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Resumen

Este protocolo ilustra un ensayo de transcitosis de células endoteliales in vitro como modelo para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina midiendo la capacidad de las células endoteliales microvasculares de la retina humana para transportar peroxidasa de rábano picante a través de las células en procesos de transporte transcelular mediados por caveolas.

Resumen

La disfunción de la barrera hemato-retiniana (BRB) contribuye a la fisiopatología de varias enfermedades oculares vasculares, lo que a menudo resulta en edema retiniano y posterior pérdida de visión. La barrera hemato-retiniana interna (BIB) está compuesta principalmente por endotelio vascular retiniano con baja permeabilidad en condiciones fisiológicas. Esta característica de baja permeabilidad está estrechamente regulada y mantenida por bajas tasas de transporte paracelular entre células endoteliales microvasculares retinianas adyacentes, así como el transporte transcelular (transcitosis) a través de ellas. La evaluación de la permeabilidad de la barrera transcelular retiniana puede proporcionar información fundamental sobre la integridad de iBRB en la salud y la enfermedad. En este estudio, describimos un ensayo de transcitosis de células endoteliales (CE), como un modelo in vitro para evaluar la permeabilidad de iBRB, utilizando células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC). Este ensayo evalúa la capacidad de los HRMEC para transportar transferrina y peroxidasa de rábano picante (HRP) en procesos de transporte transcelular mediados por receptores y caveolas, respectivamente. Los HRMEC totalmente confluentes cultivados en membrana porosa se incubaron con transferrina marcada con fluorescencia (transcitosis dependiente de clatrina) o HRP (transcitosis mediada por caveolas) para medir los niveles de transferrina o HRP transferidos a la cámara inferior, indicativos de los niveles de transcitosis a través de la monocapa de CE. La señalización Wnt, una vía conocida que regula iBRB, se moduló para demostrar el método de ensayo de transcitosis basado en HRP mediado por caveolas. El ensayo de transcitosis EC descrito aquí puede proporcionar una herramienta útil para investigar los reguladores moleculares de la permeabilidad EC y la integridad de iBRB en patologías vasculares y para los sistemas de administración de fármacos.

Introducción

La retina humana es uno de los tejidos más exigentes de energía en el cuerpo. El buen funcionamiento de la retina neural requiere un suministro eficiente de oxígeno y nutrientes junto con un flujo restringido de otras moléculas potencialmente dañinas para proteger el ambiente retiniano, que está mediado a través de la barrera hematoretiniana (BRB)1. Similar a la barrera hematoencefálica (BBB) en el sistema nervioso central, el BRB actúa como una barrera selectiva en el ojo, regulando el movimiento de iones, agua, aminoácidos y azúcar dentro y fuera de la retina. BRB también mantiene la homeostasis retiniana y su privilegio inmunológico al prevenir la exposición a factores circulatorios como células inmunes, anticuerpos y patógenos dañinos2. La disfunción BRB contribuye a la fisiopatología de varias enfermedades oculares vasculares, como la retinopatía diabética, la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la retinopatía del prematuro (RP), la oclusión de la vena retiniana y la uveítis, lo que resulta en edema vasogénico y posterior pérdida de visión 3,4,5.

El BRB consiste en dos barreras separadas para dos redes vasculares oculares distintas, respectivamente: la vasculatura retiniana y el coriocapilar fenestrado debajo de la retina. El BRB interno (iBRB) está compuesto principalmente por células endoteliales microvasculares de la retina (RMEC) que recubren la microvasculatura retiniana, que nutre las capas neuronales internas de la retina. Por otro lado, el epitelio pigmentario de la retina forma el componente principal del BRB externo, que se encuentra entre la retina neurosensorial y el coriocapilar2. Para el iBRB, el transporte molecular a través de RMEC tiene lugar a través de rutas paracelulares y transcelulares (Figura 1). El alto grado de selectividad de sustancias a través del iBRB se basa en (i) la presencia de complejos de proteínas de unión que restringen el transporte paracelular entre células endoteliales adyacentes (CE), y (ii) bajos niveles de expresión de mediadores, transportadores y receptores de caveolas dentro de las células endoteliales que mantienen bajas tasas de transporte transcelular 1,6,7,8 . Los complejos de unión que regulan el flujo paracelular están compuestos por uniones estrechas (claudinas, ocludinas), uniones adherentes (cadherinas EV) y uniones gap (conexinas), que permiten el paso de agua y pequeños compuestos solubles en agua. Mientras que las moléculas lipofílicas pequeñas se difunden pasivamente a través del interior de los RMEC, el movimiento de moléculas lipofílicas e hidrófilas más grandes está regulado por vías transendoteliales impulsadas por ATP, incluyendo el transporte vesicular y los transportadores de membrana 5,9.

La transcitosis vesicular se puede clasificar como transcitosis caveolina mediada por caveolina, transcitosis dependiente de clatrina (y mediada por receptores) y macropinocitosis independiente de clatrina (Figura 2). Estos procesos de transporte vesicular involucran vesículas de diferentes tamaños, siendo los macropinosomas los más grandes (que van desde 200-500 nm) y las caveolas las más pequeñas (con un promedio de 50-100 nm), mientras que las vesículas recubiertas de clatrina varían de 70-150 nm10. Las caveolas son invaginaciones de membrana plasmática ricas en lípidos en forma de matraz con una capa de proteína, compuesta principalmente de caveolina-1 que se une al colesterol de la membrana lipídica y otras proteínas estructurales y de señalización a través de su dominio de andamiaje de caveolina11. Las caveolinas trabajan junto con cavina unida periféricamente para promover la estabilización de las caveolas en la membrana plasmática12. Las membranas caveolares también pueden transportar receptores para otras moléculas como insulina, albúmina y lipoproteínas circulantes, incluidas las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y las lipoproteínas de baja densidad (LDL) para ayudar a su movimiento a través de las células endoteliales13. Durante el desarrollo, la formación de BRB funcional depende de la supresión de la transcitosis EC8. El endotelio retiniano maduro, por lo tanto, tiene niveles relativamente bajos de caveolas, caveolina-1 y receptores de albúmina con respecto a otras células endoteliales en condiciones fisiológicas, contribuyendo a sus propiedades de barrera 4,9.

Debido a que la descomposición de iBRB es un sello distintivo importante de muchas afecciones oculares patológicas, es esencial desarrollar métodos para evaluar la permeabilidad vascular retiniana in vivo e in vitro. Estos métodos ayudan a proporcionar información probable sobre los mecanismos de la integridad del BRB comprometida y evaluar la eficacia de los posibles objetivos terapéuticos. Las imágenes in vivo actuales o los ensayos cuantitativos de fuga vascular suelen emplear fluorescentes (fluoresceína de sodio y dextrano), colorimétricos (colorante azul de Evans y sustrato de peroxidasa de rábano picante [HRP]) o trazadores radiactivos14 para detectar extravasación de la vasculatura a los tejidos retinianos circundantes con imágenes de microscopio o en lisado tisular aislado. Un trazador ideal para cuantificar la integridad vascular debe ser inerte y lo suficientemente grande como para penetrar libremente los vasos comprometidos mientras están confinados dentro de capilares sanos e intactos. Los métodos que emplean fluoresceína de sodio o dextrano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) en angiografía con fluoresceína de fondo de ojo vivo (FFA) o montajes planos retinianos aislados se utilizan ampliamente para cuantificar la extravasación retiniana in vivo o ex vivo. FITC-dextrano tiene la ventaja de estar disponible en diferentes pesos moleculares que van desde 4-70 kDa para estudios selectivos de tamaño15,16,17. La FITC-albúmina (~68 kDa) es un trazador alternativo de proteínas de gran tamaño de relevancia biológica para estudios de fugas vasculares18. El colorante Evans Blue, inyectado intracárdicamente19, retroorbitalmente, o a través de la vena de la cola 20, también se basa en su unión con albúmina endógena para formar una molécula grande que puede cuantificarse principalmente mediante detección espectrofotométrica o, menos comúnmente, microscopía de fluorescencia en montajes planos20,21. Sin embargo, estas metodologías cuantitativas o de imágenes de luz a menudo no distinguen el transporte paracelular del transporte transendotelial. Para el análisis específico de la transcitosis con visualización ultraestructural de vesículas transcitadas, se utilizan típicamente moléculas trazadoras como HRP para localizar vesículas transcitadas dentro de las células endoteliales que se pueden observar bajo un microscopio electrónico22,23,24 (Figura 3A-C).

El desarrollo y uso de modelos iBRB in vitro para evaluar la permeabilidad de las células endoteliales podría proporcionar una evaluación robusta y de alto rendimiento para complementar los experimentos in vivo y ayudar a la investigación de reguladores moleculares de la fuga vascular. Los ensayos comúnmente utilizados para evaluar el transporte paracelular y la integridad de las uniones estrechas incluyen la resistencia eléctrica transendotelial (TEER), una medida de conductancia iónica (Figura 4)2,25, y el ensayo de fuga vascular in vitro utilizando trazadores fluorescentes de peso molecular pequeño26. Además, se han utilizado ensayos de transcitosis basados en transferrina que modelan la BHE para explorar la transcitosis dependiente de clatrina27. A pesar de esto, los ensayos para evaluar BRB y, más específicamente, la transcitosis caveolar retiniana EC in vitro son limitados.

En este estudio, describimos un ensayo de transcitosis EC utilizando células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC) como modelo in vitro para determinar la permeabilidad iBRB y la transcitosis EC. Este ensayo se basa en la capacidad de los HRMEC para transportar transferrina o HRP a través de las vías de transcitosis mediadas por receptores o dependientes de caveolas, respectivamente (Figura 2). Los HRMEC cultivados a confluencia completa en la cámara apical (es decir, inserto de filtro) se incubaron con transferrina conjugada fluorescente (Cy3-Tf) o HRP para medir la intensidad de fluorescencia correspondiente a los niveles de transferrina o HRP transferidos a la cámara inferior a través de la transcitosis EC únicamente. La confluencia de la monocapa celular puede confirmarse midiendo TEER, indicando la integridad de la unión estrecha25. Para demostrar la técnica de ensayo TEER y transcitosis, se utilizaron moduladores moleculares conocidos de la permeabilidad vascular y la transcitosis CE, incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)28 y los de señalización Wnt (ligandos Wnt: Wnt3a y Norrin)29.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Boston Children's Hospital para la generación de microscopía óptica e imágenes EM (Figura 3). Los protocolos para los estudios in vivo pueden obtenerse de Wang et al.24. Todos los experimentos con células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC) fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) del Boston Children's Hospital.

1. Preparación de reactivos

  1. Solución para recubrir la placa de cultivo de tejidos: Prepare una solución de gelatina al 0,1% disolviendo 1 ml de solución madre de gelatina (40%-50%) en 500 ml de cultivo de tejido estéril grado 1x PBS (pH = 7.4). Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm. Conservar la solución de gelatina al 0,1% a 2-8°C. Se puede almacenar a dicha temperatura por un tiempo indefinido en condiciones estériles.
  2. Medio de crecimiento: Prepare 500 ml de medio completo de crecimiento celular endotelial (EGM) disolviendo los suplementos de EGM en el medio basal de crecimiento celular endotelial (EBM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). Medio de cultivo alícuota en tubos de 50 ml y conservar los tubos a 4 °C. La vida útil del medio de cultivo es de 12 meses a 4 °C.
  3. Solución de tripsina: Para una solución de tripsina-EDTA al 0,25%, alícuota del vial madre en tubos de 50 ml y conservar a 4 °C (hasta 2 semanas) o -20 °C (hasta 24 meses).

2. Cultivo de HRMECs

  1. Cultivo celular inicial
    1. Cubra las placas de Petri de cultivo celular (100 mm de diámetro x 20 mm de altura) con 5 ml de solución de gelatina al 0,1% bajo una campana de flujo laminar y manténgalas intactas en la campana durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) para un recubrimiento uniforme.
      NOTA: El recubrimiento de gelatina de los platos mejora la unión celular. Alternativamente, también se pueden utilizar matraces de cultivo T75 recubiertos de gelatina.
    2. Antes de sembrar las células, aspire la solución de gelatina con una bomba de vacío. La presión de vacío del aspirador utilizado fue de hasta 724 mmHg.
      NOTA: La aspiración debe hacerse inmediatamente antes de sembrar las células para evitar que se seque la solución de recubrimiento.
    3. Descongele un vial congelado de HRMEC (del almacenamiento en nitrógeno líquido) utilizando un baño de agua a 37 °C o añadiendo un medio de crecimiento caliente en el vial. Una vez descongelado, transfiera la suspensión celular a 9 ml de medio de crecimiento (suponiendo que el vial descongelado de HRMEC es de 1 ml).
      NOTA: Los HRMEC se obtuvieron comercialmente (Tabla de materiales). El medio de crecimiento añadido a las células siempre debe precalentarse a 37 °C antes de su uso.
    4. Gire las células a 200 x g durante 5 minutos a RT y aspire cuidadosamente el sobrenadante para evitar extraer el pellet celular.
    5. Resuspender el pellet celular en 10 ml de medio de crecimiento y transferir la suspensión resultante a una placa de Petri recubierta de gelatina. Mantener las células en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Por lo general, los HRMEC son 70% -80% confluentes después de 72 h.
      NOTA: El medio de crecimiento cambia cada dos días.
  2. Subcultivo de HRMECs en insertos de membrana permeable
    1. Preparar insertos filtrantes de cultivo celular (insertos de 6,5 mm con membrana de policarbonato de 0,4 μm de tamaño de poro, colocados en una placa de 24 pocillos) para sembrar HRMEC recubriendo cada inserto (cámara apical) con 200 μL de solución de gelatina al 0,1% durante 30 minutos bajo una campana de flujo laminar. Asegúrese de que la solución cubra toda la superficie inferior del inserto del filtro.
      NOTA: Cada pocillo tiene una cámara apical y basolateral separada por una membrana porosa.
    2. Saque la placa de Petri con HRMEC cultivados (paso 2.1.5.) de la incubadora y aspire los medios de crecimiento. Enjuague suavemente las células 2x con 10 ml de 1x PBS bajo una campana de flujo laminar para eliminar las posibles células flotantes / muertas.
    3. Disociar las células con 0,5-1 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,25% y colocar la placa de Petri en la incubadora (37 °C y 5%CO2) durante 5 min.
    4. Apague la actividad de la tripsina agregando 4.5-9 ml de medios de crecimiento y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml usando una pipeta de 10 ml.
    5. Gire las células a 200 x g durante 5 minutos en RT, retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 ml de medios de crecimiento.
    6. Contar el número de células usando un hemocitómetro manual o un contador celular automatizado y semilla a una densidad de 4 x 104 células por inserto de filtro (es decir, 1.25 x 105 células/cm2). El volumen de suspensión celular para cada inserto es de 250 μL.
    7. Aspirar la solución de recubrimiento de los pocillos que contienen insertos permeables y transferir 250 μL de la suspensión celular por inserto (cámara apical). Agregue solo medio (es decir, sin celdas) a uno de los insertos, que se utilizará como un "control en blanco" para la medición de TEER. Simultáneamente, también añadir 750 μL de medio por pocillo, en las cámaras basolaterales.
    8. Mantener la placa de 24 pocillos con insertos permeables en la incubadora (37 °C y 5% de CO2) durante 7-12 días hasta que las células cultivadas sean completamente confluentes y se alcance el valor TEER deseado de ~20 Ω·cm2.
    9. Cambie el medio de crecimiento cada dos días. Durante el cambio de medio, aspire cuidadosamente el medio para minimizar la interrupción de la monocapa celular y agregue 250 μL y 750 μL de medios frescos por pocillo a las cámaras apical y basolateral, respectivamente.
      NOTA: El medio de crecimiento se cambia para las cámaras apical y basolateral de los pocillos.

3. Mediciones TEER (Figura 4)

  1. En el día 14 después de la siembra celular (paso 2.2.9.), mida el TEER para HRMEC utilizando un sistema epitelial de voltímetro de ohmios (EVOM) (ER) (Tabla de materiales) de la siguiente manera.
  2. Precargue el sistema ER y compruebe la funcionalidad del medidor con el electrodo de prueba STX04. Camar, si es necesario.
  3. Conecte el electrodo al medidor y equilibre el electrodo empapándolo primero en etanol al 70% durante 15-20 minutos y luego sumergiéndolo brevemente en el medio de crecimiento EGM de cultivo celular.
  4. Mientras tanto, mantenga la placa de 24 pocillos que contiene celdas en la campana de flujo laminar a RT durante 15-20 minutos para equilibrar la temperatura.
    NOTA: Las mediciones TEER se ven afectadas por la temperatura, por lo que el paso de equilibrio es esencial.
  5. Para la medición TEER, agregue medio de crecimiento fresco a las cámaras apicales (250 μL) y basolaterales (750 μL) de los pocillos.
  6. Realice la medición TEER sumergiendo cuidadosamente el electrodo de modo que la punta más corta esté en el inserto y la punta más larga toque el fondo del pozo. Mida primero la resistencia en el control en blanco. Para cada inserto, mida TEER por triplicado.
    NOTA: Para enjuagar el electrodo entre las mediciones, se utilizan medios de cultivo. Asegúrese de que el electrodo se mantenga en un ángulo de 90° con respecto a la parte inferior del inserto para obtener lecturas estables.
  7. Calcule la resistencia eléctrica (en Ω · cm 2) a través de la monocapa utilizando la fórmula, TEER = resistencia neta (Ω) x área superficial del inserto del filtro (cm2); Aquí, la resistencia neta es la diferencia entre la resistencia de cada pocillo (medio de crecimiento con células) y el pozo en blanco (solo medio de crecimiento).
  8. Llevar a cabo un tratamiento adicional de las células solo después de que el valor TEER alcance ~ 20 Ω · cm2. Si no se alcanza el nivel TEER deseado, mantenga la placa en la incubadora y mida la TEER al día siguiente.
    NOTA: La confluencia HRMEC también puede validarse mediante el examen morfológico de la forma celular (bajo un microscopio) con la morfología típica de adoquines y / o por la presencia de proteínas de unión celular con tinción inmunohistoquímica por separado.

4. Ensayo de transcitosis

  1. Ensayo de transcitosis in vitro mediado por clatrina utilizando transferrina marcada con Cy3 (Figura 5)
    1. Al alcanzar la confluencia con valores de TEER alrededor de 20 Ω·cm2, el suero priva a las células durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2 utilizando FBS al 0,5% en EBM (medio reducido en suero) en ambas cámaras (cámara apical: 250 μL y cámara basolateral: 750 μL) antes del tratamiento con el ligando. Se utilizó MBE reducida en suero durante todo el ensayo.
    2. Incubar las células (utilizando el medio reducido en suero en el paso 4.1.1.) en la cámara apical con ligando de transferrina (Cy3-Tf) marcado con fluorescencia (cianina 3) (concentración final de 40 μg/ml) durante 60 min a 37 °C.
      NOTA: Las placas que contienen Cy3-Tf deben protegerse de la luz para evitar el fotoblanqueo de Cy3-Tf envolviendo en ellas papel de aluminio y realizando el experimento en una campana de cultivo celular con las luces apagadas.
    3. Después de 1 h, coloque la placa en hielo y lave la monocapa apical y basolateralmente 4x (3-5 min por lavado) con el medio reducido en suero a RT para eliminar el Cy3-Tf libre no unido.
      NOTA: El lavado es esencial para eliminar las moléculas trazadoras libres y permitir una lectura precisa de la transcitosis sin posibles fugas de la ruta paracelular.
    4. Añadir un medio fresco reducido en suero (como en el paso 4.1.1.) a los insertos filtrantes bien lavados que contengan células y transferir los insertos a los pocillos frescos de la placa de 24 pocillos que contenga medio reducido en suero precalentado.
    5. Incubar las células durante otros 90 minutos en la incubadora (37 °C y 5% deCO2), y luego recoger el medio de la cámara basolateral.
    6. Registre la intensidad de fluorescencia de la solución desde la cámara basolateral utilizando un detector de fluorescencia. Los niveles de intensidad de fluorescencia, medidos como unidades fluorescentes relativas (RFU), indican la cantidad de complejo Cy3-Tf transcitado a través de la monocapa HRMEC a través de la transcitosis dependiente de clatrina.
  2. Ensayo de transcitosis in vitro mediado por caveolas utilizando HRP (Figura 6)
    1. Al alcanzar la confluencia completa con valores de TEER alrededor de 20 Ω·cm2, el suero priva a las células durante 24 h a 37 °C y al 5% deCO2 utilizando un medio de MBE que contiene FBS al 0,5% (medio reducido en suero) antes del tratamiento (como en el paso 4.1.1.). Se utilizó medio de MBE reducido en suero durante todo el ensayo.
    2. Tratar las células en la cámara apical con los tratamientos deseados y controles del vehículo.
      NOTA: Aquí, hemos utilizado moduladores Wnt como ejemplo para demostrar la regulación de la transcitosis mediada por caveolas por la vía de señalización Wnt en HRMECs: Norrina recombinante humana e inhibidor de Wnt XAV939. En un experimento típico, las células fueron tratadas durante 24 h en una incubadora (37 °C y 5% deCO2) con las siguientes concentraciones: Norrin (125 ng/mL), Norrin (125 ng/mL) + XAV939 (10 μM), y solución de control del vehículo. Además, también se utilizó medio acondicionado con Wnt3a (producido a partir de células L Wnt-3A).
    3. Incubar las células en la cámara apical con HRP (5 mg/ml) durante 15 min a 37 °C.
    4. Después, coloque la placa de 24 pocillos en hielo y lave las cámaras apical y basolateral intensamente 6x con tampón P (10 mM HEPES pH = 7.4, 1 mM piruvato de sodio, 10 mM glucosa, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) para eliminar el HRP extracelular libre.
      NOTA: El lavado es esencial para eliminar las moléculas trazadoras libres y permitir una lectura precisa de la transcitosis sin posibles fugas de la ruta paracelular.
    5. Añadir un medio fresco reducido en suero (como en el paso 4.1.1.) a la cámara apical y transferir los insertos a un pocillo fresco que contenga medios precalentados.
    6. Incubar la monocapa durante 90 minutos adicionales en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2 antes de recoger el medio de la cámara basolateral.
    7. Al medio recogido, añadir 100 μL de sustrato de peroxidasa fluorogénica HRP (Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante, e incubar a RT durante 10 minutos antes de detener la reacción con 100 μL de solución Stop.
    8. Detecte los niveles de producto de reacción de sustrato HRP en los medios utilizando un lector de placas de fluorescencia. Mida la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 420 nm (con excitación de 325 nm) y como unidades fluorescentes relativas (RFU). Los valores indican el nivel de HRP transcitado a través de la capa HRMEC a través de la transcitosis mediada por caveolas.
      NOTA: El producto fluorescente utilizado aquí (Tabla de materiales) no fotoblanquea. No se necesita protección contra la fotoblanqueo.

Resultados

Las imágenes EM del endotelio vascular retiniano muestran transporte vesicular transcitótico y vesículas caveolistas en células endoteliales in vivo.
La transcitosis EC se puede visualizar in vivo dentro de secciones transversales retinianas con precipitado marrón oscuro que refleja vasos sanguíneos que contienen HRP bajo un microscopio óptico (Figura 3A) y como precipitado denso en electrones indicativo de vesículas transcitóticas que conti...

Discusión

BRB juega un papel esencial en la salud y la enfermedad de la retina. Las técnicas in vitro que evalúan la permeabilidad vascular han demostrado ser herramientas cruciales en los estudios relacionados con el desarrollo y la función de la barrera (BRB/BBB). El procedimiento descrito aquí podría utilizarse para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la transcitosis EC o evaluar los moduladores moleculares relacionados que afectan la permeabilidad del BRB. In vitro Los ensayos de transcitos...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses o intereses financieros que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (R01 EY028100, EY024963 y EY031765) a JC. ZW fue apoyado por una Beca de Iniciación de Carrera de la Fundación del Ojo de los Caballeros Templarios.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Biological Safety Cabinet Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific1286
Cell culture petridish Nest Biotechnology704001
Centrifuge Eppendorf5702
Centrifuge tubes (15 mL)Corning Inc.352097
Centrifuge tubes (50 mL)Denville Scientific Inc.C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin Jackson ImmunoResearchAB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza BioscienceCC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplementsLonza BioscienceCC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)MilliporeMERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)Lonza BioscienceCC-4102B
GelatinSigma-AldrichG7765
Hemocytometer (2-chip)Bulldog BioDHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)Sigma-AldrichP8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)Cell SystemsACBRI 181
IncubatorThermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific3110
L cells (for Control-conditioned medium)ATCCCRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)ATCCCRL-2647
Light microscopeLeicaDMi1
Multimode Plate ReaderEnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)GIBCO10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kitThermo Fisher Scientific15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)R&D Systems3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)R&D Systems293-VE
Syringe filter (0.22 µm)MilliporeSLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)Corning Inc.CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)GIBCO25-200-072
Water bathPrecision, Thermo Fisher Scientific51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)SelleckchemS1180

Referencias

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

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