Obtención y descelularización de extremidades posteriores de ratas utilizando un biorreactor basado en perfusión ex vivo para alotrasplante compuesto vascularizado

Resumen

Describimos la técnica quirúrgica y el proceso de descelularización para extremidades posteriores de ratas compuestas. La descelularización se lleva a cabo utilizando dodecil sulfato de sodio de baja concentración a través de un sistema de perfusión de máquina ex vivo .

Resumen

Los pacientes con lesiones traumáticas graves y pérdida de tejido requieren una reconstrucción quirúrgica compleja. El alotrasplante compuesto vascularizado (ACV) es una vía reconstructiva en evolución para transferir múltiples tejidos como una subunidad compuesta. A pesar de la naturaleza prometedora de VCA, los requisitos inmunosupresores a largo plazo son una limitación significativa debido al mayor riesgo de neoplasias malignas, toxicidad de órganos terminales e infecciones oportunistas. La ingeniería tisular de andamios compuestos acelulares es una alternativa potencial para reducir la necesidad de inmunosupresión. En este documento, se describe la obtención de una extremidad posterior de rata y su posterior descelularización utilizando dodecil sulfato de sodio (SDS). La estrategia de adquisición presentada se basa en la arteria femoral común. Se construyó un sistema de biorreactor basado en la máquina de perfusión y se utilizó para la descelularización ex vivo de la extremidad posterior. Se realizó con éxito la descelularización de perfusión, lo que resultó en una apariencia blanca translúcida de la extremidad posterior. Se observó una red vascular intacta y perfusible en toda la extremidad posterior. Los análisis histológicos mostraron la eliminación del contenido nuclear y la preservación de la arquitectura tisular en todos los compartimentos tisulares.

Introducción

VCA es una opción emergente para los pacientes que requieren reconstrucción quirúrgica compleja. Las lesiones traumáticas o las resecciones tumorales resultan en pérdida volumétrica de tejido que puede ser difícil de reconstruir. VCA ofrece el trasplante de múltiples tejidos como la piel, el hueso, el músculo, los nervios y los vasos como un injerto compuesto de un donante a un receptor¹. A pesar de su naturaleza prometedora, VCA es limitado debido a los regímenes inmunosupresores a largo plazo. El uso a lo largo de la vida de tales medicamentos resulta en un mayor riesgo de infecciones oportunistas, neoplasias malignas y toxicidad en órganos terminales ^1,2,3. Para ayudar a reducir y/o eliminar la necesidad de inmunosupresión, los andamios de ingeniería tisular que utilizan enfoques de descelularización para VCA son muy prometedores.

La descelularización tisular implica retener la estructura de la matriz extracelular mientras se elimina el contenido celular y nuclear. Este andamio descelularizado puede ser repoblado con células específicas del paciente⁴. Sin embargo, preservar la red ECM de tejidos compuestos es un desafío adicional. Esto se debe a la presencia de múltiples tipos de tejidos con diferentes densidades de tejido, arquitecturas y ubicaciones anatómicas dentro de un andamio. El presente protocolo ofrece una técnica quirúrgica y un método de descelularización para una extremidad posterior de rata. Este es un modelo de prueba de concepto para aplicar esta técnica de ingeniería de tejidos a tejidos compuestos. Esto también puede provocar esfuerzos posteriores para regenerar tejidos compuestos a través de la recelularización.

Protocolo

Para todos los experimentos se utilizaron ratas Lewis macho cadavéricas (300-430 g) obtenidas del Instituto de Investigación del Hospital General de Toronto. Para todos los procedimientos quirúrgicos, se utilizaron instrumentos y suministros estériles para mantener la técnica aséptica (ver la Tabla de materiales). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales del Instituto de Investigación del Hospital General de Toronto, Red de Salud de la Universidad (Toronto, ON, Canadá). Un total de cuatro extremidades posteriores fueron descelularizadas.

1. Preparación prequirúrgica

1. Preparar 50 mL de solución salina heparinizada al 5%. De una bolsa de solución salina de 50 ml, saque 2,5 ml de solución salina con una jeringa de 5 ml y deséchela. Con una jeringa de 5 ml, agregue 2,5 ml de heparina a la bolsa salina. Invierta la bolsa salina para mezclar su contenido.
2. Coloque una rata cadavérica en posición supina debajo de una almohadilla azul. Afeite la extremidad posterior y el área de la ingle circunferencialmente con una afeitadora eléctrica y elimina el vello.
3. Lleve a la rata a la estación quirúrgica y aplique la solución de exfoliante de povidona yodada con una gasa en la extremidad posterior y el área de la ingle. Posteriormente, aplique alcohol isopropílico al 70% para limpiar la solución exfoliante con una gasa.
4. Deseche la almohadilla azul del paso 1.2 y cámbiese a guantes nuevos y estériles.

2. Adquisición de extremidades traseras de rata

1. Haga una incisión en la piel usando una cuchilla quirúrgica #10 y un corredor de cuchilla #3 a lo largo del nivel del ligamento inguinal, moviéndose de una dirección lateral a una medial (Figura 1A). Use pinzas Adson para sostener la piel circundante para asegurar una incisión suave.
2. Cuando la grasa subyacente esté expuesta, use una disección contundente para diseccionar cuidadosamente a través de la grasa. Localice los vasos epigástricos superiores.
3. Use microtijeras para diseccionar proximalmente y exponer el nervio femoral, la arteria y la vena subyacentes a nivel del ligamento inguinal.
4. Bajo un microscopio de disección, identifique los vasos femorales y diseccione la arteria y la vena proximalmente usando fórceps finos para obtener suficiente longitud de los puntos de bifurcación de la red arterial (Figura 1B).
5. Ligate la arteria femoral y la vena por separado usando suturas 6-0.
6. Realizar disección circunferencial alrededor del resto de la extremidad posterior sin interrumpir los vasos femorales ligados.
7. Transección del hueso femoral a mitad de longitud con un cortador de hueso.
8. Para aislar completamente la extremidad posterior, transecto los vasos femorales ligados debajo de las ligaduras con microtijeras.
9. Canular la arteria femoral usando un angiocatéter 24 G bajo el microscopio de disección. Use fórceps finos para insertar la cánula con cuidado. Enjuague con solución salina heparinizada hasta que se observe una salida clara de la vena femoral.
10. Asegure la cánula atando una sutura alrededor del recipiente canulado y otra sutura distalmente alrededor de la cánula misma. Asegúrese de que la cánula se coloque proximalmente para evitar el bloqueo de los puntos de bifurcación.
11. Sumergir las extremidades posteriores obtenidas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta la descelularización.

Figura 1: Obtención de extremidades posteriores de rata. (A) Marcado de la incisión cutánea a nivel del ligamento inguinal de lateral a medial. (B) Vista de la vena femoral y la arteria femoral, que han sido disecadas proximalmente hacia el ligamento inguinal, indicado por la línea punteada. Abreviaturas: L = lateral; M = medial; FV = vena femoral; FA = arteria femoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación de soluciones

1. En un matraz de vidrio de 6 L, preparar un depósito de detergente de 5 L de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,25% disolviendo 12,5 g de polvo de SDS en 5 L de agua destilada ultrapura. Cubrir la abertura del matraz con parafilm para sellarlo.
2. En un frasco de vidrio de 1 L, prepare 1 L de solución de SDS al 0,25% por separado disolviendo 2,5 g de SDS en 1 L de agua destilada ultrapura. Agregue una barra de agitación para mezclar la solución en un agitador magnético hasta que se disuelva toda la SDS.
3. Prepare 1 L de 1x solución de lavado PBS con solución de antibióticos-antimicóticos (AA) al 1%. En un matraz de 1 L, añadir 990 ml de 1x solución de PBS y 10 ml de AA.
4. Por separado, en un frasco de vidrio de 500 ml, prepare 1x PBS + 1% AA solución nuevamente usando 495 ml de 1x solución PBS y 5 ml de AA.
5. Prepare 200 ml de solución de ácido peracético (PAA) al 1% / etanol al 4% (EtOH). Prepare esta solución bajo una campana extractora.

4. Construcción de biorreactores y circuitos de perfusión

NOTA: Consulte la Figura 2 para la configuración del biorreactor y el circuito de perfusión a lo largo de los pasos enumerados.

1. En una cámara de 500 ml (recipiente de plástico), perfore tres orificios (1/4 de pulgada) en las ubicaciones etiquetadas en la Figura 2: El puerto A es la línea de entrada, el puerto B es la línea de reposición y el puerto C es la línea de salida. Retire y deseche el exceso de plástico. Rocíe y limpie la cámara con etanol al 70%.
2. Corte tres tubos de silicona de 5 cm de largo e inserte uno hasta la mitad en cada puerto de la cámara. Conecte un conector Luer macho en la abertura del puerto A frente al interior de la cámara y un conector Luer hembra en el otro extremo del tubo fuera de la cámara.
3. Conecte un conector Luer hembra en el puerto B y el puerto C en los extremos de los tubos orientados hacia fuera de la cámara.
4. En una tapa hermética para el recipiente de plástico, perfore un orificio en la superficie de la tapa.
5. Corte un tubo de silicona de 3 cm e insértelo en el orificio de la tapa. Asegúrese de que aproximadamente 2 cm del tubo estén ubicados fuera de la tapa, como se muestra en la Figura 2.
6. Esterilice tanto la cámara como la tapa con el tubo.
7. Corte dos tubos de silicona de 30 cm con tijeras. Conecte un conector de 1/16 de pulgada a un conector de 1/8 de pulgada en un extremo de cada tubo.
8. Por separado, corte dos tubos de silicona de 12 cm con tijeras. Conecte un conector de 1/16 de entrada a un conector de 1/8 de pulgada en un extremo de ambos tubos. Conecte un conector Luer macho en el otro extremo de un tubo y un conector Luer hembra al otro tubo.
9. Esterilice todo el material de tubería de los pasos 4.7 y 4.8. Incluya dos tubos de bomba de 3 paradas (1,85 mm) en la esterilización.
10. Prepare tres llaves de paso de 3 vías, un filtro de jeringa, dos pipetas serológicas de 1 ml y una jeringa de 10 ml para la configuración de descelularización. Retirar el filtro de las pipetas serológicas de 1 ml.

Figura 2: Preparación de la construcción de biorreactores y circuitos de perfusión. Aparato mostrado del circuito de perfusión que incluye (A) bomba peristáltica y (B) casetes correspondientes para las líneas de entrada y salida. (C, D) Los tubos de silicona de 12 cm y 30 cm también se muestran con los conectores respectivos. (E) Tubería para bomba peristáltica (1,85 mm). Cámara de biorreactor con puertos etiquetados para (F) entrada, (G) puerto de reposición y (H) salida. (I) Tapa del biorreactor mostrada con puerto de ventilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Descelularización de las extremidades posteriores de rata

1. Coloque la cámara esterilizada y atornille tres llaves de paso de 3 vías de un solo uso en las líneas de entrada, salida y reposición. Asegúrese de que la llave de paso para el puerto de reposición esté tapada en sus dos puertos restantes para evitar fugas.
2. Acople los tubos fabricados en el paso 4.8 a las llaves de paso en las líneas de entrada y salida.
3. Conecte el tubo peristáltico a los tubos en el paso anterior. Asegure el cassette en el tubo peristáltico y colóquelo en la bomba peristáltica. No asegure los casetes con el tubo en su lugar todavía.
4. Conecte un tubo del paso 4.7 al final del tubo peristáltico de la línea de salida del paso anterior. Conectar una pipeta serológica de 1 ml en el otro extremo. Suspender el extremo fijado con una pipeta serológica en el matraz del depósito de residuos.
5. Repita el paso 4.7 para la línea de entrada. Suspender el extremo del tubo conectado a la pipeta serológica en el depósito de detergente. Sellar inmediatamente la abertura del matraz del depósito de detergente con parafilm. Consulte la Figura 3A,B para una visión general del circuito de descelularización.
6. Agregue 0.25% SDS del frasco de vidrio de 1 L (paso 3.2) en la cámara del biorreactor a nivel medio.
7. Tome la extremidad posterior adquirida con pinzas Adson y suspenda cuidadosamente en la cámara del biorreactor.
8. Use dos pares de pinzas Adson para guiar la porción canulada de la extremidad posterior hasta la línea de entrada. Mientras sostiene la cánula con un par de fórceps, use el otro par de fórceps para torcer y asegurar la línea de entrada a la cánula. Asegúrese de que la cánula no esté tirada o torcida para evitar la decanulación.
9. Una vez asegurado, agregue más 0.25% SDS del frasco de vidrio de 1 L para sumergir completamente la extremidad, según sea necesario. Asegúrese de que el puerto de salida también esté sumergido en el depósito del biorreactor para garantizar que se mantenga un flujo de salida constante (Figura 3C).
10. Acople un filtro de jeringa de un solo uso al puerto de ventilación de la tapa de la cámara del biorreactor, haciendo referencia a los pasos 4.4 y 4.5.
11. Asegure la tapa del biorreactor y asegúrese de que la cámara esté sellada por todos los lados (Figura 3B).
12. Para eliminar el aire del tubo y cebar el circuito de perfusión, use una jeringa nueva de 10 ml de un solo uso para extraer detergente del depósito de detergente utilizando la llave de paso de 3 vías en la línea de entrada.
13. Una vez extraído, use el mismo líquido para insertarlo en la llave de paso de 3 vías en la línea de salida. Asegúrese de que haya detergente presente en todo el tubo, tanto en las líneas de entrada como en las de salida.
14. Presione y asegure los casetes con el tubo en la bomba peristáltica. Encienda la bomba peristáltica con el botón de encendido.
    1. En la pantalla de la bomba peristáltica, vaya a la segunda pestaña usando la tecla de flecha para establecer la velocidad de perfusión para el primer canal. Caudal de entrada como modo de entrega y ajuste el caudal de perfusión a 1 mL/min. Asegúrese de que la dirección del flujo sea correcta de acuerdo con la configuración del aparato. Repita para el segundo canal.
    2. Calibre la bomba peristáltica para asegurarse de que la cantidad de fluido suministrado a través de la línea de entrada y/o tomado de la línea de salida fluya a una velocidad constante entre las dos. Asegúrese de que el ID del tubo esté ajustado en 1,85 mm.
15. Comience la descelularización mediante perfusión de la máquina a 1 ml / min para las líneas de entrada y salida presionando el botón de encendido en el teclado. Monitoree y asegúrese de que el flujo sea consistente y continuo tanto en las líneas de entrada como en las de salida.
16. Continúe la descelularización y monitoree diariamente. Utilice 1 L de SDS al 0,25% (paso 3.2) para reponer el depósito del biorreactor a través del puerto de reposición, según sea necesario. Busque una apariencia blanca y translúcida del tejido, que aparecerá para el día 5, lo que indica la descelularización de las extremidades posteriores de la rata.

Figura 3: Descripción general del circuito del biorreactor de descelularización de perfusión de extremidades posteriores de rata. (A) Representación esquemática del circuito de perfusión del biorreactor. Las flechas azules indican la dirección del detergente y el flujo de residuos. (B) Visión general del circuito de descelularización con biorreactor que contiene extremidades posteriores de rata. El depósito SDS (matraz izquierdo) conduce a la bomba peristáltica y al tubo de entrada del biorreactor. El flujo de salida está conectado al depósito de residuos (matraz derecho) a través de la bomba peristáltica. (C) (I) Biorreactor que contiene extremidad posterior de rata con tubo de entrada conectado a la arteria femoral canulada. (II) Puerto de reposición situado en la esquina para perfundir detergente. (III) Tubo de salida suspendido en depósito de suspensión. Abreviatura: SDS = dodecil sulfato de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Lavado y esterilización post-descelularización

1. Después de la confirmación de la descelularización, reemplace el depósito de detergente con el depósito 1x PBS + 1% AA. Sellar la abertura del matraz con parafilm. Comience 1x PBS + 1% de perfusión AA a 1 ml / min y continúe durante 2 días.
2. Reemplace el reservorio 1x PBS + 1% AA con 200 mL de reservorio de 0.1% PAA/4% EtOH y comience la perfusión a 1 mL/min durante 2 h.
3. Desconecte la extremidad posterior de la línea de entrada usando dos pares de pinzas Adson estériles, con un par de pinzas para torcer la línea de entrada y el otro sosteniendo la cánula. Asegúrese de que la cánula no se tire para evitar la decanulación.
4. Conservar la extremidad en un frasco de vidrio de 500 ml que contenga 1x PBS + 1% AA a 4 °C hasta su uso posterior.

Resultados

El protocolo de adquisición tuvo éxito en aislar y canular las arterias femorales comunes para los pasos posteriores de perfusión. Las imágenes representativas de disección en la Figura 1A,B muestran la ubicación de la incisión y la exposición de los vasos femorales con suficiente distancia de los puntos de bifurcación. La figura 2 muestra el aparato necesario para preparar el biorreactor y el circuito de perfusión. El punto final de ...

Discusión

Las extremidades posteriores de rata son útiles como modelos experimentales en VCA⁵. La ingeniería tisular de andamios acelulares representa el primer paso para abordar las deficiencias de los regímenes de inmunosupresión a largo plazo asociados con VCA. El uso de injertos compuestos plantea un desafío adicional dada la presencia de múltiples tejidos, cada uno con propiedades funcionales, inmunogénicas y estructurales únicas. El presente protocolo muestra un método exitoso para obtener ex...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL	Baxter Corporation	JB1308M
1 mL Disposable Serological Pipets	VWR	75816-102
10 cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
3-way Stopcock			Obtained from Research Institution
5cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
70% Isopropyl Alcohol			Obtained from Research Institution
Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm	VWR	CA28143-310
Adson Forceps, Straight	Fine Science Tools	11006-12
Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”)	VWR	38112
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL	Multicell	450-115-EL
Bone Cutter	Fine Science Tools	12029-12
Connectors for  1/16" to 1/8" Tubes	McMasterCarr	5117K52
Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K328
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fine Forceps with Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools	11253-20
Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL	LEO Pharma Inc.	006174-09
Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K322
Micro Needle Holder	WLorenz	04-4125
Microscissors	WLorenz	SP-4506
Peracetic Acid	Sigma Aldrich	269336-100ML
Peristaltic Pump, 3-Channel	Cole Parmer	RK-78001-68
Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL	Wisent	311-425-CL
Povidone Surgical Scrub Solution			Obtained from Research Institution
Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL	Cole Parmer	RK-96450-40
Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone	Cole Parmer	RK-96410-16
Scalpel Blade - #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg	Bioshop	SDS003.1
Surgical Suture #6-0	Covidien	VS889