Domuz Damarı Greft Hastalığı Modelinin Kurulması ve Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokolde kardiyopulmoner bypass yapılmadan sol göğüs duvarında küçük bir kesiden yeni domuz ven baypas greftleme yapıldı. İntimal kalınlaşma gösteren postoperatif patoloji çalışması yapıldı.

Özet

Venöz greft hastalığı (VGH) koroner arter baypas greft (KABG) yetmezliğinin önde gelen nedenidir. Hastalık mekanizmalarının araştırılması ve terapötik stratejilerin geliştirilmesi için CABG-VGD'nin büyük hayvan modellerine ihtiyaç vardır.

Ameliyatı gerçekleştirmek için, üçüncü interkostal boşluktan kalp odasına giriyoruz ve iç meme damarını dikkatlice diseke ediyoruz ve normal saline batırıyoruz. Sağ ana koroner arter daha sonra iskemi için tedavi edilir. Hedef damar kesilir, bir şant tıkacı yerleştirilir ve greft veninin distal ucu anastomoz edilir. Asendan aort kısmen bloke edilir ve greft veninin proksimal ucu perforasyondan sonra anastomoz edilir. Greft veni açıklık açısından kontrol edilir ve proksimal sağ koroner arter bağlanır.

CABG cerrahisi, vasküler greft olarak kullanılmak üzere sol iç meme damarını toplamak için minipiglerde yapılır. Serum biyokimyasal testleri, hayvanların ameliyat sonrası fizyolojik durumlarını değerlendirmek için kullanılır. Ultrason muayenesi greft damarının proksimal, orta ve distal ucunun engelsiz olduğunu gösterir. Cerrahi modelde KABG cerrahisi sonrası histolojik inceleme ile greftte çalkantılı kan akımı, greftte intimal hiperplazi ile ilişkili venöz greft darlığı gözlenir. Buradaki çalışma, tekrarlanabilir KABG kaynaklı VGD modelinin oluşturulması için ayrıntılı cerrahi prosedürler sunmaktadır.

Giriş

Koroner kalp hastalığı mortalitesi son yıllarda önemli ölçüde azalmış olsa da, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki orta yaşlı yetişkinlerin yarısı her yıl iskemik kalple ilgili semptomlar geliştirir ve yaşlı yetişkinlerin üçte biri koroner kalp hastalığından ölür¹. Koroner arter baypas greftleme (KABG) miyokard iskemisini iyileştirmek için etkili bir cerrahi yöntemdir ve daha da önemlisi, çok damarlı koroner arter hastalığının tedavisinde yeri doldurulamaz bir cerrahi modalitedir². Bununla birlikte, zamanla, vasküler greftler inflamasyon, intimal hiperplazi ve ilerleyici ateroskleroz geliştirir ve bu da ven greft yetmezliğine veya ven greft hastalığına (VGD) yol açtığı ^{bilinmektedir3}. CABG'den sonraki hastalarda, restenoz meydana gelirse, bazı durumlarda sadece hastalıklı kan damarı değiştirilebilir². Yaşlı hastalar ve eklenen komorbiditeler, koroner arter baypas greftlemenin yeniden yapılmasını oldukça zorlaştırmaktadır. Aşılanmış kan damarları ile ilişkili patolojik problemlerin geciktirilmesi veya kontrol altına alınması çözülmesi gereken acil bir sorundur. Hastalık mekanizmalarının araştırılması ve terapötik stratejilerin geliştirilmesi için CABG-VGD'nin büyük hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Araştırmacılar, fareler⁴, sıçanlar⁵, tavşanlar⁶ ve domuzlar⁷ gibi küçük ve büyük hayvanlarda hayvan VGD modellerini başarıyla kurdular. Küçük hayvanlarla karşılaştırıldığında, domuz gibi büyük hayvanlar anatomik yapılara ve insanlara benzer fizyolojik özelliklere sahiptir ve daha uzun ömürlüdür ^8,9. Bu nedenle, büyük hayvanlar venöz greft hastalığındaki uzun vadeli patolojik değişiklikleri araştırmak ve ilaçların veya cihazların klinik öncesi testleri için daha uygundur. Biz ve işbirliği yaptığımız ekibimiz, domuz kalp yetmezliği modeli oluşturmak için cerrahi teknikleri başarıyla uyguladık ve bu model^10'daki kardiyak patolojik değişiklikleri tanımladık.

CABG cerrahisi klinik uygulamada standartlaştırılmıştır, ancak VGD hayvan modellerinin kurulmasına uygulandığında, türler arasındaki farklar, hayvan ekipman ve tesislerinin edinilmesi, hayvan cerrahi operasyonları ve hayvan besleme ve hemşireliği araştırmacılar için büyük zorluklardır. Klinik uygulamada olduğu gibi, VGD hayvan modellerini oluşturmak için kullanılan CABG cerrahisi yaklaşımları arasında orta hat sternotomi¹¹ ve sol lateral torakotomi^{12 bulunmaktadır}. Orta hat sternotomi daha sık kullanılır^13,14. Bununla birlikte, bu yaklaşımın hem insanlar hem de hayvanlar için yüksek riskleri vardır. Thankam ve ark. tarafından bildirilen çalışmada, modelleme için kullanılan altı domuzdan ikisi ameliyat sırasında öldü¹⁵. Yüksek model mortalitesi çalışma maliyetlerini arttırır ve sonuçların doğruluğunu etkiler. Bir çalışma daha önce sol göğüs duvarı insizyonunun domuzlarda CABG'ye bağlı VGD'yi oluşturmak için mümkün olduğunu göstermiştir¹¹. Burada, bu çalışma, minidomuzlarda KABG kaynaklı bir VGD modeli için tekrarlanabilir bir cerrahi oluşturmak için adım adım bir protokolü tanımlamayı ve bu modelin fenotipini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Deneysel protokol, kalp cerrahisi ve anestezi ekipleri tarafından ortaklaşa tasarlanmıştır. Sol üçüncü interkostal boşluk için cerrahi yaklaşım, ameliyat öncesi laboratuvarda bulunan diğer minipiglerin kadavralarına göre belirlendi ve anestezi yöntemi merkez^16'da kullanılan yönteme göre uygulandı. Hayvan modellerini değerlendirmek için kan biyokimyasal testleri, ultrasonik muayene ve histoloji incelemesi yapıldı.

Protokol

Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı ile ilgili prosedürler, Guangdong Laboratuvar Hayvanları İzleme Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (8. Baskı, 2011, Ulusal Araştırma Konseyi, ABD) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Cerrahi prosedür Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Hayvanların ameliyat öncesi hazırlanması

1. 30-35 kg ağırlığındaki 10 adet 3 aylık erkek minidomuzu rastgele sahte gruba (n = 5) ve VGD grubuna (n = 5) bölün.
2. Vücut kitle indeksini (VKİ) kullanarak domuzların ameliyat öncesi ve sonrası sağlık koşullarını değerlendirir. VKİ'yi aşağıdaki gibi hesaplayın:
   BMI = vücut ağırlığı (kg)/(vücut uzunluğu [cm] × vücut uzunluğu [cm])
   NOT: Vücut uzunluğu, domuzun burnundan kuyruğun tabanına kadar ölçülür.
3. Anestezi sonrası aspirasyonu önlemek için ameliyattan önce hayvanları 12 saat boyunca hızlandırın. Bir anestezi makinesi, gaz, anestezik ilaçlar, anestezi boru hattı, özel bir laringoskop ve cerrahi aletler, bir kaburga tutucu, dikişler, tiroid retraktörü, cerrahi forseps vb. dahil olmak üzere anestezi cihazları ve cerrahi aletler hazırlayın. Ameliyatta kullanılacak tüm aletleri sterilize edin.

2. Hayvanların ameliyata hazırlanması

1. Hayvanları tartın ve anestezik dozu hesaplayın. 2 mg / kg 1: 1 Tiletamin ve Zolazepam, 0.2 mg / kg diazepam ve 0.02 mg / kg atropin^17'den oluşan anestezik karışımı kas içinden uygulayın. İntraoperatif ağrı kesici 30 için fentanil (⁵⁰ mg / kg) kullanın.
2. Uygun bir anestezik düzlemin elde edildiğinden emin olun ve kulak erişimini sağlamak için marjinal kulak damarına yerleşik bir venöz kateter (20G) yerleştirin. Domuzu ameliyat masasına aktarın ve sırtüstü pozisyona getirin. Uzuvları bandajlarla hareketsiz hale getirin ve kafayı steril bir örtü ile yükseltin.
   NOT: Anestezi durumu, göz küresinin santral fiksasyonu, miyoz, pupilla refleksi kaybı ve ağrı refleksi kaybı ile izlendi.  Kalp atış hızı ve kan basıncı taban çizgisinden daha düşük bir seviyede tutuldu. Cerrah, felç altındaki HR, BP ve diğer parametreleri izlemeli ve HR başlangıçtan% 20 > artarsa anestezik dozu arttırmalıdır.
3. Epiglottis ve glottis'i veteriner laringoskop kullanarak ortaya çıkarın. 7.0-7.5Fr tüp ile trakea entübasyonu yapın ve anestezi solunum devresine bağlayın.
   NOT: Vantilatör, gelgit hacmi 280 mL, inspiratuar/ekspiratuar oranı 1:2, solunum hızı 20 kez/dak ve pozitif ekspiratuar basınç (5 cm H₂O) ile sürekli pozitif basınçlı ventilasyon için kullanılır.
4. Cerrahi işlemler sırasında kasları gevşetmek için intravenöz olarak vekuronyum bromür (0.1 mg / kg) enjekte edin ve anesteziyi 16-20 bpm solunum hızında ve 10 mL / kg'lık bir gelgit hacminde tutmak için% 2 izofluran kullanın.
   NOT: Vekuronyum, felçli hayvanlarda yeterli anestezi derinliğini sağlamak için verilir, çünkü özellikle indüksiyon ilacı ve izofluran dozu önerilenin alt ucundadır.
5. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için domuzun gözlerinde veteriner merhem kullanın. Domuzun vücut ısısını 38 ° C ± 5 ° C'de tutmak için elektrikli battaniyeler kullanın.
6. Kalp atış hızını, kan oksijen seviyelerini ve vücut ısısını izlemek için bir elektrokardiyogram kullanın.

3. Cerrahi işlemler

1. Sol göğüs duvarını tıraş edin ve cerrahi bölgeyi sol mandibuler açıya, göbek kordonuna, arka aksiller hatta sola ve aksiller öne doğru aseptik olarak hazırlamak için% 0.7 iyot ve% 75 alkolden oluşan üç alternatif tur uygulayın. Ameliyat alanının etrafına steril bir cerrahi örtü yerleştirin.
2. Üçüncü sol interkostal boşluğa elektrikli bıçakla 7-10 cm'lik enine bir kesi yapın ve deri altı dokuları katman katman ayırın (Şekil 2A). Üçüncü kaburganın 5-6 cm'lik bir segmentini kemik makasla çıkarın ve üçüncü kaburga-sternal eklemi açığa çıkardıktan sonra iç meme damarını bir retraktör ile açığa çıkarın (Şekil 2B).
3. İç meme damarını, sternumun sol tarafındaki sol iç meme arteri ile birlikte bulun. Vasküler forseps ile iç meme damarının künt bir diseksiyonunu gerçekleştirin.
4. Sol iç meme damarının dallarının elektrikli bıçakla elektrokoagülasyonu ile hemostaz yapın. Hemostaz eksikse, hemostaz için pamuk ipliği ligasyonu kullanın. Hasat sırasında damarın iki ucunu bağlayın ve işaretleyin (Şekil 2C).
5. 2 mL heparin sodyum çözeltisi ve 98 mL normal salin ekleyerek heparin normal salin hazırlayın. Damarı çıkardıktan sonra, ön işlem için damar içine heparin normal salin enjekte edin (Şekil 2D). Ardından, damarı normal salin içine koyun ve yedekleme için saklayın.
6. Yukarıda tarif edildiği gibi benzer bir kesi yapın ve sahte gruptaki iç meme damarını çıkarın. Perikard'ı açın, ardından sahte gruptaki göğüs duvarını kapatın. Koroner arter baypas grefti olmadan patolojik kontrol için sahte grubun iç meme damarını kullanın.
7. Sağ koroner arter gövdesini ortaya çıkarmak için perikard üzerinde elektrikli bıçakla ~ 7 cm'lik bir kesi yapın. Perikardın askıya alınması ve ipsilateral taraftaki cilde 1-0 cerrahi dikişlerle dikilmesi (Şekil 2E). Sağ koroner arter gövdesini çevre dokulardan ayırın (Şekil 2E).
8. Aortun yakınındaki izole sağ koroner arterin proksimal ucunun altındaki blokaj bandını bir tel kanca ile atlayın ve bloke bandını sıkılaştırarak ve gevşeterek miyokardın üç döngü 2 dakikalık iskemi ve 5 dakikalık reperfüzyonla tedavi edilmesi (Şekil 2F). İskemi/reperfüzyon ön koşullandırması sırasında elektrokardiyogram monitörü ile kalbin elektriksel aktivitesini izleyin (Şekil 2G).
   NOT: Sağ koroner arter tıkandığında, elektrokardiyogram artmış kalp atış hızı ve ST segmenti yükselmesi gösterir.
9. Doğru koroner kan akışını engellemek için bandı sıkın. Kan damarlarını kaplayan epikardı kesin. Koroner arter duvarını açığa çıkarın ve cerrahi bir bıçağın ucu ile kan damarlarının ön duvarının merkezine karşı uzunlamasına kesin.
10. Lümeni kestikten sonra, kesiyi makasla büyütün ve koroner bir şant yerleştirin. Şantın bir ucunu bir bobin ile yırtıktan distal koroner artere sokun. Koroner arterlerdeki kanı içi boş koroner şanta sokarak açık bir ameliyat alanı sağlayın (Şekil 2H).
11. 7-0 polipropilen sütür ile iç meme damarı ile sağ koroner gövde arasında uçtan uca sürekli bir dikiş yapın (Şekil 2I). Yükselen aortun ortasında, yükselen aortun sol anterolateral duvarını yarı oklüzyon kelepçesi ile tıkayın.
12. Adventitinin kesildiği aort duvarında küçük bir kesi yapmak için cerrahi bir bıçak kullanın, zımbanın baş ucundaki sürgülü şaftın baş ucunu bu kesiden aort boşluğuna yerleştirin, sürgülü şaftı dışa doğru daraltın ve üstündeki dairesel bıçak arteriyel duvarın bir parçasını keser. Zımba ile kesilen doku bloğu yaklaşık 3 mm çapındadır (Şekil 2J).
13. Şantı çıkarın. 6-0 polipropilen sütür ile iç meme damarı ile aort duvarı arasında uçtan uca sürekli bir dikiş yapın (Şekil 2K). Yarı oklüzyon kelepçesini açın.
14. Ultrason kullanarak sağ koroner arter gövdesinin anastomoz bölgesine proksimal bypass akışını kaydedin. Elektrokardiyogramı kullanarak kalbin elektriksel aktivitesini izleyin (Şekil 2L).
15. Kan ve sıvıların boşalmasına izin vermek için göğüs boşluğuna geçici bir drenaj tüpü (Fr: 16) yerleştirin. Perikard insizyonunu 1-0 pamuklu bir iplik kullanarak dikin ve her bir tabakaya penisilin (yaklaşık 0.5 g) tozu yerleştirirken göğüs tabakasını katman katman kapatın (içeriden dışarıya: Plevra tabakası, kas tabakası, deri altı doku tabakası, cilt tabakası). Cilt insizyonunu 1-0 pamuklu bir iplik kullanarak diktikten sonra drenaj tüpünü çıkarın.

4. Ameliyat sonrası bakım

1. Hayvanlar kendiliğinden nefes almaya döndükten sonra endotrakeal tüpü çıkarın. Anestezi uzmanı, hayvanın yaşamsal değerlerini (örneğin, solunum hızı, kalp atış hızı, oksijen doygunluğu, vb.) değerlendirmeli ve hayvanlar uyandıktan ve kendiliğinden aktiviteye döndükten sonra EKG'yi çıkarmalıdır. Hayvanları beslenme odasına geri gönderin ve sahte hayvanları üreme odasındaki başka bir kaleme yerleştirin. Hayvanları elektrikli bir battaniyeyle sıcak tutun. Ameliyattan sonra her saat başı hayvanları gözlemleyin (en az 4 kez).
2. Ameliyattan sonraki gün hayvanı besleyin. Postoperatif trombozu önlemek ve yara ağrısını azaltmak için hayvan yemine 7 gün boyunca günde 2 kat aspirin (200 mg) ekleyin.
   NOT: Aspirasyonu önlemek için ameliyat günü hayvanları beslemekten kaçının.
3. Postoperatif enfeksiyonu önlemek için hayvana günde 1x penisilin intramüsküler enjeksiyonu uygulayın (kg başına 14.000 ünite).

5. Ultrasonik muayene

1. CABG ameliyatından sonra, yüksek frekanslı lineer dizi probunu sarmak için steril bir ultrasonik prob manşonu kullanın. Probu venöz greftin yüzeyine yerleştirin.
2. Greftin ana hatlarını iki boyutlu ultrason modunda görüntüleyin, ardından greftteki kan akışını tespit etmek için renkli Doppler moduna geçin.

6. Venöz greft doku toplama

1. Biyokimyasal test için kulak damarının venöz devresinden 10 mL kan örneği toplayın. (Tablo 1). Kan örneğini 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın ve otomatik bir biyokimyasal analizör ile biyokimyasal testler yapın.
2. Hayvanı daha önce tarif edildiği gibi anestezi yapın. Anestezi derinliğinin doğrulanması üzerine, kulak marjinal veninden veya ön ayak damarından% 10 potasyum klorür 0.5mL / kg vücut ağırlığı enjekte edin. Daha sonra, ameliyattan 30 gün sonra damar greftini toplamak için elektrikli bıçakla 10 cm'lik bir medyan sternal kesi yapın. Vücut pozisyonunu adım 2.2'deki gibi sabitleyin ve sterilizasyon ve bir örtünün yerleştirilmesinden sonra, sternumu bölmek için medyan sternum insizyonu yapın. Ayırma sırasında, ana kan damarlarından ve kalpten kaçının ve aşılanmış kan damarlarını katman katman ayırın.
3. Kalbe bağlanan büyük kan damarlarını hızla kesin, kalbi ve yükselen aortu buz yongaları üzerine yerleştirin ve greft vasküler köprüsünü, bağlı aortu ve sağ koroner arteri çıkarın. Tüm numuneleri 4 °C'de normal salinle durulayın.
4. Yaklaşık 3-4 cm büyüklüğündeki tüm greft damarını alın, 4-5 eşit parçaya bölün ve kriyoprezervasyon tüplerine aktarın. Donmak için tüpleri hızlı bir şekilde sıvı azot içine koyun ve depolama için -80 °C ultra düşük sıcaklıktaki dondurucuya geçin.
5. Analiz için, grefti buz soğuk% 0.9 salin ile durulayın ve% 4 paraformaldehit çözeltisine sabitleyin. Doku bloğu boyutunun 1:10'luk fiksatif çözeltiye oranını koruyun ve dokuyu 12 saatten fazla sabitleyin.
6. Bölümleri 3 dakika boyunca 50 mL sulu hematoksilin çözeltisinde sabitleyin. Her biri 10 s için 50 mL% 0.5 hidroklorik asit etanol ve 50 mL% 0.2 amonyak suyu ile yıkayarak bölümleri ayırın.
7. Akan su ile 1 saat durulayın ve ardından 3 dakika bekleterek damıtılmış suda temizleyin. Her biri 10 dakika boyunca% 70 ve% 90 etanol içinde kurutun. 2-3 dakika boyunca 50 mL% 0.5 alkol eozin boyama çözeltisine yerleştirin.
8. Lekeli bölümleri 10 dakika boyunca saf etanol ile kurutun ve ardından numuneleri şeffaf hale getirmek için 10 dakika boyunca saf ksilenin içine batırın. Şeffaf bölümleri nötr yapıştırıcı ile damlatın ve bir kapak kayması ile örtün. Patolojik bölümleri 40x büyütmede bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.

Sonuçlar

VKİ ve serum biyokimyasal indeksleri
Sahte ve VGD grupları arasındaki VKİ anlamlı olarak farklı değildi (sahte vs VGD, 22.05 kg/cm2 ± 0.46 kg/cm2 ve 21.14 kg/cm2 ± 0.39 kg/^cm2, p = 0.46). Serum biyokimyasal sonuçları Tablo 1'de listelenmiştir. Aspartat aminotransferaz (AST, sahte vs VGD, 25.25 IU / L ± 1.88 IU / L vs 31.5 IU / L ± 2.58 IU / L), serum bilirubin (sahte vs VGD, 2.5 μmol / L ± 0.47 μmol / L vs 4.5 μmol...

Tartışmalar

Bu çalışmada, KABG kaynaklı VGD modeli geliştirilirken hayvan seçimi, alet hazırlama, cerrahi prosedürler ve postoperatif değerlendirme protokolü ayrıntılı olarak açıklanmıştır. KABG cerrahisi öncesi ve sonrası venöz greftin ultrasonik muayenesini ve ameliyattan 30 gün sonra greftin histolojik incelemesini yaptık. CABG ameliyatından önce iç meme damarındaki kan akımı normalken, iç meme damarının greftinde retrograd akım gözlendi. Sahte operasyon grubu ile karşılaştırıldığında, op...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aortic Punch	Medtronic Inc. , America	3.0mm, 3.5mm, 4.0mm	Used for proximal coronary bridge anastomosis
Automatic biochemical analyzer	IDEXX Laboratories, Inc. America	Catalyst One
Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit	LANDANGER, France
Cardiogram monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd	MEC-1000
Coronary Shunt	AXIUS	OF-1500, OF-2500, OF-3000	The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis.  The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis.
Defibrillator	MEDIANA	Mediana D500
Diazepam	Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China	H37023039	Narcotic inducer
Disposable manual electric knife	Covidien, America	E2516H
Electric negative pressure suction machine	Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd	YX932D
Esmolol	Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD	H20055990	Emergency drugs
Ice machine	Local suppliers, Guangzhou, China
Lidocaine	Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD	H51021662	Emergency drugs
Luxtec headlight system	Luxtec, America	AX-1375-BIF	Used for lighting fine parts during operation
Medical operation magnifier (glasses)	Germany Lista co, LTD	SuperVu Galilean 3.5×	Used for fine site operation during operation
Multi-function high-frequency electrotome	Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd	GD350-B
Nitrogen canister	Local suppliers, Guangzhou, China
Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture)	Johnson & Johnson, America	6-0, 7-0	Used to suture blood vessels.
Nonabsorbable suture (cotton thread)	Covidien, America	1-0	Used for skin and muscle tissue tugging
Open heart surgery instrument kit	Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD
Propofol injection	Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD	H19990282	Anesthetic sedative
Refrigerator	Local suppliers, Guangzhou, China
Respiratory anesthesia machine for animal	Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China	R620-S1
Semi-occlusion clamp	Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd.	ZL1701RB	Temporarily cut off the aortic flow
vecuronium bromide	Richter, Hungary	JX20090127	Muscle relaxant
Veterinary ultrasound system	Royal Philips, Netherlands	CX50
Zoletil	Virbac, France	Zoletil 50	Animal narcotic