מודל עכברי של אינטובציה אורוטרכאלית וניתוח איסכמיה ריאה מונשמת

Summary

מודל ניתוחי בעכבר ליצירת פגיעה באיסכמיה של הריאה השמאלית (IR) תוך שמירה על אוורור והימנעות מהיפוקסיה.

Abstract

פגיעה באיסכמיה רפרפוזיה (IR) נובעת לעתים קרובות מתהליכים הכוללים תקופה חולפת של הפסקת זרימת הדם. בריאה, IR מבודד מאפשר את המחקר הניסיוני של תהליך ספציפי זה עם אוורור מתמשך alveolar, ובכך למנוע את התהליכים המזיקים המורכבים של היפוקסיה ו atelectasis. בהקשר הקליני, פגיעה באיסכמיה רפרפוזיה של הריאות (הידועה גם בשם ריאה IRI או LIRI) נגרמת על ידי תהליכים רבים, כולל אך לא מוגבל לתסחיף ריאתי, טראומה דימומית שעברה החייאה והשתלת ריאות. קיימות כיום אפשרויות טיפול יעילות מוגבלות עבור LIRI. כאן, אנו מציגים מודל כירורגי הפיך של IR ריאה הכולל אינטובציה אורוטרכאלית ראשונה ואחריה איסכמיה חד-צדדית של הריאה השמאלית ו- reperfusion עם אוורור alveolar משומר או חילופי גזים. עכברים עוברים כריתת בית חזה שמאלית, שדרכה עורק הריאה השמאלי נחשף, מדומה, מבודד ודחוס באמצעות החלקה הפיכה. לאחר מכן החתך הניתוחי נסגר במהלך התקופה האיסכמית, ובעל החיים מתעורר ומופקר. כאשר העכבר נושם באופן ספונטני, reperfusion נוצר על ידי שחרור החלקה סביב עורק הריאה. מודל הישרדות רלוונטי מבחינה קלינית זה מאפשר הערכה של פגיעה ב-IR של הריאה, שלב הרזולוציה, השפעות במורד הזרם על תפקוד הריאות, כמו גם מודלים של שתי פגיעות המערבות דלקת ריאות ניסיונית. למרות שהוא מאתגר מבחינה טכנית, ניתן לשלוט במודל זה במשך מספר שבועות עד חודשים עם שיעור הישרדות או הצלחה בסופו של דבר של 80%-90%.

Introduction

פגיעה באיסכמיה רפרפוזיה (IR) יכולה להתרחש כאשר זרימת הדם משוחזרת למיטת איברים או רקמות לאחר תקופה מסוימת של הפרעה. בריאה, IR יכול להתרחש בבידוד או בשיתוף עם תהליכים מזיקים אחרים כגון זיהום, היפוקסיה, atelectasis, volutrauma (מנפחי גאות גבוהים במהלך אוורור מכני), barotrauma (שיא גבוה או לחצים מתמשכים במהלך אוורור מכני), או קהה (לא חודר) פגיעה חבלת ריאות ^1,2,3 . קיימים מספר פערים בידע שלנו על המנגנונים של LIRI ועל ההשפעה של תהליכים מקבילים (למשל, זיהום) על תוצאות LIRI, וגם אפשרויות הטיפול ב-LIRI מוגבלות. מודל in vivo של LIRI טהור נדרש כדי לזהות את הפתופיזיולוגיה של פגיעה IR ריאה בבידוד ולחקור את תרומתו לכל תהליך מרובה פגיעות שבו פגיעה ריאה היא מרכיב.

ניתן להשתמש במודלים של IR ריאה מורין כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה הספציפית לריאות של תהליכים מרובים, כולל השתלת ריאות³, תסחיף ריאתי⁴, ופגיעה בריאות בעקבות טראומה דימומית עם החייאה⁵. מודלים המשמשים כיום כוללים השתלת ריאות כירורגית⁶, הידוק הילאר⁷, ex vivo ריאה perfusion⁸, וריאה מאווררת IR⁹. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מודל IR ריאה מאוורר של מורין של פגיעה ריאתית סטרילית. ישנם יתרונות רבים לגישה זו (איור 2), כולל העובדה שהיא משרה היפוקסיה מינימלית ואטלקטזיס מינימלי, וזהו מודל ניתוחי הישרדות המאפשר מחקרים ארוכי טווח.

הסיבות לבחור בדגם זה של LIRI על פני דגמים אחרים כגון הידוק הילאר ומודלים של פרפוזיה ex vivo הן כדלקמן: מודל זה ממזער את התרומות הדלקתיות של אטלקטזיס, אוורור מכני והיפוקסיה; הוא משמר אוורור מחזורי; הוא שומר על מערכת חיסונית במחזור הדם in vivo שלמה שיכולה להגיב לפגיעה ב-IR; ולבסוף, כהליך הישרדותי, הוא מאפשר ניתוח ארוך טווח של המנגנונים של יצירת פציעות משניות (מודלים של 2 פגיעות) ופתרון פציעות. באופן כללי, אנו מאמינים שמודל IR ריאות מאוורר זה מספק את הצורה "הטהורה" ביותר של פגיעת IR שניתן לחקור בניסוי.

פרסומים אחרים תיארו את השימוש באינטובציה אורו-טרכאלית של עכברים לביצוע הזרקות IT או התקנות^10,11, אך לא כנקודת המוצא לניתוח הישרדות כפי שהוא במודל זה. המיקום של צינור אורוטרכאלי מאפשר ביצוע של ניתוח ריאות על ידי מתן אפשרות לקריסת הריאה הניתוחית. זה גם מאפשר reinflation של הריאה בסוף ההליך, אשר קריטי עבור pneumothorax ועל היכולת של העכבר לחזור אוורור ספונטני בסיום ההליכים. לבסוף, הסרת הצינור האורוטרכאלי המאובטח היא הליך פשוט, שבניגוד לטרכאוטומיה פולשנית, תואם לניתוח הישרדות. זה מאפשר מחקרים ארוכי טווח המתמקדים בהבנת ההתקדמות והפתרון של LIRI והפרעות נלוות, כמו גם יצירת מודלים של פציעות כרוניות.

Protocol

כל הנהלים והשלבים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו. ניתן להשתמש בכל זן עכבר, אם כי לחלק מהזנים יש תגובה דלקתית IR ריאה חזקה יותר בהשוואה לאחרים¹². עכברים שגילם כ-12-15 שבועות (30-40 גרם) או מבוגרים יותר סובלים ושורדים את ניתוח ה-IR הריאה טוב יותר מעכברים צעירים יותר. עכברים זכרים ונקבות כאחד יכולים לשמש לניתוחים אלה.

1. פרוטוקול אינטובציה של עכבר

1. הרדמה והכנה לאינטובציה
   1. נגב את בטן העכבר עם מקלון אתנול. הרדמת העכבר עם הזרקה intraperitoneal של tribromoethanol (250-400 מ"ג / ק"ג). להעריך את העומק המתאים של הרדמה על ידי חוסר רפלקס נסיגה דוושה. יש להניח משחת סיכה לעיניים עכשיו או מאוחר יותר (שלב 2.1.4).
      הערה: עבור הליך זה, tribromoethanol (ו etomidate כאופציה חלופית) מספק מישור הרדמה יציב מבלי להשפיע על התנאים ההמודינמיים הדרושים לניתוח זה. הרדמה זו משמשת רק פעם אחת כדי למנוע את הסיכון של הידבקויות הצפק. איזופלוראן יכול לשמש גם, אבל אנחנו לא משתמשים בו כאן. המתרגל חופשי להשתמש בכל מתכון הרדמה שהוא רואה לנכון.
   2. הניחו את העכבר המרדים על מעמד אינטובציה או תמיכת פלסטיק במצב שכיבה, התלוי על ידי החותכות העליונות שלו על תפרים 4-0 לולאתיים (משי או אחרים) על פני שני עוגני תמיכה.
   3. כדי לשמור על העכבר משותק במהלך הליך אינטובציה, להדביק באופן רופף את החלק התחתון של החזה (או שתי הגפיים העליונות) על הרציף.
   4. הניחו את האור הגמיש הפיברופטי בעדינות על קנה הנשימה של העכבר, מעט מתחת למיתרי הקול. כוונן את רמת ההארה כך שרק שדה כהה נראה לעין כאשר מסתכלים לתוך הלוע של העכבר למעט אור אדום הנובע מתחת למיתרי הקול, ומדגים את המטרה למיקום הסופי של הצינור האנדוטרכאלי. שים לב שתנועות מיתרי הקול צריכות להיות גלויות בעין בלתי או, במידת הצורך, תחת הגדלה.
2. הליך אינטובציה
   1. החזיקו את הפינצטה ביד הדומיננטית והשתמשו בהן כדי לאחוז בעדינות ולהוציא את הלשון מחלל הפה.
   2. פתח את הלסת התחתונה באמצעות מלקחיים המוחזקים על ידי היד הלא דומיננטית, ולאחר מכן דחף את המלקחיים לתוך הגרון כדי להרים בעדינות את האפיגלוטיס. בשלב זה, לשחרר את הלשון מן הפינצטה.
   3. חפשו את מיתרי הקול. הם צריכים להיפתח ולהיסגר בהתאם לכל נשימה. מחזיקים את הצינורית עם חוט ההנחיה טעון מראש, מכניסים את קצה החוט דרך מיתרי הקול.
   4. נזהרים מאוד לא להזיז את החוט על ידי החזקת חלק ממנו שנמצא מחוץ לצינורית אלא ממש מעל מיתרי הקול, מושכים את הצינורית, ומשאירים רק את החוט במקום עם הקצה הדיסטלי שלו בתוך קנה הנשימה.
   5. בשלב זה, בצע הדמיה שנייה של מיתרי הקול כדי לאשר כי קצה הדיסטלי של החוט נשאר מועבר דרך מיתרי הקול המוארים אל קנה הנשימה, ואינו נמצא בוושט הלא מואר.
   6. החזק את החוט מחוץ לפה עם המלקחיים המעוקלים ביד שמאל, התייצב על משטח קשה, וקדם בזהירות את קטטר 20G עם כנפי סרט על החוט.
   7. ברגע שהקצה הדיסטלי של החוט יוצא מהקצה האחורי של קטטר 20G או צינור אנדוטרכאלי, החזיקו את הקצה הזה עם המלקחיים המעוקלים וקדמו בצורה חלקה את קטטר ה-20G לתוך קנה הנשימה.
   8. הסר בזהירות את החוט מהקצה הדיסטלי של קטטר 20G עם המלקחיים המעוקלים מבלי לעקור את מיקום הקטטר.
   9. חברו לזמן קצר את הקטטר למכונת ההנשמה לפני שאתם מאבטחים אותו כדי לוודא מיקום נכון לקנה הנשימה ולא לוושט. אשר את מיקום קנה הנשימה על ידי תצפית על תנועות דופן בית החזה הדו-צדדיות התלויות באוורור מכני והיעדר אינפלציה של הבטן.
3. לאחר אינטובציה
   1. נתק את הקטטר ממכונת ההנשמה. תקן את כנפי הקלטת (המחוברות לקטטר) דרך השפה התחתונה של העכבר באמצעות תפר 4-0 vicryl כדי להדק בחוזקה את הצינור האנדוטרכאלי (ETT) לעכבר במהלך כל ההליכים / המניפולציות הבאים.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בנייר דבק משי או בקלטת אחרת כדי לאבטח את ה- ETT, אולם יש לנקוט בזהירות כדי למנוע פריקה של ה- ETT במהלך תנועת החיה ממזחלת האינטובציה למשטח הניתוח.
   2. הסר בזהירות את העכבר ממזחלת האינטובציה. לחבר לזמן קצר את הקטטר למכונת ההנשמה שנקבעה בנפח גאות 0.2-0.225 מ"ל וקצב נשימה של 120-150 נשימות לדקה כדי לאשר מיקום קנה הנשימה הנכון של צינור האורוטרצ'אל ולאחר מכן להתנתק עם העכבר נושם באופן ספונטני דרך צינור האורוטרצ'אל.
   3. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה מנקודה זו ואילך עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על משכיבה סטרנלית בסוף ההליך.

2. פרוטוקול ניתוח איסכמיה ריאה ורפרפוזיה (IR)

1. משכך כאבים והכנת האתר הכירורגי
   1. נגבו את בטן העכבר במקלון אתנול והזריקו בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג) באופן תוך-צפקי.
   2. לגלח את השיער מעל אזור בית החזה השמאלי עד עצם השכמה השמאלית. הסר שיער מגולח עודף באמצעות ספוגיות אלכוהול.
      הערה: ניתן לבצע שלבים 2.1.1 ו- 2.1.2 גם לפני אינטובציה אם יש חשש להתנתקות מה- ETT כאשר הוא מאובטח בנייר דבק משי.
   3. הניחו את העכבר על משטח חימום במצב רוחבי שמאלי או 3/4 מסתובב וחברו את צינור קנה הנשימה על מכונת ההנשמה עם נפח גאות של 0.2-0.225 מ"ל (~ 8 מ"ג / ק"ג) וקצב נשימה של 120-150 נשימות לדקה. אין להשתמש בתוספת חמצן לצורך הליך זה.
   4. יש למרוח חומר סיכה לעיניים עם צמר גפן סטרילי. סובבו את העכבר ל-3/4 צד שמאל למעלה ושיתקו את כל ארבעת הגפיים ואת הזנב בעזרת סרט מעבדה.
   5. יש לחטא את אזור העור המגולח והפרווה שמסביבו באמצעות פובידון-יוד ולהמתין לייבוש התמיסה. לאחר מכן מכסים את שדה הניתוח בווילון סטרילי או בסרט פלסטיק שקוף ויוצרים פתח מלבני בווילון או בסרט הפלסטיק לשדה הניתוח.
2. הליך כירורגי
   1. אשר את הרמה המתאימה של הרדמה (המסופקת על ידי הממשל של tribromoethanol ו buprenorphine כפי שתואר קודם לכן) על ידי בדיקת התגובה צביטה הבוהן.
   2. באמצעות זוג מספריים חדים וזוג מלקחיים גדולים יותר (מלקחיים בדוגמה צרה או דומה), בצע חתך עור רוחבי באורך 2 ס"מ מתחת לזווית הנחותה של עצם השכמה בבית החזה הצדדי השמאלי. השתמשו במספריים ובזוג מלקחיים עדינים יותר (מלקחיים עדינים במיוחד או דומים) כדי לחתוך לשכבת השרירים ולנתח עד לצלעות.
   3. זהה את החלל האינטרקוסטלי השני והחזק את הצלע השנייה עם המלקחיים העדינים הנוספים. משיכת הצלע כלפי מעלה, השתמש בלהב אזמל סטרילי #11 או #12 (מעוקל) (אין צורך בידית) כדי להיכנס לחלל הצדר על ידי הפרדה וחיתוך על פני השרירים הבין-קוסטליים^{של החלל השני-3}. שקול להשהות את האוורור כדי להפחית את הפגיעה בריאה השמאלית.
   4. הכנס שלושה retractors מעוקרים. השתמש בצפלד הקטן ביותר/הצר ביותר לאורך כיוון הצלעות, במחזיר בגודל בינוני שמאלה לאורך הצלע^השנייה , ובמשענת הגדולה ביותר מימין לאורך פני הצלע^{השלישית} .
   5. פתח את החזה עם נסיגה איטית ומתקדמת באמצעות מיתרי retractor אלסטי. חשוף וזהה את עורק הריאה השמאלי (PA) על ידי הזזת קצה הריאה השמאלית בעזרת צמר גפן סטרילי.
   6. השתמש במיקרו מלקחיים, מלקחיים דקים במיוחד ביד ימין ו- PA או מלקחיים מתרחבים ביד שמאל, כדי לחשוף בעדינות וליצור את השדה שבו ניתן לראות את הרשות השמאלית ואת הברונכוס.
   7. באמצעות מלקחיים של PA, הרימו את הרשות השמאלית ומשכו בעדינות אך בחוזקה כלפי מעלה וצפלאד כדי לדמיין את הברונכוס השקוף למטה. הגדל את ההגדלה במיקרוסקופ הדיסקציה (ראה רשימת ציוד לפרטים נוספים) בנקודה זו למקסימום (2x).
      הערה: יש לעקר את כל הציוד לפני השימוש. בנוסף, כדי לשמור על סטריליות, רק קצות כלי הניתוח צריכים להיכנס לשדה הניתוח הסטרילי.
   8. תוך כדי התרחקות הרשות מהברונכוס, מעבירים בזהירות את המלקחיים האולטרה-דקים הסגורים דרך החלל שבין הרשות השמאלית לברונכוס. לאחר מכן, השתמש במלקחיים אלה כדי להחזיק ולמשוך 7-0 או 8-0 תפר פרולן דרך החלל שבין עורק הריאה השמאלי (מעל) לברונכוס (להלן).
   9. הקיפו את הרש"פ השמאלית על ידי קשירת תלוש כדי ליצור חסימה ברשות. הפרעה בזרימת הדם ניתנת להדמיה בקלות תחת המיקרוסקופ. זה מסמן את תחילת התקופה האיסכמית.
   10. החצנת הקצה החופשי של הקשר דרך נקודת כניסה שונה בבית החזה השמאלי הקדמי באמצעות מחט 24G-28G ואבטחת קצה התפר באמצעות פיסת נייר דבק קטנה לזיהוי קל יותר בהמשך.
   11. יש לנפח מחדש את הריאה כדי להוציא כמה שיותר אוויר מחלל בית החזה באמצעות שסתום/צינורות PEEP במאוורר המכרסמים. לאחר מכן, סגרו את הצלעות עם שני תפרים מניילון 4-0 מופרעים.
   12. סגור את השריר ואת השכבה התת עורית עם תפר ניילון פועל 4-0. לאחר מכן יש למרוח שתיים או שלוש טיפות של בופיווקאין מקומי (0.5%) על החתך. השתמשו בתפר ניילון 4-0 כדי לסגור את שכבת העור עם תפר רץ.
3. טיפול לאחר הניתוח
   1. כאשר האוורור הספונטני התחדש, נתק את הצינור האנדוטרכאלי ממכונת ההנשמה והוציא את העכבר.
   2. הניחו את העכבר על משטח החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך ההתאוששות המוקדמת שלאחר ההרדמה.
   3. בזהירות לפקח על העכבר תוך התאוששות מהרדמה כללית. משוך את החלקה המוחצנת בעדינות בסוף התקופה האיסכמית (30 דקות או שעה).
   4. הזיזו את העכבר ממשטח החימום לכלוב לאחר שהפגין סימני התאוששות: ימין עצמי ו/או תנועה.
   5. לאחר תקופת reperfusion (1 שעה או 3 שעות), להרדים את החיה ולאסוף דם על ידי נקב לב ורקמת ריאות לניתוח נוסף. במשך שעה אחת reperfusion, לאסוף פלזמה עבור ELISA, רקמה עבור RNA, וניתוח חלבונים; עבור 3 שעות reperfusion, בנוסף לאסוף רקמות עבור היסטולוגיה.

תוצאות

דלקת שנוצרת כתוצאה מפגיעה חד-צדדית באיסכמיה סטרילית של הריאות הסטריליות (IR): לאחר שעה אחת של איסכמיה, ראינו רמות גבוהות יותר של ציטוקינים בסרום ובתוך רקמת הריאה הן על ידי ELISA והן על ידי qRT-PCR שהגיעו לשיא של שעה לאחר רפרפוזיה וחזרו במהירות לנקודת ההתחלה תוך 12-24 שעות לאחר רפרפוזיה¹³...

Discussion

כתב יד זה מפרט את השלבים הכרוכים בביצוע מודל IR הריאה המאווררת שפותח על ידי Dodd-o et ^al.9. מודל זה סייע לזהות מסלולים מולקולריים המעורבים ביצירה ובפתרון של דלקת מ-IR ריאה בבידוד 14,15,16,17^, IR ריאה בשילוב עם זיהום קיים 18, ו-IR ריאה ביחס לציר המעיים-ריאה ותרומת מיקרוביום המעי^13,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fiber Optic Light Pipe	Cole-Parmer	UX-41720-65	Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source	AmScope	SKU: CL-HL250-B	Light source for fiberoptic lights
Germinator 500	Cell Point Scientific, Inc.	No.5-1450	Bead Sterilizer
Heating Pad	AIMS	14-370-223	Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper)	WAHL home products	SKU 09854-600B	To remove mouse hair on surgical site
Microscope	Nikon	SMZ-10	Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator	Havard Apparatus	Model 845	Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05	Clean tools that been used in operation
Warming Pad	Kent Scientific	RT-0501	To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale	Cole-Parmer	UX-11003-41	Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture	Ethicon	683G	For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture	Ethicon Industry	EP8734H	Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use)	Aspen Surgical	372611	For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel	Aspen Surgical	372612	For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10	Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System	FST	1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)	Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle	COVIDIEN	05-561-20	For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps	FST	11002-12	Skin level forceps
Needle holder/Needle driver	FST	12565-14	for holding needles
Needles	BD	305110	26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps	FST	00125-11	To hold PA; non-damaging gripper
Scissors	FST	14060-09	Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps	FST	11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm)	For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine	Hospira, Inc.	0409-1159-02	Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine	Covetrus North America	59122	Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant	BAUSCH+LOMB	Soothe Lubricant Eye Ointment	Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution	MEDLINE INDUSTRIES INC	SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic)	Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab	BD brand	BD 326895	for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film	KIRKLAND	Stretch-Tite premium	Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes	Stoelting	50981	Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application	Pwi-Wnaps	703033	used for applying eye lubricant
Top Sponges	Dukal Corporaton	Reorder # 5360	Stopping bleeding from skin/muscle