نود أن نشكر منحة تمويل المعهد الوطني للصحة (NIH) للمعهد الوطني للعيون (R01 EY030054) للدكتور محمد الشبراوي. نود أن نشكر كاثي ولوسيفيتش لمساعدتنا في سرد الفيديو. نود أن نشكر الدكتور كين ميتون من مختبر أبحاث شبكية الأطفال التابع لمعهد أبحاث العيون ، جامعة أوكلاند ، على مساعدته أثناء استخدام المجهر الجراحي والتسجيل. تم تحرير هذا الفيديو وإخراجه من قبل الدكتور خالد المصري.

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في جامعة أوكلاند ، روتشستر ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية واتبعت الإرشادات التي وضعتها جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.
<p class="jove_titl...

يدرس مختبرنا التغيرات الفيزيولوجية المرضية التي تعزز ضعف الأوعية الدموية الدقيقة في شبكية العين لسنوات31،32،33،34،35،36. تعد زراعة الشبكية إحدى التقنيات التي يمكن أن تكون ذات قيمة كبي...

تم تقديم نماذج مختلفة لدراسة أمراض الشبكية ، بما في ذلك النماذج في الجسم الحي وفي المختبر. لا يزال استخدام الحيوانات في البحث مسألة نقاش أخلاقي ومتعدي مستمر1. تستخدم النماذج الحيوانية التي تنطوي على القوارض مثل الفئران أو الجرذان بشكل شائع في أبحاث شبكية العين2،3،4. ومع ذلك ، فقد نشأت مخاوف سريرية بسبب الوظائف الفسيولوجية المختلفة لشبكية العين في القوارض مقارنة بالبشر ، مثل غياب البقعة أو الاختلافات في رؤية الألوان5. كما أن استخدام عيون ما بعد الوفاة البشرية لأبحاث الشبكية له العديد من المشاكل ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الاختلافات في الخلفيات الجينية للعينات الأصلية ، والتاريخ الطبي للمتبرعين ، والبيئات أو أنماط الحياة السابقة للمتبرعين6. علاوة على ذلك ، فإن استخدام النماذج في المختبر في أبحاث الشبكية له بعض العيوب أيضا. تشمل نماذج زراعة الخلايا المستخدمة لدراسة أمراض الشبكية استخدام خطوط الخلايا ذات الأصل البشري أو الخلايا الأولية أو الخلايا الجذعية7. لقد ثبت أن نماذج زراعة الخلايا المستخدمة تعاني من مشاكل من حيث كونها ملوثة أو غير محددة بشكل خاطئ أو غير متمايزة8،9،10،11. في الآونة الأخيرة ، أظهرت تقنية الشبكية العضوية تقدما كبيرا. ومع ذلك ، فإن بناء شبكية العين المعقدة للغاية في المختبر له العديد من القيود. على سبيل المثال ، لا تتمتع عضويات الشبكية بنفس الخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية الناضجة في شبكية العين الحية. للتغلب على هذا القيد ، يجب أن تدمج تقنية الشبكية العضوية المزيد من الميزات البيولوجية والخلوية ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية والخلايا المناعية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة12،13،14،15.
ظهرت نباتات الشبكية العضوية كأداة موثوقة لدراسة أمراض الشبكية مثل اعتلال الشبكية السكري وأمراض الشبكية التنكسية16،17،18،19. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى الموجودة ، فإن استخدام نباتات الشبكية يدعم كلا من مزارع خلايا الشبكية في المختبر وكذلك النماذج الحيوانية الحالية في الجسم الحي عن طريق إضافة ميزة فريدة لدراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة تحت نفس المعلمات البيوكيميائية ومستقلة عن المتغيرات الجهازية. تسمح مزارع explant بالاحتفاظ بخلايا شبكية مختلفة معا في نفس البيئة ، مما يسمح بالحفاظ على تفاعلات شبكية العين بين الخلايا20،21،22. علاوة على ذلك ، أظهرت دراسة سابقة أن نباتات الشبكية كانت قادرة على الحفاظ على البنية المورفولوجية ووظائف خلايا الشبكية المستزرعة23. وبالتالي ، يمكن أن توفر نباتات الشبكية منصة لائقة للتحقيق في الأهداف العلاجية المحتملة لمجموعة واسعة من أمراض الشبكية24،25،26. توفر مزارع زراعة الشبكية تقنية يمكن التحكم فيها وهي بديل مرن للغاية لل mothods الموجودة التي تسمح بالعديد من التلاعب الدوائي ويمكن أن تكشف عن العديد من الآليات الجزيئية27.
الهدف العام من هذه الورقة هو تقديم تقنية زراعة الشبكية كنظام نموذج وسيط معقول بين مزارع الخلايا في المختبر والنماذج الحيوانية في الجسم الحي . يمكن لهذه التقنية محاكاة وظائف الشبكية بطريقة أفضل من الخلايا المنفصلة. نظرا لأن طبقات الشبكية المختلفة تظل سليمة ، يمكن تقييم التفاعلات بين الخلايا في الشبكية في المختبر في ظل ظروف كيميائية حيوية يتم التحكم فيها جيدا ومستقلة عن عمل نظام الأوعية الدموية28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adult C57Bl/6J mice&#160;</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope&#160;</td>
			<td>KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.</td>
			<td>BZ-X800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplements</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>Gibco #17504-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blockade blocking solution&#160;</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>B10710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>Gibco #11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG.</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>F-2765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSL I, BSL I (Isolectin)</td>
			<td>Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA</td>
			<td>B-1105-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>Gibco #14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades</td>
			<td>World Precision Instruments,FL 34240, USA&#160;</td>
			<td>Straight (503365)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplements</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>Gibco #17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>140652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>BBP, Ashland, MA, 01721 USA</td>
			<td>C25N107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-NeuN Antibody</td>
			<td>Abcam.,Cambridge, UK</td>
			<td>ab177487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody</td>
			<td>Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red</td>
			<td>Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA</td>
			<td>SA-5006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>BioRad Hercules, CA,&#160; 94547,USA</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal explant of the adult mouse retina as an ex vivo model for studying retinal neurovascular diseases

أحد التحديات في أبحاث شبكية العين هو دراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة مثل الخلايا العصبية في شبكية العين والخلايا الدبقية والخلايا الوعائية. إن عزل الخلايا العصبية الشبكية وزراعتها والحفاظ عليها في المختبر لها قيود تقنية وبيولوجية. قد تتغلب زراعة نباتات الشبكية على هذه القيود وتقدم نموذجا فريدا خارج الجسم الحي لدراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة مع معلمات كيميائية حيوية يتم التحكم فيها جيدا ومستقلة عن نظام الأوعية الدموية. علاوة على ذلك ، تعد زراعة الشبكية أداة فحص فعالة لدراسة التدخلات الدوائية الجديدة في مختلف أمراض الأوعية الدموية والأمراض التنكسية العصبية في شبكية العين مثل اعتلال الشبكية السكري. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لعزل وزراعة نباتات الشبكية لفترة طويلة. تعرض المخطوطة أيضا بعض المشكلات الفنية أثناء هذا الإجراء والتي قد تؤثر على النتائج المرجوة وقابلية استنساخ مزرعة زراعة الشبكية. أظهر التلوين المناعي للأوعية الشبكية والخلايا الدبقية والخلايا العصبية الشعيرات الدموية الشبكية السليمة والخلايا العصبية بعد 2 أسابيع من بداية ثقافة زراعة الشبكية. هذا يؤسس لزرع الشبكية كأداة موثوقة لدراسة التغيرات في الأوعية الدموية في شبكية العين والخلايا العصبية في ظل ظروف تحاكي أمراض الشبكية مثل اعتلال الشبكية السكري.

بقاء الخلايا العصبية والأوعية الدموية في الشبكية في الشبكية في المزرعة خارج الجسم الحي لفترة طويلة من خلال زراعة نبات شبكية العين باستخدام بروتوكولنا ، نجحنا في الحفاظ على خلايا شبكية مختلفة كانت قابلة للحياة لمدة تصل إلى 2 أسابيع. للتحقق من وجود خلايا ش?...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases at JoVE.com

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

يقدم هذا البروتوكول ويصف خطوات عزل وتشريح وزراعة وتلطيخ نباتات الشبكية التي تم الحصول عليها من فأر بالغ. هذه الطريقة مفيدة كنموذج خارج الجسم الحي لدراسة أمراض الأوعية الدموية العصبية المختلفة في شبكية العين مثل اعتلال الشبكية السكري.

زرع شبكية العين للفأر البالغ شبكية العين كنموذج خارج الجسم الحي لدراسة أمراض الأوعية الدموية العصبية في الشبكية

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

أحد التحديات في أبحاث الشبكية هو دراسة الحديث المتبادل بين الخلايا المختلفة ، مثل الخلايا العصبية في شبكية العين والخلايا الدبقية والخلايا الوعائية. على وجه الخصوص ، يعد عزل وزراعة الخلايا العصبية في شبكية العين أمرا صعبا. نعتقد أن نبات الشبكية المستزرع يمكنه التغلب على هذا القيد وتقديم نظام فريد خارج الجسم الحي يسمح لنا بدراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة ، تحت معايير كيميائية حيوية يتم التحكم فيها جيدا ، ومستقلة عن نظام الأوعية الدموية.أيضا ، يعد استئصال شبكية العين أداة فحص بارزة لدراسة التدخلات الدوائية الجديدة في مختلف أمراض الشبكية الوعائية والتنكسية العصبية ، مثل اعتلال الشبكية السكري ، والذي يتميز بإصابة الأوعية الدموية والعصبية. يدرس مختبرنا التغيرات الفيزيولوجية المرضية ، مما يعزز ضعف الشبكية الوعائية الدقيقة لسنوات. مكننا استخدام مجموعة متنوعة من النماذج بما في ذلك النماذج في الجسم الحي والمختبر من تحسين الكثير من التقنيات داخل مختبرنا.هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لنباتات شبكية العين المشتقة من فأر بالغ من النوع البري يمكن الاحتفاظ به في المزرعة لمدة أسبوعين. الحفاظ على الحيوانات في إيواء تحت درجة حرارة ثابتة وبيئة يتم التحكم فيها بالضوء. افحص كل بحثا عن الصحة والغذاء الكافي والماء.تأكد من تزويد الحيوانات بالطعام الطازج والمياه النظيفة. تغيير الأقفاص المتسخة على أساس يومي أو حسب الحاجة لصحة الحيوانات. استخدم ذكور 6 فئران سوداء يزيد عمرها عن 12 أسبوعا.القتل الرحيم للحيوانات في قفص منزلهم عن طريق استنشاق جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون. بعد الانتهاء من الإجراء ، تأكد من موت الحيوان بالطريقة المناسبة ، مثل تأكيد السكتة القلبية والتنفسية أو مراقبة التلاميذ الثابتة والمتوسعة للحيوان. اتبع تأكيد الوفاة بطريقة ثانوية للقتل الرحيم مثل خلع عنق الرحم.اضغط على المدار باستخدام ملقط منحني حتى تبرز الكرة الأرضية. أغلق الملقط برفق في الجزء الخلفي من العين وارفعه بحركة مستمرة. اغمر مقلة العين في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على HBSS بارد ثلجي واحد ملليلتر.انقل مقلة العين إلى أنبوب سعة 1.5 أو ملليلتر يحتوي على وسائط كاملة. الآن هو جاهز للتشريح. يوضح هذا الرسم البياني الخطوات المتتالية التي سيتم عرضها لتشريح مقلة عين الفأر لإنشاء زرع الشبكية.يتم إجراء شق محيطي على طول الحافة لفتح مقلة العين. تتم إزالة القرنية عن طريق التشريح على طول شق القزحية. ثم تتم إزالة العدسة والجسم الزجاجي ، تاركة كوبا فارغا للعين.عن طريق إمساك منطقة رأس العصب البصري بالملقط الدقيق ، يتم تقشير الطبقة الخارجية للعين بلطف. اهتمام كبير أثناء إزالة الغلاف الخارجي حتى لا تجرح الشبكية العصبية وتكون شبكية العين سليمة تماما. بعد ذلك ، سيتم قطع شبكية العين إلى قطع أصغر.ستكون هذه ميزة كبيرة ، لأنها ستسمح لك بإجراء تجربة حيث يتم اشتقاق مجموعة التحكم والمجموعات التجريبية من نفس الحيوان. ومع ذلك ، فإن قطع شبكية العين إلى قطع صغيرة سيجعل التعامل معها أكثر صعوبة. لذلك ، قمنا بتطوير تقنية للتعامل مع قطع الشبكية الصغيرة هذه لضمان التوجيه الصحيح لثقافة شبكية العين.اذهب مع شفرة مقص التشريح مفتوحة أسفل قطعة الشبكية مباشرة. ارفع قطعة الشبكية ببطء بطرف شفرة مقص مفتوحة وانقلها برفق إلى لوحة الثقافة. سيتم نقل النباتات الخارجية بشكل منفصل إلى إدخالات زراعة الخلايا في ألواح متعددة الآبار ، يحتوي كل منها على 300 ميكرولتر من وسائط زرع الشبكية مع توجيه جانب الشبكية العصبي لأعلى.سيتم الحفاظ على مزارع زراعة الشبكية في حاضنات مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تأكد من أن سطح الشبكية متجها لأعلى. إذا كانت قطعة الشبكية مقلوبة أو مطوية ، فحاول ضبطها برفق على الاتجاه الصحيح.سيؤدي الفشل في وضع زرع الشبكية في الاتجاه الصحيح مع مواجهة الشبكية العصبية لأعلى إلى فشل النمو السليم لخلايا الشبكية في الثقافة. هنا ، يمكننا أن نرى التألق المناعي يلطخ نباتات الشبكية الملطخة بالثقافة لمدة أسبوعين. تم إصلاح النباتات الخارجية وتلطيخها ب NeuN للخلايا العصبية في شبكية العين ، و GFAP للخلايا الدبقية ، والليكتين للأوعية الدموية.أظهر التلوين خلايا شبكية متطورة وأوعية شبكية. هنا ، يمكننا أن نرى تلطيخ التألق المناعي لنباتات الشبكية الثابتة والملطخة ب GFAP للخلايا الدبقية والليكتين للأوعية الدموية. تظهر الصور تلطيخا معيبا وتخلفا في كل من خلايا الشبكية والأوعية الشبكية.وذلك لأن نبات الشبكية كان مطويا ولم يتم توجيهه بشكل صحيح على لوحة الثقافة. يجب إيلاء اهتمام كبير للتوجيه الصحيح للمصنع مع توجيه شبكية العين لأعلى. إن اشتقاق المجموعة الضابطة من نفس الحيوان مثل المجموعة المعالجة يجعل من المفيد جدا إجراء مقارنة أكثر موثوقية للظروف التجريبية المختلفة.يمكن أن توفر غرسات الشبكية منصة لائقة للتحقيق في الأهداف العلاجية المحتملة لمجموعة واسعة من أمراض الشبكية ، مثل اعتلال الشبكية السكري وأمراض الشبكية التنكسية.

زرع شبكية العين للفأر البالغ شبكية العين كنموذج خارج الجسم الحي لدراسة أمراض الأوعية الدموية العصبية في الشبكية

Abstract