Analisi dinamica della diffusione della luce per la determinazione della dimensione delle particelle dei complessi ferro-carboidrati

Riepilogo

La diffusione dinamica della luce (DLS) è emersa come un test adatto per valutare la dimensione delle particelle e la distribuzione dei complessi ferro-carboidrati somministrati per via endovenosa. Tuttavia, i protocolli mancano di standardizzazione e devono essere modificati per ogni complesso ferro-carboidrati analizzato. Il presente protocollo descrive l'applicazione e le considerazioni speciali per l'analisi del saccarosio di ferro.

Abstract

I complessi di nanoparticelle ferro-carboidrati somministrati per via endovenosa sono ampiamente usati per trattare la carenza di ferro. Questa classe comprende diversi complessi di nanoparticelle strutturalmente eterogenei, che mostrano una sensibilità variabile alle condizioni richieste per le metodologie disponibili per caratterizzare fisicamente questi agenti. Attualmente, gli attributi critici di qualità dei complessi ferro-carboidrati non sono stati completamente stabiliti. La diffusione dinamica della luce (DLS) è emersa come un metodo fondamentale per determinare la dimensione e la distribuzione delle particelle intatte. Tuttavia, rimangono ancora sfide per quanto riguarda la standardizzazione delle metodologie tra i laboratori, le modifiche specifiche richieste per i singoli prodotti a base di carboidrati di ferro e il modo migliore per descrivere la distribuzione delle dimensioni. È importante sottolineare che le diluizioni diluente e seriali utilizzate devono essere standardizzate. L'ampia varianza negli approcci per la preparazione dei campioni e la segnalazione dei dati limita l'uso del DLS per il confronto degli agenti ferro-carboidrati. Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo robusto e facilmente riproducibile per misurare le dimensioni e la distribuzione dimensionale del complesso ferro-carboidrati, il saccarosio di ferro, utilizzando la media Z e l'indice di polidispersità.

Introduzione

Il saccarosio di ferro (IS) è una soluzione colloidale composta da nanoparticelle costituite da un complesso di un nucleo polinucleare di ferro-ossiidrossido e saccarosio. L'IS è ampiamente impiegato per trattare la carenza di ferro tra i pazienti con un'ampia varietà di stati patologici di base che non tollerano l'integrazione orale di ferro o per i quali il ferro orale non è efficace¹. L'IS appartiene alla classe di farmaci complessi come definita dalla Food and Drug Administration (FDA), che è una classe di farmaci con chimica complessa commisurata ai biologici². La valutazione regolatoria di farmaci complessi può richiedere ulteriori metodi fisico-chimici ortogonali e/o studi preclinici o clinici per confrontare accuratamente i farmaci complessi di follow-on ^3,4. Questo è importante perché diversi studi hanno riportato che l'uso di IS rispetto a un prodotto IS di follow-on non produce gli stessi risultati clinici. Ciò sottolinea la criticità dell'uso di tecniche di caratterizzazione nuove e ortogonali che sono adatte a rilevare differenze nelle proprietà fisico-chimiche tra i prodotti IS ^5,6.

La spiegazione accurata delle dimensioni e della distribuzione dimensionale dell'IS è di importanza clinica, poiché la dimensione delle particelle è un importante fattore influente nel tasso e nell'estensione dell'opsonizzazione - il primo passo critico nella biodistribuzione di questi farmaci complessi ^7,8. Anche lievi variazioni nella dimensione delle particelle e nella distribuzione granulometrica sono state correlate a cambiamenti nel profilo farmacocinetico dei complessi di nanoparticelle ferro-ossido ^9,10. Un recente studio di Brandis et al. ha mostrato che la dimensione delle particelle misurata dal DLS era significativamente diversa (14,9 nm ± 0,1 nm vs 10,1 nm ± 0,1 nm, p < 0,001) quando si confrontava un farmaco elencato di riferimento e un generico gluconato ferrico di sodio, rispettivamente¹¹. La qualità, la sicurezza e l'efficacia costanti da lotto a lotto dei prodotti a base di carboidrati di ferro dipendono interamente dallo scale-up del processo di produzione e la potenziale deriva della produzione deve essere attentamente considerata⁹. Il processo di fabbricazione può causare saccarosio residuo e questo varierà in base al produttore¹². Qualsiasi modifica nelle variabili del processo di fabbricazione può portare a cambiamenti significativi nel prodotto farmaceutico complesso finale per quanto riguarda la struttura, la stabilità complessa e la disposizione in vivo ⁹.

Per valutare la coerenza del farmaco e prevedere il comportamento in vivo del farmaco, sono necessarie metodologie analitiche ortogonali contemporanee per determinare le proprietà fisico-chimiche di nanofarmaci complessi. Tuttavia, vi è una mancanza di standardizzazione delle metodologie, che può comportare un elevato grado di variazione interlaboratorio nella comunicazione dei risultati¹³. Nonostante il riconoscimento di queste sfide da parte delle autorità di regolamentazione globali e della comunità scientifica¹⁴, la maggior parte delle caratteristiche fisico-chimiche dell'IS rimane scarsamente definita e non è stata definita la piena gamma di attributi critici di qualità nel contesto dei documenti di orientamento normativi disponibili¹⁵. La bozza di documenti guida specifici del prodotto emessi dalla FDA per i complessi ferro-carboidrato suggerisce DLS come procedura per valutare le dimensioni e la distribuzione delle dimensioni dei prodotti di follow-on^16,17.

Diverse pubblicazioni hanno dettagliato i protocolli DLS stabiliti per determinare le dimensioni delle nanoparticelle IS^13,18. Tuttavia, poiché la preparazione del campione, le condizioni della procedura, la strumentazione e i parametri di impostazione della strumentazione sono diversi tra i metodi pubblicati, i risultati DLS non possono essere confrontati direttamente in assenza di un metodo standardizzato per interpretare i risultati^13,18. La diversità delle metodologie e degli approcci di comunicazione dei dati limita la valutazione appropriata di tali caratteristiche a fini comparativi¹⁹. È importante sottolineare che molti dei protocolli DLS precedentemente pubblicati per valutare l'IS non tengono conto dell'effetto della diffusione del saccarosio nella sospensione a causa della presenza di saccarosio libero, che ha dimostrato di elevare spuriamente i raggi idrodinamici calcolati in media Z delle nanoparticelle nelle soluzioni colloidali^13,18. Il presente protocollo mira a standardizzare la metodologia per la misurazione della dimensione delle particelle e della distribuzione di IS. Il metodo è stato sviluppato e convalidato a tale scopo.

Protocollo

1. Utilizzo della macchina

1. Avviamento della macchina e del software
   NOTA: la figura supplementare S1A-D descrive i passaggi per l'avvio della macchina e del software.
   1. Accendere lo strumento almeno 30 minuti prima di iniziare le misurazioni, quindi avviare il PC.
   2. Fare doppio clic sull'icona del software dello strumento per avviare il programma.
   3. Inserisci il nome utente e la password nella finestra di login. Assicurati che ogni utente abbia il proprio account.
   4. Attendere che tutte e tre le barre nere nell'angolo in basso a destra si illuminino di verde, indicando che l'unità è pronta per l'uso.
   5. In caso di lunghi periodi di inattività, quando l'utente viene automaticamente disconnesso, in Sicurezza, fare clic su Login e immettere nuovamente la password.
2. Creazione di un file di misurazione
   NOTA: all'inizio di ogni giorno di misurazione viene creato un nuovo file di misurazione. Tutte le misurazioni sono elencate e memorizzate nel file di misurazione. Per informazioni dettagliate su questa procedura, vedere la figura supplementare S2A-B.
   1. Creare un nuovo file di misurazione facendo clic su File | Novità | File di misurazione. Nella finestra aperta, selezionare la posizione di memorizzazione e assegnare un nome al file di misurazione. Conferma i dettagli facendo clic su Salva.
   2. Per aprire un file, fare clic su File | Aperto | File di misurazione. Selezionare il file di misurazione nella finestra aperta, confermare i dettagli facendo clic su Apri, selezionare il nome del file e fare clic su Salva.
3. Stampa dei risultati
   1. Stampare o salvare i risultati del test di idoneità del sistema (SST) (vedere il punto 1.5) e il valore medio della misurazione del campione secondo la figura supplementare S3.
   2. Contrassegnare le misurazioni nella vista Record del file di misurazione.
   3. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Batch Print e attendere l'apertura di un'altra piccola finestra.
   4. Selezionare il rapporto Intensità PSD dalle scelte e confermarlo facendo clic su OK.
4. Procedura generale per avviare una misurazione
   NOTA: La procedura per iniziare una misurazione è descritta nella figura supplementare S4A-D. Seguire il percorso descritto di seguito per il file dei parametri di unità richiesto (denominato SOP):
   1. Selezionare la SOP richiesta dall'elenco a discesa. Poiché nell'elenco vengono visualizzate le SOP utilizzate più di recente, se è necessaria una SOP precedente, selezionare Cerca SOP e confermare facendo clic sulla freccia verde. Una volta aperta la posizione di memorizzazione delle SOP, procedere con il passaggio 1.4.2.
      NOTA: Per i dettagli degli importanti parametri di sistema specifici per il saccarosio di ferro (ad esempio, tempo di equilibrio di un attenuatore), vedere la Tabella 1.
   2. Nella finestra aperta, creare le voci richieste in Nome e note di esempio. Confermare facendo clic su OK e attendere che la finestra di misurazione si apra automaticamente.
   3. Avviare la misurazione facendo clic sul pulsante verde Start .
   4. Una volta che un segnale acustico suona alla fine della misurazione, chiudere la finestra di misurazione .
5. Misurazione del test di idoneità del sistema (SST)
   NOTA: Non toccare la parte inferiore della cuvetta (zona di misurazione). All'inizio e alla fine della sequenza, misurare lo standard di particelle a 20 nm.
   1. Riempire ~ 1 mL della particella standard non diluita in una cuvetta di polistirolo e chiudere con il coperchio.
      NOTA: Lo standard diluito preparato al punto 1.5.1 può essere utilizzato per 1 mese.
   2. Dopo il riempimento, chiudere la cuvetta e verificare la presenza di bolle d'aria. Rimuovere le bolle d'aria toccando leggermente la cuvetta.
   3. Posizionare la cuvetta nel supporto della cella dello strumento con il segno di freccia rivolto in avanti e chiudere il coperchio della camera di misurazione.
   4. Caricare il parametro di unità SOP e immettere i seguenti dati nella finestra iniziale:
      Nome campione: SST 20 nm Particle Standard
      Quindi, aggiungi una nota: numero identificativo e data di scadenza dello standard
   5. Avviare la misurazione.
   6. Dopo la fine della misurazione, quando suona il segnale acustico, chiudere la finestra di misurazione.
   7. Stampare la relazione (cfr. punto 1.1.3).
      NOTA: L'SST viene superato se la dimensione delle particelle Z-media corrisponde al valore del certificato di analisi ± 10%.
6. Misurazione della soluzione di saccarosio di ferro
   1. Pipettare 0,5 mL di una soluzione IS con un contenuto di ferro del 2% m/V in un matraccio tarato da 25 mL e riempire fino al volume con acqua a basso contenuto di particelle (ad esempio appena deionizzata e filtrata [dimensione dei pori 0,2 μm]); questa soluzione contiene 0,4 mg di Fe/ml.
      NOTA: la preparazione del campione nel passaggio 1.6.1. Con questa diluizione specifica è stata stabilita durante lo sviluppo del metodo, e questo è stato determinato come la diluizione ottimale per questo scopo.
   2. Per la pulizia preliminare, riempire la cuvetta di polistirolo per circa 3/4 con la soluzione di misurazione preparata, ruotare delicatamente e quindi svuotare il più completamente possibile.
      NOTA: Non toccare la parte inferiore della cuvetta (zona di misurazione) ed evitare bolle d'aria non scuotendo la cuvetta.
   3. Per la misurazione, pipettare 1 mL della soluzione di misurazione nella cuvetta e mettere su un coperchio.
   4. Controllare la soluzione di misurazione nella cuvetta per le bolle d'aria. Se ci sono bolle d'aria, rimuoverle picchiettando leggermente la cuvetta.
7. Esecuzione della misurazione
   1. Posizionare la cuvetta di plastica con la soluzione di misurazione nel dispositivo con il segno di freccia rivolto in avanti e chiudere il coperchio.
   2. Caricare la SOP dei parametri (vedere il passaggio 1.4.1) e immettere i seguenti dati nella finestra iniziale:
      Nome campione: Numero di lotto
   3. Avviare la misurazione.
   4. Dopo la fine della misurazione, quando suona il segnale acustico, chiudere la finestra di misurazione .
   5. Calcolare il valore medio delle sei singole misurazioni secondo la figura supplementare S5. Contrassegnare le singole misurazioni nella vista Record del file di misurazione, fare clic con il pulsante destro del mouse su Crea risultato medio, aggiungere il nome del valore medio in Nome campione e confermare facendo clic su OK.
   6. Attendere che il software crei un nuovo record alla fine dell'elenco e cercare il nome immesso e il risultato medio in quel record.
   7. Stampare il report (vedere il passaggio 1.1.3).

Risultati

Il metodo descritto è stato convalidato secondo ICH Q2(R1)²⁰, che ha comportato la misurazione di soluzioni di prova in condizioni variabili. La precisione era solo dello 0,5% RSD per la dimensione media Z, mentre un massimo del 3,5% RSD è stato calcolato per il PDI. I risultati medi di diversi analisti e giorni differivano solo dello 0,4% per la dimensione media Z e dell'1,5% per il PDI. Le statistiche sono state calcolate da 12 misurazioni eseguite da due analisti in giorni diversi. Né le var...

Discussione

Il DLS è diventato un test fondamentale per la determinazione delle dimensioni e della distribuzione dimensionale delle nanoparticelle per applicazioni nello sviluppo di farmaci e nella valutazione normativa. Nonostante i progressi nelle tecniche DLS, esistono ancora sfide metodologiche per quanto riguarda la selezione del diluente e la preparazione del campione, che sono particolarmente rilevanti per i complessi ferro-carboidrati nelle soluzioni colloidali. È importante sottolineare che i metodi DLS per i nanofarmaci ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation