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Les modifications post-traductionnelles (PTM) modifient les structures et les fonctions des protéines. Les méthodes d’enrichissement simultané de plusieurs types de PTM peuvent maximiser la couverture dans les analyses. Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie d’affinité métallique immobilisée Ti(IV) double fonctionnelle suivie d’une spectrométrie de masse pour l’enrichissement et l’analyse simultanés de la protéine N-glycosylation et de la phosphorylation dans les tissus pancréatiques.
La spectrométrie de masse peut fournir une couverture profonde des modifications post-traductionnelles (PTM), bien que l’enrichissement de ces modifications à partir de matrices biologiques complexes soit souvent nécessaire en raison de leur faible stœchiométrie par rapport aux analytes non modifiés. La plupart des flux de travail d’enrichissement des PTM sur les peptides dans les flux de travail protéomique ascendants, où les protéines sont digérées enzymatiquement avant que les peptides résultants ne soient analysés, n’enrichissent qu’un seul type de modification. C’est l’ensemble du complément des PTM, cependant, qui conduit à des fonctions biologiques, et l’enrichissement d’un seul type de PTM peut manquer une telle diaphonie des PTM. La diaphonie PTM a été observée entre la glycosylation des protéines et la phosphorylation, les deux PTM les plus courants dans les protéines humaines et aussi les deux PTM les plus étudiés en utilisant des flux de travail de spectrométrie de masse. En utilisant la stratégie d’enrichissement simultané décrite ici, les deux PTM sont enrichis à partir de tissu pancréatique humain post-mortem, une matrice biologique complexe. La chromatographie d’affinité métallique immobilisée Ti(IV) à double fonction est utilisée pour séparer simultanément diverses formes de glycosylation et de phosphorylation en plusieurs fractions dans une méthode pratique basée sur la pointe de spin, permettant des analyses en aval des interactions potentielles de diaphonie PTM. Ce flux de travail d’enrichissement pour les glyco- et phosphopeptides peut être appliqué à différents types d’échantillons afin d’obtenir un profilage en profondeur de plusieurs PTM et d’identifier des molécules cibles potentielles pour de futures études.
Les modifications post-traductionnelles des protéines (PTM) jouent un rôle majeur dans la modulation des structures protéiques et, par conséquent, de leurs fonctions et des processus biologiques en aval. La diversité du protéome humain augmente de façon exponentielle en raison de la variabilité combinatoire offerte par divers PTM. Différentes variantes de protéines de leurs séquences canoniques prédites par le génome sont connues sous le nom de protéoformes, et de nombreux protéoformes proviennent de PTM1. L’étude de la diversité protéiforme en matière de santé et de maladie est devenue un domaine de recherche d’un grand....
Le consentement a été obtenu pour l’utilisation de tissus pancréatiques à des fins de recherche auprès du plus proche parent du défunt et une autorisation du Conseil d’examen institutionnel des sciences de la santé de l’Université du Wisconsin-Madison a été obtenue. La surveillance de la CISR n’est pas requise parce qu’elle ne concerne pas de sujets humains, tel que reconnu par le 45 CFR 46.102(f).
ATTENTION : Des précautions doivent être prises lors de la manipulation des réactifs utilisés dans ce protocole, qui comprennent les acides (formique, acétique, trifluoroacétique), les bases (hydroxyde d’ammonium) et les cryogènes (azote liquide)....
Des données représentatives de spectrométrie de masse, y compris des fichiers bruts et des résultats de recherche, ont été déposées au ProteomeXchange Consortium via le référentiel partenaire PRIDE avec l’identificateur de jeu de données PXD03306522.
Dans ce travail, des répliques d’injection en double ont été analysées pour chaque élution d’enrichissement. Les identifications effectuées à partir des deux répliques techniques ont été .......
La stratégie Ti(IV)-IMAC à double fonction est utile pour l’analyse simultanée des N-glycopeptides et des phosphopeptides du même échantillon dans un seul flux de travail de préparation d’échantillon. Il a également été démontré que les méthodes basées sur ERLIC permettent d’enrichir simultanément les PTM. Les deux stratégies ont déjà été utilisées pour une couverture approfondie dans les analyses PTM14,18. En adaptant la méthode dual .......
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Cette recherche a été financée en partie par des subventions des NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 et R21AG065728) et de la Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B et SRA-2016-168-S-B). Les données présentées ici ont également été obtenues en partie grâce au soutien d’un prix UL1TR002373 des NIH / NCATS par l’intermédiaire de l’Institut de recherche clinique et translationnelle de l’Université du Wisconsin. Les instruments Orbitrap ont été achetés grâce au soutien d’une subvention d’instruments partagés des NIH (NIH-NCRR S10RR029531) et du Bureau du vice-chancelier pour la recherche et l’enseignement supérieur de l’Université du Wisconsin-Ma....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
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