La microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM) permite obtener imágenes de superresolución y etiquetado de alta eficiencia

Resumen

Se demuestra un protocolo de microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM). LR-ExM utiliza un novedoso conjunto de anclajes trifuncionales, que proporciona una mejor eficiencia de etiquetado en comparación con las microscopías de expansión introducidas anteriormente.

Resumen

La microscopía de expansión (ExM) es una técnica de preparación de muestras que se puede combinar con la mayoría de los métodos de microscopía óptica para aumentar la resolución. Después de incrustar células o tejidos en hidrogel hinchable, las muestras se pueden expandir físicamente de tres a dieciséis veces (dimensión lineal) en comparación con el tamaño original. Por lo tanto, la resolución efectiva de cualquier microscopio se incrementa por el factor de expansión. Una limitación importante del ExM introducido previamente es la reducción de la fluorescencia después de la polimerización y el procedimiento de digestión. Para superar esta limitación, se ha desarrollado la microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM), que evita la pérdida de señal y mejora en gran medida la eficiencia del etiquetado utilizando un conjunto de nuevos anclajes trifuncionales. Esta técnica permite lograr una resolución más alta cuando se investigan estructuras celulares o subcelulares a escala nanométrica con una pérdida mínima de señal fluorescente. LR-ExM se puede utilizar no solo para el etiquetado de inmunofluorescencia, sino también con etiquetas de proteínas automarcantes, como las etiquetas SNAP y CLIP, logrando así una mayor eficiencia de etiquetado. Este trabajo presenta el procedimiento y la solución de problemas para este enfoque basado en la inmunotinción, así como la discusión de los enfoques de etiquetado automático de LR-ExM como alternativa.

Introducción

La microscopía de expansión (ExM) ha sido utilizada por los investigadores desde que se introdujo por primera vez como un enfoque conveniente para lograr imágenes de súper resolución con microscopios convencionales, como los microscopios de epifluorescencia y confocales 1,2,3,4,5,6,7 . Usando ExM, es posible lograr una resolución lateral de ~70 nm incluso con microscopios confocales regulares. Cuando ExM se combina con imágenes de súper resolución, la resolución se mejora aún más. Por ejemplo, se puede lograr una resolución de aproximadamente 30 nm con microscopía de iluminación estructurada (SIM), y una resolución de aproximadamente 4 nm con microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM)^1,5.

Sin embargo, la baja eficiencia de etiquetado es un problema crítico con los métodos ExM estándar. La pérdida de fluorescencia puede variar según el tipo de grupos fluorescentes y el tiempo de digestión. En promedio, sin embargo, se ha relatado que más del 50% de los fluoróforos se pierden después de la polimerización y los pasos de digestión de proteínas de ExM, lo que es perjudicial para la calidad de la imagen ^3,4.

Por lo tanto, se ha desarrollado la microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM), que puede retener etiquetas de manera eficiente y reducir la pérdida de señal¹. La innovación clave de LR-ExM es el uso de un conjunto de anclajes trifuncionales en lugar de simplemente usar colorantes fluorescentes, como en el procedimiento estándar ExM, para teñir proteínas de interés. Estos enlazadores trifuncionales constan de tres partes: (1) el conector (por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS)) para conectarse al anticuerpo, (2) el anclaje (por ejemplo, metacrilamida (MA)) para anclar proteínas al polímero, y (3) el informador (por ejemplo, biotina o digoxigenina (DIG)) para conjugar a un colorante orgánico. Los anclajes trifuncionales sobreviven a los pasos de polimerización y digestión de proteínas y, por lo tanto, evitan la pérdida de fluoróforos.

Además, este método tiene un gran potencial ya que es compatible con etiquetas enzimáticas autoetiquetadas como SNAP o CLIP. Los enfoques de etiquetas enzimáticas tienen algunos beneficios sobre el enfoque de inmunotinción con respecto a la alta especificidad y la eficiencia de etiquetado ^8,9,10.

En este manuscrito, se demuestra un procedimiento detallado de LR-ExM. LR-ExM es un método altamente efectivo y flexible para lograr una alta resolución espacial con una mayor eficiencia de etiquetado.

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Utilice células U2OS cultivadas en medio 5A de McCoy suplementado con 10% de FBS a 37 °C en 5% de_CO2.
2. Cultive las células en un vidrio de cubierta con cámara extraíble de 16 pozos (área de cultivo de 0,4 cm²) para facilitar su manejo.

2. Fijación y permeabilización

NOTA: Las condiciones de fijación y permeabilización dependen de los protocolos optimizados de inmunotinción. El siguiente es un protocolo de fijación y permeabilización para la co-inmunotinción de microtúbulos y fosas recubiertas de clatrina (CCP).

1. Una vez que los recuentos celulares alcancen ~0.04 x 10 6, fije las células con 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 3.2% en tampón PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA y 1 mM MgCl₂, pH^6.9) durante 10 min a temperatura ambiente (Tabla 1).
   NOTA: La fijación con PFA se realiza en una campana de seguridad certificada.
2. Lave las células tres veces durante 5 minutos cada una con 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Permeabilizar las células con los 100 μL de tampón de permeabilización a temperatura ambiente durante 15 min (Tabla 1).
   NOTA: Proceda con el etiquetado lo antes posible para evitar la degradación de la proteína diana, el ARN o el ADN, y para obtener un resultado óptimo. Sin embargo, si es necesario, las muestras fijas pueden almacenarse durante un tiempo prolongado (hasta un mes) en un tampón PBS a 4 °C. Reemplace cualquier PBS evaporado y proteja la muestra del fotoblanqueo.

3. Bloqueo endógeno de estreptavidina y biotina

1. Incubar las células con la solución de estreptavidina diluida en un tampón de bloqueo celular (100 μL) durante 15 min a temperatura ambiente (Tabla 1).
2. Enjuague brevemente con 200 μL de tampón de bloqueo celular.
3. Incubar las células con 100 μL de solución de biotina diluida en un tampón de bloqueo celular durante 15 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Cuando utilice un enfoque de etiquetado automático, como el uso de etiquetas SNAP o CLIP-, omita el paso 4 y continúe con el paso 5.1: Enfoque de etiquetado automático.

4. Tinción primaria de anticuerpos

1. Incubar células con anticuerpos anti-α-tubulina de rata (dilución 1:500) y anticuerpos de cadena pesada anticlatrina de conejo (dilución 1:100) en 100 μL de tampón de bloqueo celular durante 16 h a 4 °C o 1 h a temperatura ambiente. Duplique el tiempo de incubación de las muestras de tejido.
2. Lave las muestras cuatro veces con 200 μL de PBS durante 5 minutos cada una.

5. Tinción de anticuerpos secundarios específicos de LR-ExM

1. Anticuerpos IgG conjugados con los enlazadores trifuncionales como N-hidroxisuccinimida (NHS) - metacrilamida (MA) -Biotina o NHS-MA-Digoxigenina (Dig) (Figura 1B). La síntesis de anclajes trifuncionales y la conjugación de los anticuerpos secundarios se introducen previamente en Shi et ^al.1. Enfoque de etiquetado automarcado: anticuerpos IgG conjugados con los enlazadores trifuncionales, como MA-bencilguanina (BG)-biotina o MA- bencilcitosina (BC)-Dig (Figura 1B). La síntesis de anclajes trifuncionales y una conjugación de los anticuerpos secundarios se introducen previamente en Shi et ^al.1.
2. Incubar células con los anticuerpos secundarios burro anti-conejo-Dig-MA (dilución 1:100) y burro anti-rata-biotina-MA (dilución 1:100) en 100 μL de tampón de bloqueo celular durante 1 h a temperatura ambiente. Duplique este tiempo de incubación para las muestras de tejido.
3. Lave las muestras cuatro veces en 200 μL de PBS durante 5 minutos cada una.

6. Anclaje adicional

1. Incubar células con glutaraldehído (GA) al 0,25% en PBS (100 μL) durante 15 min a temperatura ambiente para anclar las proteínas al hidrogel. Alternativamente, use éster de N-hidroxisuccinmida de ácido metacrílico de 25 mM (MA-NHS) para el anclaje. Se recomienda una incubación de una hora a temperatura ambiente.
2. Lave las muestras tres veces en PBS durante 5 minutos cada una.

7. Gelificación

NOTA: La velocidad de expansión está determinada por el tiempo de difusión de sal y agua hacia afuera o dentro del gel; Por lo tanto, la fundición de geles finos acelera el tiempo de expansión.

1. Retire la estructura superior de la placa de gel de 16 pocillos. Agregue 40 μL de solución de monómero a cada pocillo para acondicionar las células en hielo. Incubar en hielo durante 5 min.
   1. Para preparar una solución de monómero, ver Tabla 2.
2. Prepare la solución de gelificación en hielo. Agregue agua destilada doble y un acelerador de N,N,N′,N′ tetrametiletilendiamina (TEMED) al 10% a la solución de monómero (TEMED al 10%: solución de monómero = 1:47); no agregue el iniciador todavía (Tabla 3).
3. Para una cámara de cultivo celular con un área de 0,4 cm², use un volumen de solución de gelificación de aproximadamente 40 μL. Prepare 45 μL de solución de gelificación para cada pocillo.
4. Agregue persulfato de amonio (APS) al 10% a la solución de gelificación, incubar en hielo e inmediatamente pipetear 40 μL de solución de gelificación en cada junta de silicona bien sobre hielo. Incubar en hielo durante 3 min (10% APS:10% TEMED:solución monómera = 1:1:47).
5. Proteger la muestra de la luz y mover el vidrio de cubierta de la placa de Petri de 10 cm a una incubadora a 37 °C durante 1,5 h para la gelificación. Para mantener la humedad del gel durante la incubación a 37 °C, cubra la placa de Petri con la tapa y ponga unas gotas de agua en la placa de Petri.

8. Digestión

1. Después de la gelificación, retire el vaso para separar el gel y transfiera el gel a la placa de 6 pocillos. Digerir las células incrustadas con 2 ml de tampón de digestión (Tabla 1) durante la noche a temperatura ambiente o 4 h a 37 °C. Use al menos 10 veces el exceso de volumen de tampón de digestión.
2. Lave los geles con al menos un exceso de 10 veces el volumen de agua que el volumen final del gel. Repita el paso de lavado cuatro veces durante 20 a 30 minutos cada vez. El gel se expande aproximadamente dos veces en cada dimensión.
   NOTA: Las muestras de gel se pueden almacenar hasta 1 mes en un tampón PBS a 4 °C. Reemplace el agua evaporada para evitar que se seque y proteja la muestra de la luz durante el almacenamiento. Para evitar la degradación de los anclajes trifuncionales, las muestras deben teñirse lo antes posible después de la digestión y el lavado.

9. Tinción de fluorescencia post-digestión

1. Incubar geles en un volumen de 2 ml de tampón de tinción de estreptavidina (STV)/digoxigenina (DIG) con colorante STV de 2 a 5 μM y/o colorante anti-DIG durante 24 h a temperatura ambiente. Mantenga las muestras en la oscuridad.

10. Expansión

1. Lave y expanda el gel cuatro veces con agua excesiva (2-3 ml) durante 30 minutos a 1 h cada vez.
2. Para facilitar la visualización de las células bajo microscopía fluorescente, tiñe las células con DAPI durante el tercero de los cinco lavados. Concentración madre diluida de DAPI (5 mg/ml, almacenada a 4 °C) en diluciones 1:5.000 en agua de lavado. Incubar el gel con una solución de agua DAPI (2 mL) durante 30 min a 1 h.
3. Lave dos veces adicionales con 3 ml de agua.
4. Expanda los geles en cualquier plato plano que sea lo suficientemente grande como para contener las muestras. Los geles expandidos que se preparan en vidrio de cubierta de^{0,4 cm 2} encajan muy bien en una placa de 6 pocillos con fondo de vidrio.
   NOTA: Las muestras teñidas después de la expansión se pueden almacenar hasta 4 meses en un tampón PBS a 4 ° C. Agregue suficiente agua para evitar que se seque y proteja la muestra del fotoblanqueo. Repita el paso de expansión y tinción DAPI antes de la imagen. Para evitar cualquier riesgo de degradación del fluoróforo, las muestras deben ser fotografiadas tan pronto como sea posible.

11. Imágenes

1. Cubra la cámara de imágenes con fondo de vidrio de 6 pocillos con poli-L-lisina al 0,01% (3 ml cada una) para inmovilizar las muestras de gel.
2. Transfiera muestras de gel a la cámara de imágenes recubierta.
3. Imagen de las muestras con cualquier osciloscopio de fluorescencia deseado.

Resultados

Los hoyos recubiertos de clotrina (CCP) se inmunotiñen utilizando anclajes trifuncionales (Figura 1B) y LR-ExM se realiza como se describe en la Figura 1A. LR-ExM (Figura 2C,E) muestra una intensidad de fluorescencia mucho mayor en comparación con la microscopía de expansión de retención de proteínas (proExM, Figura 2A) o la biotina-ExM (Figura 2B); l...

Discusión

La innovación clave de LR-ExM es utilizar anclajes trifuncionales para etiquetar eficazmente las proteínas diana y mejorar la calidad de imagen. Este método está limitado por anclajes trifuncionales, que no están tan fácilmente disponibles para los investigadores. Sin embargo, los anclajes trifuncionales se pueden compartir con otros investigadores a pedido, y productos similares como las sondas ExM de Chrometa ahora también están disponibles comercialmente.

En este protocolo, se ha re...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate