equipment (Shanghai) Co., LTD	1911N68
UW solution	Bristol-Myers Squibb Company	17HB0002