JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة طريقتين سريعتين وفعالتين لجمع الحيوانات المنوية من نموذج ميداكا الأسماك الصغيرة (Oryzias latipes) ، بالإضافة إلى بروتوكول لتقييم جودة الحيوانات المنوية بشكل موثوق باستخدام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA).

Abstract

ميداكا اليابانية (Oryzias latipes) هي سمكة teleost ونموذج فقاري ناشئ لأبحاث السموم البيئية والتنموية والوراثية وعلم وظائف الأعضاء. يستخدم Medaka أيضا على نطاق واسع للتحقيق في تكاثر الفقاريات ، وهي وظيفة بيولوجية أساسية لأنها تسمح للأنواع بالاستمرار. جودة الحيوانات المنوية هي مؤشر مهم على خصوبة الذكور ، وبالتالي نجاح التكاثر. تقنيات استخراج الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية موثقة جيدا للعديد من الأنواع ، بما في ذلك أسماك teleost. يعد جمع الحيوانات المنوية أمرا بسيطا نسبيا في الأسماك الكبيرة ولكن يمكن أن يكون أكثر تعقيدا في الأسماك النموذجية الصغيرة لأنها تنتج منوية أقل وأكثر حساسية. لذلك ، تصف هذه المقالة طريقتين لجمع الحيوانات المنوية في الأسماك النموذجية الصغيرة ، medaka اليابانية: تشريح الخصيتين وتدليك البطن. توضح هذه الورقة أن كلا النهجين ممكنان ل medaka وتظهر أنه يمكن إجراء تدليك البطن عدة مرات بشكل متكرر حيث تتعافى الأسماك بسرعة من الإجراء. توضح هذه المقالة أيضا بروتوكولا لتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في medaka لتقييم موضوعي للعديد من المؤشرات المهمة لجودة الحيوانات المنوية في medaka (الحركة ، التقدمية ، مدة الحركة ، التركيز النسبي). هذه الإجراءات ، المحددة لهذا النموذج الصغير المفيد ، ستعزز بشكل كبير فهم العوامل البيئية والفسيولوجية والوراثية التي تؤثر على الخصوبة لدى ذكور الفقاريات.

Introduction

medaka اليابانية هي سمكة صغيرة تضع البيض في المياه العذبة موطنها شرق آسيا. أصبح Medaka نظاما نموذجيا ممتازا للفقاريات لعلم السموم البيئية ، وعلم الوراثة التنموي ، وعلم الجينوم ، ودراسات علم الأحياء وعلم وظائف الأعضاءالتطوري 1,2. على غرار الزرد الشعبي ، فهي سهلة التكاثر نسبيا ومقاومة للغاية للعديد من أمراض الأسماك الشائعة 1,2. هناك العديد من المزايا لاستخدام medaka كنموذج ، بما في ذلك وقت جيل قصير ، وأجنة شفافة1،2 ، وجينوممتسلسل 3. على عكس الزرد ، يحتوي medaka على جين يحدد الجنس 4 بالإضافة إلى درجة حرارة عالية (من4-40 درجة مئوية) وتحمل الملوحة (أنواع euryhaline)5. أيضا ، تم تطوير العديد من الأدوات الوراثية والتشريحية ، بالإضافة إلى البروتوكولات6،7،8،9،10،11،12 ، في ميداكا لتسهيل دراسة بيولوجيتها.

التكاثر هو وظيفة فسيولوجية أساسية لأنه يسمح للنوع بالاستمرار. يتطلب تكاثر الفقاريات عددا لا يحصى من الأحداث المنسقة بدقة ، بما في ذلك إنتاج البويضات في الإناث وإنتاج الحيوانات المنوية في الذكور. الحيوانات المنوية هي خلايا فريدة من نوعها ، يتم إنتاجها من خلال عملية معقدة لتكوين الحيوانات المنوية ، حيث يوجد عدد من نقاط التفتيش لضمان تسليم منتج عالي الجودة13. أصبحت جودة الأمشاج محط تركيز في دراسات تربية الأحياء المائية وأعداد الأسماك نظرا لتأثيرها على نجاح الإخصاب وبقاء اليرقات. وبالتالي ، فإن جودة الحيوانات المنوية هي مؤشر مهم لخصوبة الذكور في الفقاريات.

ثلاثة عوامل مفيدة لتقييم جودة الحيوانات المنوية للأسماك هي الحركة والتقدمية وطول العمر. تعد النسبة المئوية للحركة والحركة التقدمية من المؤشرات الشائعة لجودة الحيوانات المنوية حيث أن الحركة التقدمية ضرورية وترتبط ارتباطا وثيقا بنجاح الإخصاب14,15. تعد مدة الحركة أيضا مؤشرا مهما في الأسماك حيث تظل الحيوانات المنوية متحركة بالكامل لمدة تقل عن 2 دقيقة في معظم أنواع teleost ويكون مسار الحيوانات المنوية بشكل عام أقل خطية من الثدييات15. ومع ذلك ، اعتمدت العديد من الدراسات التي تقيم حركة الحيوانات المنوية في الماضي على طرق ذاتية أو شبه كمية لتحليل الحيوانات المنوية15,16. على سبيل المثال ، تم تقدير حركة الحيوانات المنوية في medaka في الماضي بصريا تحت المجهر17. كما تم تقديره من خلال تسجيل حركة الحيوانات المنوية واستخدام برامج التصوير لدمج الإطارات وقياس مسار السباحة وسرعتها18،19،20. غالبا ما تفتقر هذه الأساليب إلى المتانة ، حيث تقدم نتائج مختلفة وفقا للشخص الذي يقوم بإجراء التحليل15,21.

تم تطوير تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA) في البداية للثدييات. CASA هي طريقة كمية سريعة لتقييم جودة الحيوانات المنوية عن طريق تسجيل وقياس السرعة والمسار بطريقة آلية15. في الأسماك ، تم استخدامه في أنواع مختلفة لرصد آثار العديد من ملوثات المياه على جودة الحيوانات المنوية ، لتحديد السلف المثيرة للاهتمام لتحسين الأمهات ، لتحسين كفاءة الحفظ بالتبريد والتخزين ، وتحسين ظروف الإخصاب15. لذلك ، فهي أداة قوية لتقييم جودة الحيوانات المنوية بشكل موثوق في أنواع الفقاريات المختلفة. ومع ذلك ، نظرا للتنوع المهم في استراتيجيات التكاثر بين الأسماك ، فإن الحيوانات المنوية لأسماك teleost تختلف عن تلك الموجودة في الثدييات ومن نوع سمكي إلى آخر. تحتوي أسماك Teleost ، التي تخصب البيض خارجيا بشكل أساسي عن طريق إطلاق الأمشاج في الماء ، على منوية عالية التركيز بسيطة نسبيا في التركيب بدون جسيم ، على عكس الثدييات ، التي تخصب داخليا وبالتالي لا يتعين عليها تعويض التخفيف في الماء ، ولكن عليها تحمل المزيد من السوائل اللزجة14. بالإضافة إلى ذلك ، تتحرك الحيوانات المنوية من معظم الأسماك بسرعة ولكنها متحركة بالكامل لمدة تقل عن دقيقتين بعد التنشيط ، على الرغم من وجود العديد من الاستثناءات15,22. نظرا لأن الحركة يمكن أن تنخفض بسرعة في معظم الأسماك ، يجب توخي الحذر الشديد مع توقيت التحليل بعد التنشيط عند تحديد بروتوكول تحليل الحيوانات المنوية للأسماك.

التكاثر هو أحد المجالات في علم الأحياء التي تم فيها استخدام teleosts و medaka على نطاق واسع ككائنات نموذجية. في الواقع ، يظهر ذكور medaka سلوكيات إنجابية واجتماعية مثيرة للاهتمام ، مثل حراسة الشريك23,24. بالإضافة إلى ذلك ، توجد العديد من الخطوط المعدلة وراثيا لدراسة التحكم في الغدد الصم العصبية للتكاثر في هذا النوع25،26،27. يمكن أن يكون أخذ عينات من الحيوانات المنوية ، وهو إجراء بسيط نسبيا في الأسماك الكبيرة ، أكثر تعقيدا في الأسماك النموذجية الصغيرة لأنها تنتج منوية أقل وأكثر حساسية. لهذا السبب ، فإن معظم الدراسات التي تنطوي على أخذ عينات من الحيوانات المنوية في medaka استخراج milt (السائل المنوي للأسماك) عن طريق سحق الخصيتين تشريح17،28،29،30. تستخدم بعض الدراسات أيضا تدليكا معدلا للبطن للتعبير عن الذوبان مباشرة في الوسط المنشط18،19،20 ؛ ومع ذلك ، مع هذه الطريقة ، من الصعب تصور كمية ولون الذوبان المستخرج. في الزرد ، يستخدم تدليك البطن بشكل شائع للتعبير عن الميل ، والذي يتم جمعه على الفور في أنبوب شعري31،32،33. تتيح هذه الطريقة تقدير حجم الذوبان ، وكذلك مراقبة لون القذف ، وهو مؤشر سريع وبسيط لجودة الحيوانات المنوية32,33. لذلك ، لا يوجد بروتوكول واضح وموضح جيدا لجمع الحيوانات المنوية وتحليلها في medaka.

لذلك توضح هذه المقالة طريقتين لجمع الحيوانات المنوية في نموذج صغير للأسماك اليابانية medaka: تشريح الخصيتين وتدليك البطن بأنابيب شعرية. يوضح أن كلا النهجين ممكنان ل medaka ويظهر أنه يمكن إجراء تدليك البطن عدة مرات متكررة حيث تتعافى الأسماك بسرعة من الإجراء. كما يصف بروتوكولا لتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في ميداكا لقياس العديد من المؤشرات المهمة لجودة الحيوانات المنوية في ميداكا (الحركة ، والتقدم ، وطول العمر ، والتركيز النسبي للحيوانات المنوية). هذه الإجراءات ، المحددة لهذا النموذج الصغير المفيد ، ستعزز بشكل كبير فهم العوامل البيئية والفسيولوجية والوراثية التي تؤثر على الخصوبة لدى ذكور الفقاريات.

Protocol

أجريت جميع التجارب والتعامل مع الحيوانات وفقا للتوصيات المتعلقة برعاية التجارب في الجامعة النرويجية لعلوم الحياة (NMBU). أجريت التجارب باستخدام الذكور البالغين (6-9 أشهر) medaka اليابانية (سلالة Hd-rR) التي أثيرت في NMBU (Ås ، النرويج). كما تم اختبار الطرق لفترة وجيزة على ذكور الميداكا اليابانية البالغة من العمر 9 أشهر (سلالة CAB) التي أثيرت في المعهد الوطني لبحوث الزراعة والأغذية والبيئة (INRAE ، رين ، فرنسا).

1. إعداد الصك والحل

  1. تحضير محلول مخزون مخدر (0.6٪ تريكايين).
    1. تمييع 0.6 غرام من Tricaine (MS-222) في 100 مل من 10x الفوسفات العازلة المالحة (PBS).
    2. يقسم 2 مل من محلول مخزون التخدير في 50 أنبوب بلاستيكي سعة 2 مل ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى يتم استخدامه للتخدير أو القتل الرحيم.
  2. تحضير ماء الاسترداد (محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪).
    1. أضف 27 جم من كلوريد الصوديوم إلى 3 لتر من ماء الحوض.
    2. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى الاستخدام.
  3. اضبط وسيط التنشيط إذا لزم الأمر (محلول الملح المتوازن من هانك [HBSS]).
    ملاحظة: يمكن شراء HBSS تجاريا أو صنعه في المختبر (جدول المواد).
    1. قم بقياس الرقم الهيدروجيني ل HBSS باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. اضبط الرقم الهيدروجيني إذا لزم الأمر ، باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم ، وبالتالي فإن الرقم الهيدروجيني النهائي هو 7.1-7.3.
    2. قم بقياس أسمولية HBSS باستخدام مقياس الأسمومتر لإعداد التقارير المستقبلية.
      ملاحظة: النطاق على المنتج التجاري هو 266-294 mOsmol / kg. في الدراسة الحالية ، كانت الأسمولية 287 mOsmol / kg. يمكن تخفيفه بالماء المقطر لتقليل الأسمولية إذا رغبت في ذلك ، ولكن هذا ليس ضروريا حيث لا يوجد فرق كبير في تنشيط الحيوانات المنوية medaka في 150-300 mOsmol / kg HBSS.
    3. قم بتخزين المحلول في RT حتى الاستخدام.
  4. تحضير الاسفنجة عقد.
    1. قطع اسفنجة ناعمة لتناسب بشكل مريح في طبق بتري.
    2. قطع خط مستقيم في منتصف الإسفنجة يكون طويلا بما يكفي لاستقبال الأسماك (3-4 سم) وعمقها حوالي 1 سم (الشكل 1 أ). هذا الشق في الإسفنجة سيثبت الجانب البطني للسمكة لأعلى لفضح العباءة.

2. جمع الحيوانات المنوية

ملاحظة: يمكن جمع الحيوانات المنوية بطريقتين مختلفتين: تدليك البطن أو تشريح الخصيتين.

  1. جمع الحيوانات المنوية عن طريق تدليك البطن
    1. تحضير محلول مخدر بنسبة 0.03٪ عن طريق تخفيف أنبوب واحد من مخزون Tricaine (0.6٪) في 38 مل من ماء الحوض في وعاء زجاجي سعة 100 مل.
    2. قم بإعداد الأدوات ، بما في ذلك الملقط الأملس ذو النهاية الحادة ومجموعة ماصة زجاجية معايرة سعة 10 ميكرولتر ومجموعة أنبوب شفاط (الشكل 1 أ). بلل الإسفنجة المعدة في الخطوة 1.4 بمحلول التخدير.
    3. تحضير الأنابيب مع 36 ميكرولتر من محلول التنشيط للتحليل الفوري. سخن محلول التنشيط في حمام مائي أو حاضنة مضبوطة على 27 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
      ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن تحليل العينات من الأسماك الفردية ، إلا أنه يمكن تقليل التباين الفردي عن طريق تجميع عينات من عدة ذكور في نفس محلول التنشيط. عند تجميع عينات من أسماك متعددة ، استخدم 36 ميكرولتر من محلول التنشيط لكل سمكة. قد يحتاج هذا التخفيف إلى التعديل اعتمادا على الإجهاد أو ظروف تربية medaka المستخدمة لأن هذه العوامل يمكن أن تؤثر على تركيز الحيوانات المنوية وحجمها. سيشير برنامج CASA إلى ما إذا كان التركيز مرتفعا جدا لتحديد الحيوانات المنوية.
    4. تخدير الأسماك عن طريق وضعها في محلول مخدر لمدة 30-90 ثانية.
      ملاحظة: يجب تكييف مدة التخدير لأنها تختلف حسب حجم السمكة. للتأكد من تخدير الأسماك بالكامل ، قم بقرص السويقة الذيلية برفق بالملقط. إذا لم تتفاعل الأسماك ، يمكن بدء التدليك.
    5. أخرج السمك من محلول التخدير واستخدم منشفة ورقية أو امسحها برفق لتجفيف بطن السمكة. ضع السمكة في حوض الإسفنج الرطب الذي يمسك الجانب البطني لأعلى بحيث تتعرض خياشيمها لمحلول التخدير في الإسفنجة (الشكل 1 ب).
    6. إذا كانت المنطقة المحيطة بالعباءة مبللة ، جفف الجانب السفلي من السمكة برفق بمسح منديل يمكن التخلص منه.
    7. ضع السمكة في الإسفنجة القابضة تحت مجهر تشريح وضع الماصة الدقيقة مع أنبوب شفاط متصل بعباءة السمكة (الشكل 1 ج).
    8. قم بتدليك بطن السمكة عن طريق الضغط برفق باستخدام ملقط ناعم ذو نهاية حادة في حركة منضدية إلى ذيلية أثناء المص في نفس الوقت لجمع الذوبان المطرود في الماصة (الشكل 1 د).
    9. حرر السمك من الإسفنج في ماء الاسترداد. اسمح لهم بالتعافي في المحلول لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل إعادتهم إلى نظام الحوض.
    10. انقل الذوبان إلى أنبوب مجهز بمحلول تنشيط مسخن مسبقا وماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات عن طريق المص والنفخ على مجموعة أنبوب الشفاط.
    11. قم بتجانس الحيوانات المنوية المخففة برفق عن طريق تحريك الأنابيب قبل التحليل.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بتحليل العينات على الفور (على سبيل المثال، 5 ثوان) بعد التنشيط. في medaka ، قد يتأخر التحليل ، إذا لزم الأمر ، حيث تظل الحيوانات المنوية متحركة لعدة ساعات ، ولكن يجب أن يظل الوقت ثابتا بين العينات حيث تقل الحركة بمرور الوقت.
  2. جمع الحيوانات المنوية عن طريق تشريح الخصيتين
    1. تحضير محلول القتل الرحيم بنسبة 0.08٪ عن طريق تخفيف أنبوبين من مخزون Tricaine (0.6٪) في 26 مل من ماء الحوض في وعاء زجاجي سعة 100 مل.
    2. قم بإعداد أدوات التشريح ، بما في ذلك الملقط الحاد والناعم ومقص التشريح الصغير (الشكل 1E).
    3. قم بإعداد أنبوب لكل عينة مع 120 ميكرولتر من محلول التنشيط للتحليل الفوري. سخن محلول التنشيط في حمام مائي أو حاضنة مضبوطة على 27 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
      ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن تحليل العينات من الأسماك الفردية ، إلا أنه يمكن تقليل التباين الفردي عن طريق تجميع عينات من عدة ذكور في نفس محلول التنشيط. لتجميع العينات من أسماك متعددة ، استخدم 120 ميكرولتر من محلول التنشيط لكل سمكة. قد يحتاج هذا التخفيف إلى التعديل اعتمادا على الإجهاد أو ظروف تربية medaka المستخدمة لأن هذه العوامل يمكن أن تؤثر على تركيز الحيوانات المنوية وحجمها. سيشير برنامج CASA إلى ما إذا كان التركيز مرتفعا جدا لتحديد الحيوانات المنوية.
    4. القتل الرحيم للأسماك عن طريق وضعها في محلول مخدر 0.08 ٪ لمدة 30-90 ثانية.
      ملاحظة: المدة تعتمد على حجم السمكة. للتأكد من أن الأسماك يتم القتل الرحيم ، انتظر حتى تتوقف حركات operculum. يجب ألا تتفاعل الأسماك مع لمسة الملقط.
    5. أخرج السمك من محلول القتل الرحيم وجفف السمك برفق بمنشفة ورقية أو امسحه برفق.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، يمكن وزن الأسماك لحساب مؤشر الغدد التناسلية لاحقا (GSI ، وزن الغدد التناسلية / وزن الجسم).
    6. ضع السمكة تحت مجهر تشريح بحيث يكون جانبها الجانبي الأيسر متجها لأعلى (الشكل 1F).
    7. باستخدام مقص تشريح صغير ، قم بقطع رفرف ظهريا من العباءة ، ثم عبر الأضلاع إلى الخياشيم لفضح الأعضاء الداخلية (الشكل 1G).
    8. حدد موقع الخصيتين ، واقطع المرفق من كلا الطرفين بالملقط الدقيق ، وقم بإزالة الخصيتين (الشكل 1H).
      ملاحظة: لحساب GSI ، يمكن وزن الخصيتين في هذه الخطوة. العمل بسرعة لتجنب تجفيف الأنسجة.
    9. انقل الخصيتين إلى أنبوب معد بمحلول التنشيط المسخن مسبقا.
    10. استخدم الملقط لسحق الخصيتين عدة مرات على جانب الأنبوب لإطلاق الحيوانات المنوية. يمكن عادة تصور إطلاق الحيوانات المنوية وسيجعل المحلول غائما قليلا.
    11. قم بتجانس الحيوانات المنوية المخففة برفق عن طريق تحريك الأنابيب قبل التحليل.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بتحليل العينات على الفور (على سبيل المثال، 5 ثوان) بعد التنشيط. في medaka ، قد يتأخر التحليل ، إذا لزم الأمر ، حيث تظل الحيوانات المنوية متحركة لعدة ساعات ، ولكن يجب أن يظل الوقت ثابتا بين العينات حيث تقل الحركة بمرور الوقت.

figure-protocol-7537
الشكل 1: جمع Milt عن طريق تدليك البطن (A-D) وتشريح الخصيتين (E-H). (أ) أدوات لتدليك البطن: إمساك الإسفنج ، والملقط الناعم الحاد ، و 10 ميكرولتر من الزجاج القابل للضبط micropipette مع مجموعة أنبوب الشافطة ؛ (ب) وضع الأسماك في الإسفنجة القابضة ، مع تعرض الخياشيم للتخدير في الإسفنجة والعباءة متجهة لأعلى ؛ (ج) وضع ملقط أملس غير حاد على البطن وميكروبيت ضد عباءة ؛ (د) يذوب في ميكروبيبيت بعد التدليك اللطيف والمص. (ه) أدوات تشريح الخصيتين: ملقط غير حاد، ملقط دقيق، ومقص تشريح صغير؛ (و) موضع الأسماك لتشريح الخصيتين؛ (ز) الرؤية الجانبية للأعضاء الداخلية؛ (ح) إزالة الخصيتين عن طريق قطع الملحق من كلا الطرفين بالملقط الدقيق. شريط المقياس: 2 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تحليل الحيوانات المنوية مع نظام CASA

  1. يجب إعداد نظام CASA (SCA Evolution) وفقا للدليل باستخدام مجهر باستخدام مرشح أخضر وهدف 10x مع تباين الطور.
  2. قم بإعداد شرائح غرفة العد التي يمكن التخلص منها 20 ميكرومتر عن طريق التسخين المسبق على لوحة تسخين أو في حاضنة مضبوطة على 27 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
  3. افتح برنامج تحليل الحيوانات المنوية وحدد وحدة الحركة.
  4. اضبط تكوين medaka كما هو موضح في الشكل 2B.
  5. ضع شريحة غرفة عد يمكن التخلص منها مسبقا 20 ميكرومتر تحت المجهر على مرحلة ساخنة مضبوطة على 27 درجة مئوية.
  6. ماصة العينة في الحجرة على الشريحة حتى تملأ الغرفة دون ملء زائد. امسح العينات الزائدة بعناية من مدخل الغرفة بطرف قطني أو امسحها برفق لمنع الخلايا العائمة.
  7. حدد تحليل لإلقاء نظرة على العينة تحت المجهر.
    ملاحظة: إذا كان رمز المجهر أحمر ، فيجب ضبط إضاءة المجهر حتى يتمكن البرنامج من تتبع الحيوانات المنوية بدقة. اضبط سطوع المجهر ، بحيث تظهر حركة ذيل الحيوانات المنوية بوضوح. يجب أن يكون الرمز أزرق.
  8. تأكد من تركيز المجهر وحدد تحليل مرة أخرى لتسجيل الحيوانات المنوية في الحقل. حرك الشريحة بحيث تكون منطقة جديدة من العينة في الإطار وكرر لالتقاط 3-5 مجالات عرض مختلفة. تجنب الحقول التي تحتوي على فقاعات هواء أو كتل خلايا أو قطع أثرية.
  9. حدد النتائج لعرض النتائج .
    ملاحظة: إذا كانت الحقول الموجودة في صفحة النتائج محددة باللون الأحمر، فاتبع مطالبات النظام بحذف الحقول التي تختلف كثيرا في التركيز أو الحركة.
  10. انقر نقرا مزدوجا فوق حقل لعرض نتائج الحقل الفردي أو للتحقق يدويا من أي منوية تم تسميتها بشكل خاطئ أو غير متعقبة. انقر بزر الماوس الأيمن على الحيوانات المنوية الفردية لإعادة تسمية الحركة ، إذا لزم الأمر (الشكل 2 أ).

figure-protocol-10439
الشكل 2: لقطة شاشة لبرنامج SCA Evolution . (أ) نتائج تتبع الحيوانات المنوية لحقل واحد. عرض البيانات الميدانية على الجانب الأيمن والنقر نقرا مزدوجا فوق الحيوانات المنوية لعرض البيانات الفردية ؛ (ب) ملخص النتائج لجميع الحقول مع فتح قائمة التكوين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

نوع البيانات التي تم الحصول عليها
يوفر تحليل حركة الحيوانات المنوية من برنامج SCA Evolution بيانات عن الحركة (النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة وغير المتحركة) ، بالإضافة إلى التقدمية (النسبة المئوية للحيوانات المنوية التقدمية وغير التقدمية) ، والسرعة (النسبة المئوية للحيوا?...

Discussion

الأسمولية هي عامل مهم في تنشيط الحيوانات المنوية للأسماك36,37. بشكل عام ، تكون الحيوانات المنوية غير متحركة في الخصيتين وتصبح متحركة في الوسائط التي تكون مفرطة التناضح بالنسبة للسائل المنوي للأسماك البحرية ، وناقصة التناضح بالنسبة للسائل المنوي لأسماك المي...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل الجامعة النرويجية لعلوم الحياة وبرنامج فولبرايت الأمريكي. يود المؤلفون أن يشكروا أنتوني بلتيير ولورد كاريون جي تان في NMBU على صيانة مرافق الأسماك وغيوم جورميلين من ISC LPGP في INRAE (فرنسا) لتوفير الأسماك ومساحة المختبر لمزيد من اختبار هذه الأساليب.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubesAxygenMCT-150-CAny standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assemblyDrummond2-000-010
10x objective with phase contrastNikonMRP90100
2 mL tubesAxygenMCT-200-c-sAny standard brand can be used
Blunt forcepsFine Science Tools11000-12
Blunt smooth forcepsMilliporeXX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slideMicroptic20.2.25 Leja 2 chamber slides
Dissecting microscopeOlympusSZX7Any standard brand can be used
Fine forcepsFine Science Tools11253-20
HBSSSigmaaldrichH8264-1L
Holding spongeself-made
Inverted microscopeNikonEclipse Ts2R
SCA EvolutionMicroptic
Small dissecting scissorsFine Science Tools14090-09
Sodium Chloride (NaCl)SigmaaldrichS9888
Tabletop vortexLabnetC1301B
TricaineSigmaaldrichA5040

References

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -. A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
  11. Wiley-Blackwell. . Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

188

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved