Une stratégie d’enrichissement spin-tip pour l’analyse simultanée des N-glycopeptides et des phosphopeptides des tissus pancréatiques humains

Résumé

Les modifications post-traductionnelles (PTM) modifient les structures et les fonctions des protéines. Les méthodes d’enrichissement simultané de plusieurs types de PTM peuvent maximiser la couverture dans les analyses. Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie d’affinité métallique immobilisée Ti(IV) double fonctionnelle suivie d’une spectrométrie de masse pour l’enrichissement et l’analyse simultanés de la protéine N-glycosylation et de la phosphorylation dans les tissus pancréatiques.

Résumé

La spectrométrie de masse peut fournir une couverture profonde des modifications post-traductionnelles (PTM), bien que l’enrichissement de ces modifications à partir de matrices biologiques complexes soit souvent nécessaire en raison de leur faible stœchiométrie par rapport aux analytes non modifiés. La plupart des flux de travail d’enrichissement des PTM sur les peptides dans les flux de travail protéomique ascendants, où les protéines sont digérées enzymatiquement avant que les peptides résultants ne soient analysés, n’enrichissent qu’un seul type de modification. C’est l’ensemble du complément des PTM, cependant, qui conduit à des fonctions biologiques, et l’enrichissement d’un seul type de PTM peut manquer une telle diaphonie des PTM. La diaphonie PTM a été observée entre la glycosylation des protéines et la phosphorylation, les deux PTM les plus courants dans les protéines humaines et aussi les deux PTM les plus étudiés en utilisant des flux de travail de spectrométrie de masse. En utilisant la stratégie d’enrichissement simultané décrite ici, les deux PTM sont enrichis à partir de tissu pancréatique humain post-mortem, une matrice biologique complexe. La chromatographie d’affinité métallique immobilisée Ti(IV) à double fonction est utilisée pour séparer simultanément diverses formes de glycosylation et de phosphorylation en plusieurs fractions dans une méthode pratique basée sur la pointe de spin, permettant des analyses en aval des interactions potentielles de diaphonie PTM. Ce flux de travail d’enrichissement pour les glyco- et phosphopeptides peut être appliqué à différents types d’échantillons afin d’obtenir un profilage en profondeur de plusieurs PTM et d’identifier des molécules cibles potentielles pour de futures études.

Introduction

Les modifications post-traductionnelles des protéines (PTM) jouent un rôle majeur dans la modulation des structures protéiques et, par conséquent, de leurs fonctions et des processus biologiques en aval. La diversité du protéome humain augmente de façon exponentielle en raison de la variabilité combinatoire offerte par divers PTM. Différentes variantes de protéines de leurs séquences canoniques prédites par le génome sont connues sous le nom de protéoformes, et de nombreux protéoformes proviennent de PTM¹. L’étude de la diversité protéiforme en matière de santé et de maladie est devenue un domaine de recherche d’un grand intérêt ces dernières années ^2,3.

L’étude des protéoformes et plus particulièrement des PTM à grande profondeur est devenue plus facile grâce au développement de méthodes protéomiques basées sur la spectrométrie de masse (SEP). En utilisant la SEP, les analytes sont ionisés, fragmentés et identifiés en fonction du m/z des fragments. Les méthodes d’enrichissement sont souvent nécessaires en raison de la faible abondance relative des PTM par rapport aux formes non modifiées de protéines. Bien que l’analyse des protéines intactes et de leurs PTM, appelées analyses descendantes, soit devenue plus courante, la digestion enzymatique des protéines et l’analyse de leurs peptides constitutifs dans les analyses ascendantes restent la voie la plus largement utilisée pour l’analyse PTM. Les deux PTM les plus étudiés, et les deux PTM les plus courants in vivo, sont la glycosylation et la phosphorylation⁴. Ces deux PTM jouent un rôle majeur dans la signalisation et la reconnaissance cellulaires et sont donc des modifications importantes à caractériser dans la recherche sur les maladies.

Les propriétés chimiques de divers PTM fournissent souvent des voies vers l’enrichissement de ces PTM aux niveaux de protéines et de peptides avant l’analyse. La glycosylation est un PTM hydrophile en raison de l’abondance des groupes hydroxyles sur chaque monosaccharide. Cette propriété peut être utilisée pour enrichir les glycopeptides en chromatographie d’interaction hydrophile (HILIC), qui peut séparer davantage de glycopeptides hydrophiles des peptides hydrophobes non modifiés⁵. La phosphorylation ajoute la fraction phosphate, qui est chargée négativement sauf à pH acide. En raison de cette charge, divers cations métalliques, y compris le titane, peuvent être utilisés pour attirer et lier les phosphopeptides tandis que les espèces non phosphorylées sont emportées. C’est le principe de la chromatographie d’affinité des métaux immobilisés (IMAC). D’autres discussions sur ces stratégies et d’autres stratégies d’enrichissement pour la glycosylation et la phosphorylation peuvent être trouvées dans des revues récentes ^6,7.

Des quantités relativement importantes de matériel peptidique de départ (0,5 mg ou plus) sont souvent nécessaires pour les protocoles d’enrichissement en raison de la faible stœchiométrie des PTM sur les peptides. Dans les scénarios où cette quantité d’échantillon peut ne pas être facilement obtenue, comme la biopsie du noyau tumoral ou les analyses du liquide céphalo-rachidien, il est avantageux d’utiliser des flux de travail faciles qui aboutissent à un maximum d’informations biomoléculaires. Les stratégies récentes développées par notre laboratoire et d’autres ont mis en évidence l’analyse simultanée et parallèle de la glycosylation et de la phosphorylation en utilisant le même flux de travail ^{d’enrichissement} PTM ^8,9,10,11,12. Bien que les propriétés chimiques de ces deux PTM puissent différer, ces PTM peuvent être analysés en plusieurs étapes en raison des techniques de séparation innovantes et des matériaux utilisés. Par exemple, la chromatographie d’interaction électrostatique répulsion-hydrophile (ERLIC) superpose des séparations basées sur les interactions hydrophiles entre les analytes et la phase mobile avec des interactions charge-charge entre les analytes et le matériau de phase stationnaire 13,14,15,16. À pH acide, l’attraction des peptides phosphorylés vers la phase stationnaire peut améliorer leur rétention et leur séparation des peptides non modifiés. Le matériau constitué de Ti(IV) immobilisé sur des microsphères hydrophiles peut être utilisé pour l’élution HILIC et IMAC afin de séparer les phosphopeptides et les glycopeptides neutres, acides et mannose-6-phosphorylés^17,18. Cette stratégie est connue sous le nom de Ti(IV)-IMAC à double fonction. L’utilisation de ces stratégies pour enrichir plusieurs PTM dans un seul flux de travail peut rendre les analyses des interactions de diaphonie PTM potentielles plus accessibles. De plus, la quantité totale d’échantillon et les exigences en temps sont inférieures aux méthodes d’enrichissement conventionnelles lorsqu’elles sont effectuées en parallèle (c.-à-d. HILIC et IMAC sur des aliquotes d’échantillon distinctes).

Pour démontrer la stratégie Ti(IV)-IMAC à double fonction pour l’analyse simultanée de la glycosylation et de la phosphorylation des protéines, nous l’avons appliquée pour analyser les tissus pancréatiques humains post-mortem. Le pancréas produit à la fois des enzymes digestives et des hormones régulatrices, y compris l’insuline et le glucagon. La fonction pancréatique est altérée dans la maladie pancréatique. Dans le diabète, la régulation de la glycémie est affectée, conduisant à des niveaux plus élevés de glucose dans le sang. Dans la pancréatite, l’inflammation résulte de l’auto-digestion de l’organe³. Des changements dans les profils PTM, y compris la glycosylation et la phosphorylation, peuvent entraîner, comme c’est souvent le cas, d’autres maladies.

Nous décrivons ici un protocole pour une méthode d’enrichissement simultané basée sur la pointe de spin, basée sur une stratégie Ti(IV)-IMAC à double fonction, pour les N-glycopeptides et les phosphopeptides dérivés de protéines extraites du tissu pancréatique. Le protocole comprend l’extraction et la digestion des protéines, l’enrichissement, la collecte de données sur la SEP et le traitement des données, comme le montre la figure 1. Les données représentatives de cette étude sont disponibles via ProteomeXchange Consortium avec l’identifiant PXD033065.

Figure 1 : Flux de travail pour l’analyse simultanée des N-glycopeptides et des phosphopeptides des tissus pancréatiques humains. Les tissus sont d’abord cryo-pulvérisés en une fine poudre avant l’extraction des protéines à l’aide du détergent dodécylsulfate de sodium (SDS). Les protéines sont ensuite soumises à une digestion enzymatique. Les peptides résultants sont alicités avant l’enrichissement à l’aide de Ti(IV)-IMAC à double fonction. Les données brutes sont collectées à l’aide de la chromatographie liquide en phase inversée à l’échelle nanométrique-spectrométrie de masse (nRPLC-MS) et sont analysées à l’aide d’un logiciel de recherche dans une base de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ce protocole est destiné à rendre les analyses PTM plus accessibles et à permettre une analyse plus étendue de plusieurs PTM dans le même flux de travail. Ce protocole peut être appliqué à d’autres matrices biologiques complexes, y compris les cellules et les biofluides.

Protocole

Le consentement a été obtenu pour l’utilisation de tissus pancréatiques à des fins de recherche auprès du plus proche parent du défunt et une autorisation du Conseil d’examen institutionnel des sciences de la santé de l’Université du Wisconsin-Madison a été obtenue. La surveillance de la CISR n’est pas requise parce qu’elle ne concerne pas de sujets humains, tel que reconnu par le 45 CFR 46.102(f).

ATTENTION : Des précautions doivent être prises lors de la manipulation des réactifs utilisés dans ce protocole, qui comprennent les acides (formique, acétique, trifluoroacétique), les bases (hydroxyde d’ammonium) et les cryogènes (azote liquide). Lisez les fiches de données de sécurité des réactifs utilisés pour vous familiariser avec les dangers associés et les précautions nécessaires. Les concentrations indiquées à l’aide de pourcentages sont le volume/volume total (v/v) et sont diluées avec de l’eau.

1. Cryo-pulvérisation tissulaire, lyse et extraction des protéines

1. Remplissez un dewar avec de l’azote liquide. Pré-refroidissez les parties du pulvérisateur tissulaire qui entreront en contact avec les tissus pancréatiques, à savoir la chambre, le pulvérisateur et la cuillère de récupération dans un récipient en polystyrène.
2. Transférer les morceaux de tissu congelés dans le porte-échantillon pré-réfrigéré et ajouter une cuillerée d’azote liquide au tissu.
3. Placez le pulvérisateur dans la chambre et frappez-le à l’aide d’un maillet cinq à dix fois pour écraser l’échantillon. Retirez le pulvérisateur de la chambre et grattez la poudre et les morceaux de tissu adhérents.
4. Ajouter une cuillerée d’azote liquide dans la chambre si les tissus commencent à fondre. Répétez le processus de pulvérisation jusqu’à ce que l’échantillon soit une poudre fine sans gros morceaux de tissu. Répartir les échantillons dans environ 100 mg d’aliquotes dans des tubes pré-réfrigérés.
5. Préparer un tampon de lyse contenant 4 % de dodécylsulfate de sodium (FDS), 150 mM de NaCl et 25 mM de Tris (pH = 7,4). Dissoudre un comprimé de protéase et d’inhibiteur de phosphatase dans 500 μL d’eau pour un stock de 20x de chacun. Ajouter le volume requis de 20x le stock de chaque inhibiteur au tampon de lyse pour une concentration finale de 1x.
6. Ajouter 600 μL de tampon de lyse par 100 mg de tissu au tube et incuber à 95 °C dans un bloc chauffant pendant 10 min en agitant à 800 tr/min. Retirez les échantillons du bloc chauffant et laissez-les refroidir à la température ambiante.
7. Soniquer les échantillons à une énergie de 60 W (20 kHz) pendant 45 s en utilisant des impulsions de 15 s avec un repos de 30 s entre les deux. Granulés les échantillons à 3 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
8. Ajouter le surnageant à un solvant de précipitation 5x, 300 μL de tampon de lyse à 1,5 mL de solvant de précipitation, contenant 50% d’acétone, 49,9% d’éthanol et 0,1% d’acide acétique. Refroidir toute la nuit à -20 °C.
9. Pastillez à nouveau les échantillons à 3 000 x g pendant 15 min à 4 °C et retirez le surnageant. Lavez la pastille en la cassant avec une spatule et en la mélangeant avec la même quantité de solvant de précipitation. Pellet à nouveau, en répétant l’étape de lavage 2x.
10. Pastillez l’échantillon à 16 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Sécher à l’air libre l’échantillon de granulés dans une hotte pendant 15 min et conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à continuer.

2. Digestion et dessalement des protéines

1. Remettre en suspension la pastille de protéine dans 300 μL de tampon de digestion fraîchement préparé contenant 50 mM de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB) et 8 M d’urée.
2. Estimer la concentration en protéines de la solution à l’aide d’un dosage protéique selon le protocole du fabricant.
3. À la protéine contenue dans la solution, ajouter le dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 5 mM, mélanger et réduire à température ambiante pendant 1 h. Ensuite, ajouter l’iodoacétamide (IAA) à une concentration finale de 15 mM, mélanger et alkyler à température ambiante pendant 30 min dans l’obscurité. Éteindre l’alkylation en répétant l’addition de TNT dans le même volume qu’auparavant et mélanger.
4. Ajouter LysC/trypsine à un rapport enzyme/protéine de 1:100 et incuber à 37 °C pendant 4 h. Ensuite, ajoutez 50 mM de TEAB pour diluer l’urée de 8 M utilisée pour < 1 M. Ajouter la trypsine à un rapport enzyme/protéine de 1:100 et incuber à 37 °C pendant la nuit.
5. Étancher la digestion avec l’ajout d’acide trifluoroacétique (TFA) à 0,3% v / v. Pour chaque 1 mg de protéine de départ, conditionner une cartouche de dessalement (1 cc, 10 mg) avec 1 mL d’acétonitrile (ACN) et 3x avec 1 mL de 0,1% de TFA.
6. Chargez le mélange digéré sur la cartouche de dessalement. Laver le mélange 3x en utilisant 1 mL de 0,1% TFA. Si l’élution est lente, appliquez une pression positive mais évitez un débit > une goutte par seconde.
7. Elute peptides utilisant 1 mL de 60% d’ACN et 0,1% d’acide formique (FA). Peptides élués à sec à environ 35 °C à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide jusqu’à ce que le solvant se soit complètement évaporé.
8. Resuspendez les peptides dans 300 μL d’eau et estimez les concentrations de peptides à l’aide d’un test peptidique selon le protocole du fabricant. Répartir les peptides dans des aliquotes de 500 μg et sécher complètement.

3. Enrichissement en N-glycopeptide ERLIC

REMARQUE: Les vitesses et les temps exacts de la centrifugeuse peuvent différer en fonction des échantillons et doivent être optimisés. En général, 300 x g pendant 2 min est approprié pour le conditionnement et le lavage du matériau et 100 x g pendant 5 min pour l’élution.

1. Peser environ 3 mg de coton et l’emballer dans une pointe de pipette vide de 200 μL (pointe d’essorage; voir tableau des matériaux).
2. Transférer un matériau d’enrichissement à fort échange d’anions dans un tube et ajouter 200 μL de TFA à 0,1 % par matériau de 10 mg. Pour l’enrichissement de 500 μg de peptides, utilisez 15 mg du matériau. Activez le matériau en agitant pendant 15 min.
3. À l’aide d’un adaptateur de tube, placez la pointe de rotation sur un tube de 2 mL et ajoutez suffisamment de boue à la pointe pour 15 mg de matériau. Retirez le liquide en le faisant tourner dans une centrifugeuse de paillasse.
4. Conditionnez le matériau en centrifugant 3x avec 200 μL d’ACN. Répétez le conditionnement du triple avec 100 mM d’acétate d’ammonium (NH₄Ac), 1 % de TFA et 80 % d’ACN/0,1 % de TFA (tampon de chargement).
5. Remettre en suspension des échantillons de peptides de 500 μg dans environ 200 μL de tampon de charge et s’écouler à travers la pointe de spin. Rechargez le flow-through 2x pour assurer une liaison complète.
6. Lavez le matériau en centrifugant 5x en utilisant 200 μL de 80% ACN / 0,1% TFA, puis 2x en utilisant 200 μL de 80% ACN / 0,1% FA.
7. Éluez les peptides par centrifugation avec 200 μL de chacun des éléments suivants: 50% ACN / 0,1% FA (E1); 0,1 % AF (E2); 0,1 % TFA (E3); 300 mM KH₂PO₄, 10% ACN (E4).
8. Lavez le matériau en centrifugant 2x avec 200 μL de 80% ACN/5% NH₄OH. Éluez les peptides restants avec 200 μL de 10% NH₄OH (E5).
9. Sécher complètement toutes les élutions à l’aide d’un concentrateur à vide centrifuge à environ 35 °C.
10. Effectuer le dessalage de l’élution de base (E5) à l’aide d’une pointe de dessalage selon le protocole du fabricant.
11. Sécher l’élution de la pointe de dessalement à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide à environ 35 °C pour être complet.

4. Enrichissement en phosphopeptides Ti(IV)-IMAC

REMARQUE: Les vitesses et les temps exacts de la centrifugeuse peuvent différer en fonction des échantillons et doivent être optimisés. En général, 300 x g pendant 2 min est approprié pour le conditionnement et le lavage du matériau et 100 x g pendant 5 min pour l’élution.

1. Peser environ 3 mg de coton et l’emballer dans une pointe de pipette vide de 200 μL (spin-tip).
2. Transférer le matériau d’enrichissement en phosphopeptides Ti-IMAC dans un tube et ajouter 200 μL de TFA à 0,1 % par matériau de 10 mg. Pour l’enrichissement de 500 μg de peptides, utilisez 10 mg de matériau.
3. À l’aide d’un adaptateur de tube, placez la pointe de rotation sur un tube de 2 mL et ajoutez suffisamment de boue à la pointe pour un matériau de 10 mg. Retirez le liquide en le faisant tourner dans une centrifugeuse de paillasse.
4. Conditionnez le matériau avec 200 μL de 40 % ACN/3 % TFA en utilisant les mêmes réglages de centrifugeuse que ceux décrits ci-dessus. Remettre en suspension des échantillons de peptides dans 200 μL de 40 % d’ACN/3 % de TFA et s’écouler à travers la pointe de spin. Rechargez le flux deux fois pour assurer une liaison plus complète.
5. Laver le matériau par centrifugation avec 200 μL de 50 % d’ACN, 6 % de TFA et 200 mM de NaCl, puis lavage 2x dans 200 μL de 30 % d’ACN et 0,1 % de solution de TFA.
6. Peptides élués avec 200 μL de 10% NH₄OH. Sécher complètement l’élution sous vide. Effectuez le dessalement à l’aide d’une pointe de dessalement selon le protocole du fabricant. Sécher l’élution de la pointe de dessalement sous vide jusqu’à l’exhaustivité.

5. Enrichissement simultané Ti(IV) à double fonction

REMARQUE: Les vitesses et les temps exacts de la centrifugeuse peuvent différer en fonction des échantillons et doivent être optimisés. En général, 300 x g pendant 2 min est approprié pour le conditionnement et le lavage du matériau et 100 x g pendant 5 min pour l’élution.

1. Peser environ 3 mg de coton et l’emballer dans une pointe d’essorage vide.
2. Transférer environ 1 g de matériau Ti(IV)-IMAC dans un tube. Ajouter 0,1 % de TFA à une concentration connue de matériau, par exemple 20 mg/200 μL (le matériau peut être conservé dans cette suspension à 4 °C).
3. Pour l’enrichissement à partir de peptides de 500 μg, ajoutez suffisamment de boue à une pointe de spin pour transférer 20 mg de matériau. Laver la pointe de rotation en centrifugant avec 200 μL de TFA à 0,1%.
4. Remettre les échantillons en suspension dans 200 μL de solvant de chargement/lavage (80 % d’ACN et 3 % de TFA) et faire circuler la pointe d’essorage. Rechargez le flux 2x.
5. Lavez la pointe d’essorage 6x par centrifugation avec 200 μL de solvant de chargement/lavage. Lavez la pointe de rotation avec 200 μL de solution à 80 % d’ACN/0,1 % de FA.
6. Éluez les peptides avec 200 μL de chacun des éléments suivants : 60 % ACN/0,1 % FA (E1) et 40 % ACN/0,1 % FA (E2). Analysez chaque élution séparément.
7. Éluez les peptides avec 200 μL de chacun des éléments suivants: 20% ACN / 0,1% FA et 0,1% FA. Combinez les deux élutions et analysez comme un seul échantillon (E3).
8. Éluez les peptides avec 200 μL de chacun des éléments suivants: 40% ACN / 3% TFA; 50 % ACN/6 % TFA, 200 mM NaCl; et 30 % d’ACN/0,1 % d’AFE. Combinez ces élutions et analysez-les comme une seule (E4) après le dessalement à l’aide d’une pointe emballée.
9. Conditionnez le matériau au pH de base en utilisant 200 μL de 90 % ACN/2,5 % NH₄OH pour 3x. Jetez ces lavages.
10. Éluez les peptides avec 200 μL de chacun des éléments suivants : 60 % ACN/10 % NH₄OH (E5) et 40 % ACN/10 % NH₄OH (E6). Analysez ces élutions séparément après le dessalage à l’aide d’une pointe emballée.
11. Éluez les peptides avec 200 μL de chacun des éléments suivants: 20% ACN / 10% NH₄OH; 10 % ACN/10 % NH₄OH; et 10 % de NH₄OH. Combinez ces élutions et analysez-les comme une seule (E7) après le dessalement à l’aide d’une pointe emballée.
12. Séchez complètement toutes les élutions sous vide.

6. Chromatographie liquide à phase inversée à nano-écoulement-spectrométrie de masse (nRPLC-MS)

REMARQUE: Les méthodes d’acquisition et d’analyse des données MS sont diverses, et donc un seul pipeline LC-MS suggéré (et ses paramètres associés) est décrit ici dans les étapes suivantes. Les échantillons générés à l’aide des étapes de préparation et d’enrichissement des échantillons décrites précédemment peuvent être analysés à l’aide d’autres configurations instrumentales, y compris à l’aide de colonnes chromatographiques disponibles dans le commerce, avec une qualité de données suffisante.

1. Tirer et emballer un capillaire de 15 cm de long (75 μm de diamètre intérieur) à l’aide d’un matériau en C18 tel que décrit au^{point 19}. Préparer la phase mobile A (0,1 % d’AF dans l’eau) et la phase mobile B (0,1 % d’AF dans l’ACN).
2. Reconstituer des échantillons de peptides enrichis en 15 μL de phase B mobile à 3 %. Chargez 2 μL de l’échantillon (~13 % du volume de l’échantillon) directement sur la colonne. Analysez chaque échantillon en double technique.
3. Elute peptides utilisant un gradient de 3% à 30% de phase B mobile sur 90 min à un débit de 0,3 μL/min. Lavez la colonne à 75% B pendant 8 min suivi de 95% B pendant 8 min, en terminant la méthode avec un équilibrage à 3% B pendant 12 min.
4. Faire fonctionner le spectromètre de masse en mode ion positif en utilisant l’acquisition dépendante des données des 20 premiers pics avec les paramètres suivants: tension de pulvérisation 2 kV; Détection MS¹ en LC/MS de 400 à 2 000 m/z à une résolution de 120 000, cible de contrôle automatique du gain (AGC) 2E5, temps d’injection maximal de 100 ms, lentille RF de 30 %, isolation quadripolaire avec fenêtre de 1,6 m/z , pour les états de charge 2 à 8 et indéterminés, et exclusion dynamique de 30 s ; Détection MS² dans le LC/MS à l’aide d’une fragmentation HCD échelonnée à 22 %, 30 % et 38 %, première masse fixe de 120 m/z à une résolution de 30 000, cible AGC 5E4 et intensité minimale requise de 2,5E4.

7. Analyse des données sur la SEP

REMARQUE : Un pipeline d’analyse de données utilisant deux logiciels différents pour analyser le même jeu de données est présenté ici. La phosphorylation et la glycosylation peuvent être recherchées en même temps à l’aide d’un seul logiciel au lieu de deux logiciels distincts comme décrit ici, bien qu’en général, le temps de recherche du logiciel soit proportionnel à l’espace de recherche, c’est-à-dire au nombre de PTM considérés. Pour cette raison, deux logiciels différents sont utilisés parallèlement à la recherche de glycopeptides et de phosphopeptides.

1. Traiter les fichiers de données brutes à l’aide du logiciel approprié (voir Tableau des matériaux).
   1. Recherchez des spectres dans la base de données UniProt humaine (ou spécifique à une espèce appropriée). Définir la carbamidométhylation de Cys comme une modification fixe. Définissez le nombre maximal de décolletés enzymatiques manqués sur deux.
2. Dans les fichiers de données brutes, à l’aide d’un logiciel commercial (voir Tableau des matériaux), recherchez les glycopeptides à analyser²⁰. Utilisez une tolérance de masse de précurseur de 10 ppm et une tolérance de masse de fragment de 0,01 Da avec une longueur peptidique minimale de quatre résidus.
   1. Recherche à l’aide de la base de données N-glycane intégrée au logiciel élargie avec des glycanes typiques du mannose-6-phosphate(M6P), y compris HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) et HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1).
   2. Définir la N-glycosylation comme une modification commune. Définissez le nombre maximal de modifications totales par correspondance spectrale peptidique (PSM) comme un commun et deux rares.
   3. Définissez les modifications variables suivantes : oxydation de Met (rare), désamidation à Asn et Gln (rare) et phosphorylation à Ser, Thr et Tyr (commun). Définissez les filtres d’identification suivants : seuil de score > 150, |log prob| > 1 et le score delta mod > 10.
   4. Exportez et analysez les résultats de recherche dans les onglets Protéines et Groupe de peptides.
   5. Examiner manuellement les identifications contenant des glycanes M6P pour détecter la présence de l’ion oxonium PhosphoHex (243 m/z) dans les spectres MS/MS et supprimer les identifications faussement positives, qui ne contiennent pas cet ion diagnostique.
3. Dans les fichiers de données brutes, à l’aide d’un logiciel open source (voir Tableau des matériaux), recherchez les phosphopeptides à analyser²¹. Utilisez une tolérance peptidique de recherche première de 20 ppm et une tolérance peptidique de recherche principale de 4,5 ppm.
   1. Définissez le nombre maximal de modifications par peptide sur 5. Réglez le PSM et le taux de fausse découverte de protéines (FDR) à 1% et la longueur minimale du peptide à 7 résidus.
   2. Définissez des modifications variables comme l’oxydation au Met, l’acétylation de la protéine N-terminale et la phosphorylation à Ser, Thr et Tyr. Analysez les résultats de la recherche à l’aide des fichiers modificationSpecificPeptides.
4. Déterminez le nombre d’identifications des PTM au niveau des protéines, des peptides et du site de modification.

Résultats

Des données représentatives de spectrométrie de masse, y compris des fichiers bruts et des résultats de recherche, ont été déposées au ProteomeXchange Consortium via le référentiel partenaire PRIDE avec l’identificateur de jeu de données PXD033065²².

Dans ce travail, des répliques d’injection en double ont été analysées pour chaque élution d’enrichissement. Les identifications effectuées à partir des deux répliques techniques ont été ...

Discussion

La stratégie Ti(IV)-IMAC à double fonction est utile pour l’analyse simultanée des N-glycopeptides et des phosphopeptides du même échantillon dans un seul flux de travail de préparation d’échantillon. Il a également été démontré que les méthodes basées sur ERLIC permettent d’enrichir simultanément les PTM. Les deux stratégies ont déjà été utilisées pour une couverture approfondie dans les analyses PTM^14,18. En adaptant la méthode dual ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic Acid, Glacial (Certified ACS)	Fisher Scientific	A38S-500
Acetone (Certified ACS)	Fisher Scientific	A18-1
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade	Fisher Scientific	A955-4
Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	A637-500
Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus)	Fisher Scientific	A669-212
Byonic software	Protein Metrics	n/a	Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH material	Waters	186002353	Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet)
CAE-Ti-IMAC, 100%	J&K Scientific	2749380-1G	Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment
Cellcrusher kit	Cellcrusher	n/a	Used for grinding tissue samples into powder before extraction
Eppendorf 5424R Microcentrifuge	Fisher Scientific	05-401-205	For temperature-controlled centrifugation
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets	Sigma	11697498001
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)	Promega	V3151	Protein reducing agent
Ethanol, 200 proof (100%), USP	Fisher	22-032-601
Fisherbrand Analog Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	02-681-320
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321
Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	For sample lysis using ultrasonication
Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade	Fisher Scientific	A117-50
Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter)	Polymicro Technologies LLC	100 m TSP075375	For in-house pulled and packed columns with integrated emitter
Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O)	Sigma-Aldrich	339261-100ML	Used for opening emitter of pulled capillary column
Iodoacetamide, BioUltra	Sigma	I1149-5G	Protein reducing reagent
MaxQuant software	n/a	n/a	Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/)
Multi-therm Shaker with heating and cooling	Benchmark Scientific	H5000-HC	Heating block
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk	Waters	186000383	Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each)
OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips	Agilent	A57003100	Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-2000/F	For pulling nano-capillary columns for LC-MS
PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets	Sigma	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Fisher Scientific	23275
PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å)	PolyLC	BMSX1203	Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment
Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	P285-500
Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate	Next Advance	PC77-MAG	For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit
Proteome Discoverer software	Thermo Fisher Scientific	n/a	Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120	Savant	n/a	Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat)
SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis	Fisher Scientific	BP2436200
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-500
TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96	Glygen Corporation	TT2EMT.96	Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile))	Sigma	90360-100ML
Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99%	Fisher Scientific	60-017-61
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)	Fisher Scientific	BP152-500
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade	Promega	V5071
Urea (Certified ACS)	Fisher Scientific	U15-500
Water, Optima LC/MS Grade	Fisher Scientific	W64