زرع شبكية العين للفأر البالغ شبكية العين كنموذج خارج الجسم الحي لدراسة أمراض الأوعية الدموية العصبية في الشبكية

Summary

يقدم هذا البروتوكول ويصف خطوات عزل وتشريح وزراعة وتلطيخ نباتات الشبكية التي تم الحصول عليها من فأر بالغ. هذه الطريقة مفيدة كنموذج خارج الجسم الحي لدراسة أمراض الأوعية الدموية العصبية المختلفة في شبكية العين مثل اعتلال الشبكية السكري.

Abstract

أحد التحديات في أبحاث شبكية العين هو دراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة مثل الخلايا العصبية في شبكية العين والخلايا الدبقية والخلايا الوعائية. إن عزل الخلايا العصبية الشبكية وزراعتها والحفاظ عليها في المختبر لها قيود تقنية وبيولوجية. قد تتغلب زراعة نباتات الشبكية على هذه القيود وتقدم نموذجا فريدا خارج الجسم الحي لدراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة مع معلمات كيميائية حيوية يتم التحكم فيها جيدا ومستقلة عن نظام الأوعية الدموية. علاوة على ذلك ، تعد زراعة الشبكية أداة فحص فعالة لدراسة التدخلات الدوائية الجديدة في مختلف أمراض الأوعية الدموية والأمراض التنكسية العصبية في شبكية العين مثل اعتلال الشبكية السكري. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لعزل وزراعة نباتات الشبكية لفترة طويلة. تعرض المخطوطة أيضا بعض المشكلات الفنية أثناء هذا الإجراء والتي قد تؤثر على النتائج المرجوة وقابلية استنساخ مزرعة زراعة الشبكية. أظهر التلوين المناعي للأوعية الشبكية والخلايا الدبقية والخلايا العصبية الشعيرات الدموية الشبكية السليمة والخلايا العصبية بعد 2 أسابيع من بداية ثقافة زراعة الشبكية. هذا يؤسس لزرع الشبكية كأداة موثوقة لدراسة التغيرات في الأوعية الدموية في شبكية العين والخلايا العصبية في ظل ظروف تحاكي أمراض الشبكية مثل اعتلال الشبكية السكري.

Introduction

تم تقديم نماذج مختلفة لدراسة أمراض الشبكية ، بما في ذلك النماذج في الجسم الحي وفي المختبر. لا يزال استخدام الحيوانات في البحث مسألة نقاش أخلاقي ومتعدي مستمر¹. تستخدم النماذج الحيوانية التي تنطوي على القوارض مثل الفئران أو الجرذان بشكل شائع في أبحاث شبكية العين²،^3،4. ومع ذلك ، فقد نشأت مخاوف سريرية بسبب الوظائف الفسيولوجية المختلفة لشبكية العين في القوارض مقارنة بالبشر ، مثل غياب البقعة أو الاختلافات في رؤية الألوان⁵. كما أن استخدام عيون ما بعد الوفاة البشرية لأبحاث الشبكية له العديد من المشاكل ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الاختلافات في الخلفيات الجينية للعينات الأصلية ، والتاريخ الطبي للمتبرعين ، والبيئات أو أنماط الحياة السابقة للمتبرعين⁶. علاوة على ذلك ، فإن استخدام النماذج في المختبر في أبحاث الشبكية له بعض العيوب أيضا. تشمل نماذج زراعة الخلايا المستخدمة لدراسة أمراض الشبكية استخدام خطوط الخلايا ذات الأصل البشري أو الخلايا الأولية أو الخلايا الجذعية⁷. لقد ثبت أن نماذج زراعة الخلايا المستخدمة تعاني من مشاكل من حيث كونها ملوثة أو غير محددة بشكل خاطئ أو غير متمايزة⁸،⁹،^10،11. في الآونة الأخيرة ، أظهرت تقنية الشبكية العضوية تقدما كبيرا. ومع ذلك ، فإن بناء شبكية العين المعقدة للغاية في المختبر له العديد من القيود. على سبيل المثال ، لا تتمتع عضويات الشبكية بنفس الخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية الناضجة في شبكية العين الحية. للتغلب على هذا القيد ، يجب أن تدمج تقنية الشبكية العضوية المزيد من الميزات البيولوجية والخلوية ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية والخلايا المناعية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة¹²،^13،14،15.

ظهرت نباتات الشبكية العضوية كأداة موثوقة لدراسة أمراض الشبكية مثل اعتلال الشبكية السكري وأمراض الشبكية التنكسية¹⁶،¹⁷،^18،19. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى الموجودة ، فإن استخدام نباتات الشبكية يدعم كلا من مزارع خلايا الشبكية في المختبر وكذلك النماذج الحيوانية الحالية في الجسم الحي عن طريق إضافة ميزة فريدة لدراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة تحت نفس المعلمات البيوكيميائية ومستقلة عن المتغيرات الجهازية. تسمح مزارع explant بالاحتفاظ بخلايا شبكية مختلفة معا في نفس البيئة ، مما يسمح بالحفاظ على تفاعلات شبكية العين بين الخلايا²⁰،^21،22. علاوة على ذلك ، أظهرت دراسة سابقة أن نباتات الشبكية كانت قادرة على الحفاظ على البنية المورفولوجية ووظائف خلايا الشبكية المستزرعة²³. وبالتالي ، يمكن أن توفر نباتات الشبكية منصة لائقة للتحقيق في الأهداف العلاجية المحتملة لمجموعة واسعة من أمراض الشبكية²⁴،^25،26. توفر مزارع زراعة الشبكية تقنية يمكن التحكم فيها وهي بديل مرن للغاية لل mothods الموجودة التي تسمح بالعديد من التلاعب الدوائي ويمكن أن تكشف عن العديد من الآليات الجزيئية²⁷.

الهدف العام من هذه الورقة هو تقديم تقنية زراعة الشبكية كنظام نموذج وسيط معقول بين مزارع الخلايا في المختبر والنماذج الحيوانية في الجسم الحي . يمكن لهذه التقنية محاكاة وظائف الشبكية بطريقة أفضل من الخلايا المنفصلة. نظرا لأن طبقات الشبكية المختلفة تظل سليمة ، يمكن تقييم التفاعلات بين الخلايا في الشبكية في المختبر في ظل ظروف كيميائية حيوية يتم التحكم فيها جيدا ومستقلة عن عمل نظام الأوعية الدموية²⁸.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في جامعة أوكلاند ، روتشستر ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية واتبعت الإرشادات التي وضعتها جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.

1. إعداد الحيوانات

1. حافظ على الحيوانات تحت درجة حرارة ثابتة في بيئة يتم التحكم فيها بالضوء. يجب أن تتبع إعدادات درجة الحرارة لغرفة سكن الحيوانات الإرشادات المنصوص عليها في "دليل رعاية واستخدام المختبر". تتراوح درجة حرارة الفئران بين 18 درجة مئوية و 26 درجة مئوية. حافظ على مستويات الرطوبة التي يتم التحكم فيها وضبطها على حوالي 42٪.
2. لهذه التجربة ، استخدم ذكور الفئران C57BL / 6J (تحقق من جدول المواد للحصول على التفاصيل) التي يزيد عمرها عن 12 أسبوعا (تم استخدام فأر بالغ لهذا البروتوكول).
   ملاحظة: تم استخدام سلالة من النوع البري في هذا البروتوكول للعرض التوضيحي ، حيث لم يكن لديها أي تشوهات وراثية تؤثر على شبكية العين. ومع ذلك ، يمكن للمرء استخدام سلالات أخرى ، بما في ذلك السلالات التي تم التلاعب بها وراثيا ، لثقافة زراعة الشبكية.
3. توفير دورات الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة عبر التحكم في الإضاءة في غرف إسكان الحيوانات.
4. افحص كل للتأكد من صحته وتناول الطعام والماء الكافي مرتين يوميا خلال الأسبوع ومرة واحدة يوميا في عطلات نهاية الأسبوع. تأكد من تزويدهم بالطعام الطازج والمياه النظيفة.
5. إذا كانت مستويات الطعام والماء منخفضة خلال الأسبوع ، اشطف زجاجة الماء وأعد تعبئتها. أضف الطعام الطازج عند الحاجة. تغيير الأقفاص المتسخة يوميا أو حسب الحاجة لصحة الحيوانات.
   ملاحظة: لدراسة المستقبلات الضوئية والتغيرات التي يسببها الضوء في شبكية العين ، قم بتكييف الفئران المظلمة طوال الليل في صندوق مظلم خاص يقع في غرفة مظلمة في منشأة الحيوانات.
6. القتل الرحيم للحيوانات في قفصها المنزلي عن طريق جرعة زائدة من استنشاق CO 2 باستخدام غاز CO 2 المضغوط في اسطوانات متصلة بغرفة CO ₂. إجراء تأكيد الوفاة باستخدام طريقة ثانوية للقتل الرحيم مثل خلع عنق الرحم.
7. بعد الانتهاء من الإجراء ، تأكد من موت الحيوان بالطريقة المناسبة ، مثل تأكيد السكتة القلبية والتنفسية أو مراقبة التلاميذ الثابتة والمتوسعة للحيوان.

2. إعداد الأنسجة

1. بمجرد القتل الرحيم للحيوان ، قم بتنظيف المنطقة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم افتح الجفون بيد واحدة بحيث تكون العين مرئية. قم بالضغط على الأجزاء العلوية والسفلية من المدار باليد المعاكسة باستخدام ملقط منحني حتى تبرز الكرة الأرضية.
2. لاستئصال العين ، أغلق الملقط برفق على الجزء الخلفي من العين ، وارفعه بحركة مستمرة. باستخدام ملقط ، أمسك مقلة العين من العصب البصري. تأكد من استخدام أدوات التشريح المعقمة لجميع الخطوات والعمل في ظل ظروف معقمة كاملة.
3. اغمر كل مقلة عين في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من HBSS المثلج مع البنسلين الستربتومايسين (10000 وحدة / مل). اغسل مقلة العين في HBSS مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
4. انقل مقلة العين إلى أنبوب سعة 1.5-2 مل يحتوي على وسائط كاملة (10٪ FBS ، 2٪ B27 ، 1٪ N2 ، 1٪ L-جلوتامين ، و 1٪ بنسلين وستربتومايسين).

3. تشريح الأنسجة

1. تشريح الشبكية بعناية تحت مجهر التشغيل، كما هو موضح بالتتابع في الشكل 1.
   1. قم بعمل شق محيطي حول الحافة لفتح مقلة العين. إزالة القرنية عن طريق التشريح الدائري على طول حدود القرنية والشق (القزفي) ، تليها إزالة الجزء الأمامي والعدسة والجسم الزجاجي ، وترك كوب العين فارغا.
   2. من خلال إمساك منطقة رأس العصب البصري بملقط ناعم ، انزع الطبقة الخارجية للعين بلطف. انتبه جيدا أثناء إزالة الغلاف الخارجي حتى لا تجرح الشبكية العصبية ولضمان بقاء الشبكية سليمة تماما.
      ملاحظة: يجب تقشير الشبكية بعناية بعيدا عن ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) ، ويجب إجراء قطع واحد في رأس العصب البصري لفصل الشبكية عن العصب البصري. تأكد بصريا من ذلك عن طريق تحديد الثقب الذي خلفه العصب البصري (رأس العصب البصري).
   3. تشريح شبكية العين شعاعيا إلى أربع قطع متساوية الحجم.
2. اتبع الخطوات أدناه للتعامل مع القطع الصغيرة من شبكية العين لضمان التوجيه الصحيح لثقافة الشبكية.
   1. باستخدام شفرة مقص تشريح ، افتح أسفل قطعة الشبكية مباشرة (جدول المواد).
   2. ارفع قطعة الشبكية ببطء بطرف شفرة مقص مفتوحة ، وانقلها برفق إلى لوحة الثقافة.
3. انقل النباتات الخارجية المشتقة من الشبكية المعزولة بشكل منفصل إلى إدخالات زراعة الخلايا في صفيحة مكونة من 12 بئرا ، تحتوي كل منها على 300 ميكرولتر من وسائط زرع الشبكية ، مع توجيه جانب خلية العقدة الشبكية (الشبكية العصبية) لأعلى.
   ملاحظة: تأكد من أن الوسائط هي وسائط DMEM مع مكملات N2 و B27. أضف البنسلين الستربتومايسين (10000 وحدة / مل) إلى الوسائط أيضا (جدول المواد). تتكون شبكية العين من طبقات متعددة من الخلايا العصبية المترابطة عبر نقاط الاشتباك العصبي وتدعمها من الخارج الطبقة المصطبغة من ظهارة صبغة الشبكية ، وهي الطبقة السوداء التي تمت إزالتها أثناء التشريح.
4. إزالة أي بقايا من ظهارة مصطبغة. ومع ذلك ، يمكن أن تساعد هذه البقايا في تحديد الاتجاه الصحيح للزرع. تأكد من أن الجزء المصطبغ متجها لأسفل وأن الجزء غير المصطبغ متجها لأعلى.
5. احتضان مزرعة زراعة الشبكية في حاضنات مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
6. تأكد من أن سطح الشبكية متجها لأعلى. إذا كانت قطعة الشبكية مقلوبة أو مطوية ، فحاول ضبطها برفق على الاتجاه الصحيح.
   ملاحظة: انتبه جيدا للاتجاه الصحيح لزرع الشبكية في لوحة الثقافة. تجنب أي تقليب أو طي للنبات في صفيحة المزرعة لأن ذلك سيؤدي إلى فشل النمو السليم لخلايا الشبكية في الثقافة.

4. زراعة الشبكية

1. الحفاظ على مزارع زراعة الشبكية (المعدة في الخطوات 3.2-3.3) في حاضنات مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
2. تغيير نصف وسائل الإعلام من كل بئر كل يوم لمدة 2 أسابيع. افعل ذلك عن طريق سحب 150 ميكرولتر من البئر بعناية. ثم أضف 150 ميكرولتر من الوسائط الطازجة مرة أخرى إلى البئر. تجنب قلب النبات عند تغيير الوسائط.
3. تحقق من الزرع بعناية تحت المجهر قبل إعادة لوحة الثقافة إلى الحاضنة. فحص سلامة الخلايا وبنية الشبكية تحت مجهر برايتفيلد. تأكد من أن النبات لا يزال موجها بشكل صحيح. استخدم كلا من العدسات الموضوعية 4x و 20x لفحص الزرع.
   ملاحظة: تجنب الغمر الكامل للزرع في الوسائط.

5. الكيمياء الهيستولوجية المناعية

1. بعد 2 أسابيع ، إصلاح زرع الشبكية عن طريق إزالة الوسائط. قم بذلك عن طريق الغسيل أولا مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS ثم إضافة 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في 0.1 M PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، إلى البئر الذي يحتوي على النبات وتركه طوال الليل.
   ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة دون إزالة حشوات الثقافة من اللوحة. يمكن أيضا نقل النباتات الخارجية إلى أنبوب مخروطي سعة 500 ميكرولتر ، ويمكن إجراء الغسيل والتثبيت داخل الأنبوب.
2. انقل النبات إلى أنبوب مخروطي سعة 500 ميكرولتر يحتوي على 300 ميكرولتر من 1x PBS-2.5٪ Triton X للغسيل.
3. اغسل النباتات الثابتة في الأنبوب ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام سرعة متوسطة على شاكر (25 دورة في الدقيقة).
4. منع التفاعلات غير المحددة المتوقعة عن طريق احتضان explant مع 300 ميكرولتر من 1x مانع عازلة تحتوي على 0.02٪ ثيميروسال لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل حضانة الأجسام المضادة.
5. احتضان النباتات الثابتة بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام سرعة متوسطة على شاكر.
   ملاحظة: الكشف عن الخلايا البطانية للشبكية في النبات الثابت عن طريق تلطيخها بالجسم المضاد GSL I ، BSL I (ليكتين) (7: 1000). الكشف عن الخلايا الدبقية في الشبكية عن طريق تلطيخ الجسم المضاد للبروتين الحمضي الليفي الدبقي للأرانب (GFAP) (1: 250). الكشف عن الخلايا العصبية في شبكية العين عن طريق تلطيخ explant مع الجسم المضاد NeuN الأرنب (1: 250) ^29،30. احتضان s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explants مع تركيبة الليكتين، NeuN، واحتضان الآخرين مع تركيبة الليكتين، GFAP.
6. في اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي من الأنابيب عن طريق الشفط باستخدام ماصة. اغسل النباتات باستخدام 1x PBS-2.5٪ Triton X ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام سرعة متوسطة على شاكر.
7. أضف الأجسام المضادة الثانوية: الماعز المضاد للأرانب IgG (1: 500) (ثانوي ل GFAP و NeuN) وتكساس الأحمر (7: 1,000) (للليكتين). احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام سرعة متوسطة على شاكر.
   ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء ، لذا قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم.
8. قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية عن طريق الشفط ، ثم اغسلها ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS-2.5٪ Triton X.
9. انقل النبات من الأنبوب إلى شريحة زجاجية باستخدام ماصة نقل. قم بإزالة أي سائل زائد على الشريحة، ثم أضف قطرة واحدة من وسائط التركيب باستخدام DAPI إلى الشريحة.
10. قم بتغطية المنديل بغطاء غطاء. لا تسمح بأي فقاعات هواء بين الغطاء والمنديل.
11. خذ الشرائح الملطخة إلى مجهر التألق ، وابدأ في التقاط الصور. من المهم تغطية الشرائح الملطخة باستخدام صندوق منزلق لأن تلطيخ التألق حساس للضوء.

النتائج

بقاء الخلايا العصبية والأوعية الدموية في الشبكية في الشبكية في المزرعة خارج الجسم الحي لفترة طويلة
من خلال زراعة نبات شبكية العين باستخدام بروتوكولنا ، نجحنا في الحفاظ على خلايا شبكية مختلفة كانت قابلة للحياة لمدة تصل إلى 2 أسابيع. للتحقق من وجود خلايا ش?...

Discussion

يدرس مختبرنا التغيرات الفيزيولوجية المرضية التي تعزز ضعف الأوعية الدموية الدقيقة في شبكية العين لسنوات³¹،32،33،34،^35،36. تعد زراعة الشبكية إحدى التقنيات التي يمكن أن تكون ذات قيمة كبي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407