ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung

Zusammenfassung

ATAC-seq ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die die hyperaktive mutierte Transposase Tn5 verwendet, um Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit abzubilden, die durch Transkriptionsfaktoren vermittelt werden. ATAC-seq ermöglicht die Entdeckung der molekularen Mechanismen, die phänotypischen Veränderungen in Krebszellen zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren für ATAC-seq in Epithelzelltypen, einschließlich Krebszellen.

Zusammenfassung

Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) untersucht die Zugänglichkeit von Desoxyribonukleinsäure (DNA) unter Verwendung der hyperaktiven Tn5-Transposase. Tn5 schneidet und ligiert Adapter für Hochdurchsatzsequenzierung innerhalb zugänglicher Chromatinregionen. In eukaryotischen Zellen wird genomische DNA in Chromatin verpackt, einen Komplex aus DNA, Histone und anderen Proteinen, der als physikalische Barriere für die Transkriptionsmaschinerie wirkt. Als Reaktion auf extrinsische Signale rekrutieren Transkriptionsfaktoren Chromatin-Remodeling-Komplexe, um den Zugang zur Transkriptionsmaschinerie für die Genaktivierung zu ermöglichen. Daher ist die Identifizierung offener Chromatinregionen nützlich, wenn die Aktivitäten von Enhancern und Genpromotoren während biologischer Ereignisse wie dem Fortschreiten von Krebs überwacht werden. Da dieses Protokoll einfach zu bedienen ist und einen geringen Zelleingangsbedarf hat, wurde ATAC-seq weit verbreitet, um offene Chromatinregionen in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Krebszellen, zu definieren. Für eine erfolgreiche Datenerfassung müssen bei der Vorbereitung von ATAC-seq-Bibliotheken mehrere Parameter berücksichtigt werden. Unter ihnen sind die Wahl des Zelllysepuffers, die Titration des Enzyms Tn5 und das Startvolumen der Zellen entscheidend für die Vorbereitung der ATAC-seq-Bibliothek in Krebszellen. Optimierung ist unerlässlich, um qualitativ hochwertige Daten zu generieren. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der ATAC-seq-Optimierungsmethoden für Epithelzelltypen.

Einleitung

Die Zugänglichkeit von Chromatin ist eine Schlüsselvoraussetzung für die Regulation der Genexpression auf einer genomweiten Skala¹. Veränderungen der Chromatinzugänglichkeit sind häufig mit mehreren Krankheitszuständen verbunden, einschließlich Krebs ^2,3,4. Im Laufe der Jahre wurden zahlreiche Techniken entwickelt, die es Forschern ermöglichen, die Chromatinlandschaft zu untersuchen, indem sie Regionen mit Chromatinzugänglichkeit kartieren. Einige von ihnen umfassen DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)⁵, FAIRE-seq (formaldehyd-assisted isolation of regulatory elements)⁶, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)⁷, und der Schwerpunkt dieser Arbeit, ATAC-seq (Assay for transposase-accessible chromatin)⁸. DNase-seq kartiert zugängliche Regionen durch die Verwendung eines Schlüsselmerkmals von DNase, nämlich der bevorzugten Verdauung von nackter DNA, die frei von Histonen und anderen Proteinen wie Transkriptionsfaktoren⁵ ist. FAIRE-seq, ähnlich wie ChIP-seq, nutzt Formaldehydvernetzung und Beschallung, außer dass keine Immunpräzipitation beteiligt ist, und die nukleosomenfreien Regionen werden durch Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert⁶. Die MAPit-Methode verwendet eine GC-Methyltransferase, um die Chromatinstruktur bei Einzelmolekülauflösung⁷ zu untersuchen. ATAC-seq basiert auf der hyperaktiven Transposase Tn5⁸. Die Tn5-Transposase bindet bevorzugt an offene Chromatinbereiche und fügt Sequenzierungsadapter in zugängliche Bereiche ein. Tn5 arbeitet durch einen DNA-vermittelten "Cut and Paste"-Mechanismus, wobei die mit Adaptern vorgeladene Transposase an offene Chromatinstellen bindet, DNA schneidet und die Adapter⁸ ligiert. Tn5-gebundene Regionen werden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern wiederhergestellt, die an diese Adapter angeglüht werden. FAIRE-seq und DNase-seq erfordern eine große Menge an Ausgangsmaterial (~100.000 Zellen bis 225.000 Zellen) und einen separaten Bibliotheksvorbereitungsschritt vor der Sequenzierung⁹. Auf der anderen Seite ist das ATAC-seq-Protokoll relativ einfach und erfordert eine kleine Anzahl von Zellen (<50.000 Zellen)¹⁰. Im Gegensatz zu den FAIRE-seq- und DNase-seq-Techniken ist die Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung von ATAC-seq relativ einfach, da die isolierte DNA-Probe bereits mit den Sequenzierungsadaptern von Tn5 markiert wird. Daher ist nur der PCR-Amplifikationsschritt mit geeigneten Primern erforderlich, um die Bibliotheksvorbereitung abzuschließen, und die vorherigen Verarbeitungsschritte wie Endreparatur und Adapterligatur müssen nicht durchgeführt werden, was Zeit spart¹¹. Zweitens vermeidet ATAC-seq die Notwendigkeit einer Bisulfitumwandlung, Klonierung und Amplifikation mit regionsspezifischen Primern, die für MAPit⁷ erforderlich sind. Aufgrund dieser Vorteile ist ATAC-seq zu einer sehr beliebten Methode zur Definition offener Chromatinregionen geworden. Obwohl die ATAC-seq-Methode einfach ist, erfordern mehrere Schritte eine Optimierung, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Daten zu erhalten. Dieses Manuskript diskutiert Optimierungsverfahren für die Standard-ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung und hebt insbesondere drei Parameter hervor: (1) Lysepufferzusammensetzung, (2) Tn5-Transposase-Konzentration und (3) Zellzahl. Darüber hinaus liefert dieser Artikel Beispieldaten aus den Optimierungsbedingungen unter Verwendung von krebsartigen und nicht-kanzerösen adhärenten Epithelzellen.

Protokoll

1. Vorbereitungen vor Beginn des Experiments

1. Lysepufferlager vorbereiten.
   HINWEIS: Der optimale nukleare Isolationspuffer kann für jeden Zelltyp unterschiedlich sein. Wir empfehlen, sowohl den im Originalpapier⁸ verwendeten hypotonischen Puffer als auch einen CSK-Puffer^12,13 für jeden Zelltyp unter Verwendung von Trypanblau-Färbung zu testen.
   1. Zur Herstellung des hypotonischen Puffers (Greenleaf-Puffer) mischen Sie 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ und 0,1% NP-40.
   2. Zur Herstellung des CSK-Puffers mischen Sie 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 3 mM_MgCl2 und 0,1% Triton X-100.
2. Stellen Sie sicher, dass die Zellkulturbedingungen optimal sind; Untersuchen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass es keine erhöhten Apoptosewerte gibt.
3. Schalten Sie die Zentrifuge ein, damit sie 4 °C erreicht.

2. Zellernte

1. Absaugen von Medien aus einer Zellkultur bei <80% Konfluenz. Zellen werden typischerweise in einer 35 mm oder 60 mm Schale gezüchtet, basierend auf der Anzahl der benötigten Zellen, Behandlungen usw.
2. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml oder 3 ml PBS.
3. Fügen Sie 0,5 ml oder 1 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 2-3 min (abhängig von den Zelltypen). Verwenden Sie vorsichtig eine 1-ml-Pipette, um gut zu mischen.
4. Geben Sie 1 ml oder 2 ml Medien auf die Platte und mischen Sie gut. Transfer in ein 15 ml konisches Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen für 3 min bei 300 x g.
   HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren.
5. Saugen Sie das Medium ab und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml oder 2 ml Medium.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine homogene Einzelzelllösung herzustellen. Für Gewebe kann ein Dounce-Homogenisator verwendet werden, um Gewebe zu homogenisieren und große Zellklumpen oder Aggregate zu minimieren. Einige Gewebe erfordern Filtration (z. B. Zellsiebe) und/oder FACS-Zellsortierung, um lebensfähige Zellen zu isolieren und eine Einzelzelllösung zu erhalten.
6. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Zellzählers.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde ein automatisierter Zellzähler (Table of Materials) verwendet.
7. Zentrifugieren Sie das erforderliche Zellvolumen (z. B. ein Volumen mit 1 x 10⁶ Zellen basierend auf der Zellzahl) bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT).
8. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 x 10⁶ Zellen in 1 ml kaltem PBS.
   HINWEIS: Wenn die Zellzahlen kleiner als 1 x 10 6 Zellen sind, verringern Sie das kalte PBS-Volumen, um die Zelllösung in der gleichen Konzentration (1 x 10⁶ Zellen / ml) herzustellen.

3. Zelllyse

1. 25 μL (= 2,5 x 10⁴ Zellen) in ein neues 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen. 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen
   HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren. Lassen Sie etwa 3 μL Überstand, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht verworfen werden.
2. Fügen Sie 25 μL Lysepuffer hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren auf und ab. 5 min auf Eis inkubieren
3. 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig verwerfen.
   HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren. Lassen Sie etwa 3 μL Überstand, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht verworfen werden.

4. Tn5-Tagmentation

1. Das Pellet wird sofort in 25 μL Tn5-Reaktionsgemisch resuspendiert. Die Tn5-Reaktionsmischung ist wie folgt: 12,5 μL 2x Tagmentations-DNA-Puffer (TD-Puffer), 1,25-5 μL Tn5-Transposase und 11,25-7,5 μL nukleasefreies Wasser.
   HINWEIS: Die Standardkonzentration von Tn5 beträgt 2,5 μL für 2,5 x 10⁴ Zellen.
2. 30 min bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Mischen Sie die Lösung alle 10 Minuten.

5. DNA-Reinigung

HINWEIS: Vor der Verstärkung ist eine Reinigung erforderlich. Die DNA-Aufreinigung erfolgt mit dem MinElute PCR-Reinigungskit (Table of Materials).

1. Fügen Sie 5 μL 3 M Natriumacetat (pH 5,2) hinzu.
2. Sofort 125 μL Buffer PB hinzufügen und gut mischen.
3. Befolgen Sie ab Schritt 2 das Protokoll des PCR-Aufreinigungskits .
   1. Legen Sie die Spin-Säule in ein 2-ml-Sammelröhrchen.
   2. Die Probe auf die Spinsäule auftragen und 1 min bei 17.900 x g RT zentrifugieren.
   3. Verwerfen Sie den Durchfluss, und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Sammelrohr ein.
   4. 750 μL Puffer-PE in die Spin-Säule geben und 1 min bei 17.900 x g RT zentrifugieren.
   5. Verwerfen Sie den Durchfluss, und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Sammelrohr ein.
   6. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule für 5 min, um die Membran vollständig zu trocknen.
   7. Verwerfen Sie den Durchfluss und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   8. Eluieren Sie die DNA-Fragmente mit 10 μL Buffer EB.
   9. Lassen Sie die Säule 1 min bei RT stehen.
   10. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 17.900 x g RT, um die DNA zu eluieren.

6. PCR-Amplifikation

HINWEIS: Die PCR-Amplifikation transponierter (markierter) DNA ist für die Sequenzierung notwendig. In diesem Beispiel wurden Nextera-Kit-Adapter (Table of Materials) verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Die folgende PCR-Reaktion in 200 μL PCR-Röhrchen (50 μL für jede Probe) einrichten. Die PCR-Reaktionsmischung ist wie folgt: 10 μL eluierte DNA (Schritt 5.), 2,5 μL 25 mM Adapter 1, 2,5 μL 25 mM Adapter 2, 25 μL 2x PCR-Mastermix und 10 μL nukleasefreies Wasser
2. Führen Sie das PCR-Amplifikationsprogramm Teil 1 durch (Tabelle 2).
   HINWEIS: Für die anfängliche Amplifikation werden für alle Proben mit einem Standard-Thermocycler die gleichen Bedingungen verwendet.
3. Real-time qPCR (insgesamt 14,5 μL pro Probe)
   1. Richten Sie unter Verwendung von 5 μL des Produkts aus der PCR-Amplifikation Teil 1 (Schritt 6.2) die folgende Reaktion ein, diesmal einschließlich SYBR-Gold und Nachweis in einer Echtzeit-PCR-Maschine.
   2. Das PCR-Reaktionsgemisch wird wie folgt hergestellt: 5 μL PCR-Produkt aus Schritt 6.2., 0,75 μL SYBR-Gold (1000x verdünnt), 5 μL 2x PCR-Mastermix und 3,75 μL nukleasefreies Wasser.
      HINWEIS: Die genauen Zykluszahlen für die Bibliotheksamplifikation vor Erreichen der Sättigung für jede Probe werden durch qPCR bestimmt (Tabelle 3), um den GC- und Größenbias in PCR¹⁰ zu reduzieren. SYBR Gold wurde mit nukleasefreiem Wasser verdünnt. Zur Herstellung der verdünnten Lösung wurde 1 μL SYBR Gold (Stammkonzentration 10.000x) zu 999 μL nukleasefreiem Wasser gegeben. Die in Tabelle 3 erwähnte Laufzeit der RT-qPCR beträgt ca. 60 min.
4. Ermitteln Sie die erforderliche Anzahl zusätzlicher PCR-Zyklen anhand der Laufparameter aus Schritt 6.3.
   1. Anzahl der Zyklen = 1/4 maximale (gesättigte) Fluoreszenzintensität (typischerweise 3 oder 4 PCR-Zyklen)
5. PCR-Amplifikationsprogramm Teil 2 (Volumen = 45 μL; Tabelle 4): Sobald Sie die Zyklusnummer ermittelt haben, richten Sie PCRs mit zusätzlichen Zyklen ein, die in Schritt 6.4.1 berechnet werden. Wenn die berechnete Zykluszahl beispielsweise 3 ist, richten Sie im folgenden Programm 3 Zyklen ein. Die Gesamtzyklen wären 8 (5 in Schritt 6.2., plus 3 zusätzliche Zyklen in Schritt 6.5).

7. Reinigung von Perlen

HINWEIS: Hier wurden AMPure XP (Table of Materials) Perlen verwendet.

1. Zu den im vorherigen Schritt amplifizierten PCR-Produkten werden 150 μL Perlen bei RT hinzugefügt.
   HINWEIS: Hausgemachte AMPure-Perlen¹⁴ können in diesem Prozess verwendet werden.
2. Inkubieren Sie für 15 min bei RT.
3. Legen Sie die Röhrchen für 5 min auf einen Magnetständer.
4. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
5. Waschen Sie die Perlen mit 200 μL 80% Ethanol.
   HINWEIS: 80% Ethanol sollte frisch zubereitet werden.
6. Wiederholen Sie Schritt 7.4.
7. Entfernen Sie das Ethanol vollständig.
8. Trocknen Sie die Proben 10 min an der Luft bei RT.
9. Resuspendieren mit 50 μL Elutionspuffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
10. Wiederholen Sie die Perlenreinigung (Schritte 7.1.-7.9.), um die Verunreinigung des Primers weiter zu minimieren.

8. DNA-Konzentration und Qualitätskontrolle

1. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Nukleinsäure-Quantifizierungskit (Table of Materials).
2. Überprüfen Sie die amplifizierten DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese mit SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% Agarosegel) oder einem automatisierten Elektrophoresesystem (z.B. TapeStation, Bioanalyzer).

9. Sequenzierung

1. Durchführung einer Hochdurchsatzsequenzierung unter Verwendung der amplifizierten DNA-Proben^12,13.
   HINWEIS: Amplifizierte DNA-Proben sind bereit für die Hochdurchsatzsequenzierung. Um nukleosomale DNA-Fragmentinformationen zu erhalten, wird die Paar-End-Sequenzierung gegenüber der Single-End-Sequenzierung empfohlen. Beide Enden der DNA-Fragmente zeigen an, wo die Transposase bindet. Für die Kartierung offener Chromatinbereiche sind in der Regel 30 Millionen Lesevorgänge/Probe ausreichend.

10. Datenanalyse

1. Datenfilterung basierend auf der Qualität von Basisanrufen: Legen Sie den minimalen durchschnittlichen Basisqualitätsfaktor auf 20 fest (Genauigkeit von 99 %).
2. Adapterzuschnitt: Entfernen Sie die Adaptersequenzen mit einem geeigneten Werkzeug.
   HINWEIS: Das Wrapper-Werkzeug "Galore trimmen" (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) wurde verwendet, um Adaptersequenzen zu entfernen. Für ATAC-seq-Bibliotheken, die von Illumina Tn5 vorbereitet wurden, wird die folgende Sequenz als Adaptersequenz verwendet: CTGTCTCTTATACACATCT. Die minimale Sequenzlänge zur Erkennung von Adapterverunreinigungen ist auf 5 festgelegt.
3. Genomkartierung: Ordnen Sie die Messwerte dem entsprechenden Genom mit Bowtie unter Verwendung der folgenden Parameter "-I 0 -X 2000 -m 1"¹⁵ zu. Ein Beispiel für die Kartierungsqualität von MDA-MB-231 basalen Brustkrebszellen ist unten:
   Lesevorgänge mit mindestens einer gemeldeten Ausrichtung: 52,79 %
   Lesevorgänge, die nicht ausgerichtet werden konnten: 13,10 %
   Lesevorgänge mit unterdrückten Ausrichtungen aufgrund von -m: 34,11 %
4. Deduplizierung: Markieren Sie die PCR-Duplikate mit Picard-Tools¹⁶.
5. Generieren einer Genomabdeckungsdatei für die Datenvisualisierung: Konvertieren Sie die deduplizierten Paired-End-Lesevorgänge in Single-End-Lesefragmente. Genomabdeckungsspuren werden mit genomeCoverageBed von Bettwerkzeugen¹⁷ erhalten.

Ergebnisse

Um erfolgreiche und qualitativ hochwertige ATAC-seq-Daten zu erhalten, ist es wichtig, die experimentellen Bedingungen zu optimieren. Die ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung kann in die fünf Hauptschritte unterteilt werden (Abbildung 1), nämlich Zelllyse, Tagmentation (Fragmentierung und Adapterinsertion durch Tn5), genomische DNA-Aufreinigung, PCR-Amplifikation und Datenanalyse. Als ersten Prozess muss zunächst der Zelllysepuffer (Kernisolierung) für jeden Zelltyp optimiert werden. Zur Lys...

Diskussion

ATAC-seq wurde häufig für die Kartierung offener und aktiver Chromatinregionen verwendet. Die Progression von Krebszellen wird häufig durch genetische Veränderungen und epigenetische Reprogrammierung vorangetrieben, was zu einer veränderten Chromatinzugänglichkeit und Genexpression führt. Ein Beispiel für diese Reprogrammierung ist während des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs (EMT) und seines umgekehrten Prozesses, des mesenchymalen zu epithelialen Übergangs (MET), die als wichtige zelluläre Reprogramm...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500	Natural
10 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-3810	Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tips	USA Scientific	1182-1830	Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-1840	Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352096
20 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1183-1810	Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1180-8810	Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge Tubes	Fisherbrand	06-443-19
Agarose	ThermoFisher Scientific	YBP136010	Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCC	ATCC
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman Coulter	364658	SX2415
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	Bead purification kit
CellDrop Cell Counter	DeNovix	CellDrop FL	Cell counter
EDTA	MilliporeSigma	EDS	BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTA	MilliporeSigma	E3889
Ethanol 100%	ThermoFisher Scientific	AC615100020	Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET Tested	R&D Systems	S10350	Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1x	ThermoFisher Scientific	11965092	[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1x	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1x	ThermoFisher Scientific	25200056	(0.25%), phenol red
Glycerol	IBI Scientific	56-81-5
Glycine	MilliporeSigma	G8898
HCl	MilliporeSigma	H1758
HEPES	MilliporeSigma	H3375
Invitrogen Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q32857
MgCl2	MilliporeSigma	M3634
MinElute PCR Purification kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
NaCl	IBI Scientific	7647-14-5
NaOH	MilliporeSigma	S8045	BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541
Nextera DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-121-1030	2x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)	MilliporeSigma	I8896	for molecular biology
PCR Detection System	BioRad	1855484	CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPES	MilliporeSigma	P1851	BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kit	ThermoFisher Scientific	Q32854	Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay Tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856	Invitrogen
SDS	MilliporeSigma	L3771
Sodium Acetate	Homemade	-	pH 5.2
Sucrose	IBI Scientific	57-50-1
SYBR Gold	ThermoFisher Scientific	S11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mL	BioRad	1708882
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips	USA Scientific	1402-4700	Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATE	USA Scientific	1438-4700	Single notch. Natural polypropylene
Tris Base	MilliporeSigma	648311	ULTROL Grade
Triton x-100	IBI Scientific	9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit	Illumina	PE-121-1003	paired-end
Trypan Blue Stain	ThermoFisher Scientific	Q32851
Tween-20	MilliporeSigma	P7949	BioXtra, viscous liquid
Water	MilliporeSigma	W3500	sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture