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Resumen

La capacidad de los bacteriófagos para mover el ADN entre las células bacterianas los convierte en herramientas efectivas para la manipulación genética de sus huéspedes bacterianos. Aquí se presenta una metodología para inducir, recuperar y usar φBB-1, un bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transducir ADN heterólogo entre diferentes cepas de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme.

Resumen

La introducción de ADN extraño en la espiroqueta Borrelia burgdorferi se ha logrado casi exclusivamente mediante la transformación mediante electroporación. Este proceso tiene eficiencias notablemente más bajas en la espiroqueta de la enfermedad de Lyme en relación con otras bacterias Gram-negativas mejor caracterizadas. La tasa de éxito de la transformación depende en gran medida de tener cantidades concentradas de ADN de alta calidad de antecedentes específicos y está sujeta a una variabilidad significativa de cepa a cepa. Los medios alternativos para introducir ADN extraño (es decir, vectores lanzadera, reporteros fluorescentes y marcadores de resistencia a los antibióticos) en B. burgdorferi podrían ser una adición importante al arsenal de herramientas útiles para la manipulación genética de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Los bacteriófagos han sido bien reconocidos como mecanismos naturales para el movimiento del ADN entre las bacterias en un proceso llamado transducción. En este estudio, se ha desarrollado un método para utilizar el ubicuo fago borrelial φBB-1 para transducir ADN entre células de B. burgdorferi de los mismos y diferentes antecedentes genéticos. El ADN transducido incluye tanto ADN borrelial como ADN heterólogo en forma de pequeños vectores lanzadera. Esta demostración sugiere un uso potencial de la transducción mediada por fagos como complemento de la electroporación para la manipulación genética de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Este informe describe métodos para la inducción y purificación del fago φBB-1 de B. burgdorferi, el uso de este fago en ensayos de transducción y la selección y selección de transductores potenciales.

Introducción

El desarrollo de herramientas para la manipulación genética de la bacteria espiroqueta Borrelia burgdorferi ha añadido un valor inconmensurable a la comprensión de la naturaleza de la enfermedad de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi tiene un genoma inusualmente complejo compuesto por un pequeño cromosoma lineal y plásmidos lineales y circulares 5,6. La pérdida espontánea de plásmidos, el reordenamiento intragénico (movimiento de genes de un plásmido a otro dentro del mismo organismo) y la transferencia horizontal de genes (HGT, el movimiento de ADN entre dos organismos) han dado lugar a una cantidad vertiginosa de heterogeneidad genética entre B. burgdorferi (para un ejemplo, ver Schutzer et al.7). Los genotipos resultantes (o "cepas") son todos miembros de la misma especie, pero tienen diferencias genéticas que influyen en su capacidad para transmitir e infectar a diferentes huéspedes mamíferos 8,9,10,11. En este informe, el término "cepa" se utilizará para referirse a B. burgdorferi con un fondo genético particular de origen natural; El término "clon" se utilizará para referirse a una cepa que ha sido modificada genéticamente para un propósito particular o como resultado de una manipulación experimental.

La caja de herramientas moleculares disponible para su uso en B. burgdorferi incluye marcadores seleccionables, reporteros de genes, vectores lanzadera, mutagénesis de transposones, promotores inducibles y marcadores contraseleccionables (para una revisión, ver Drektrah y Samuels12). El uso efectivo de estas metodologías requiere la introducción artificial de ADN heterólogo (extraño) en una cepa de B. burgdorferi de interés. En B. burgdorferi, la introducción de ADN heterólogo se logra casi exclusivamente a través de la electroporación, un método que utiliza un pulso de electricidad para hacer una membrana bacteriana transitoriamente permeable a pequeños trozos de ADN introducidos en el medio1. La mayoría de las células (estimadas en ≥99,5%) son destruidas por el pulso, pero las células restantes tienen una alta frecuencia de retención del ADN heterólogo13. Aunque se considera uno de los métodos más eficientes para introducir ADN en bacterias, la frecuencia de electroporación en B. burgdorferi es muy baja (oscilando entre 1 transformador en 5 × 104 a 5 × 106 células)13. Las barreras para lograr frecuencias más altas de transformación parecen ser tanto técnicas como biológicas. Las barreras técnicas para el éxito de la electroporación de B. burgdorferi incluyen tanto la cantidad de ADN (>10 μg) que es necesaria como el requisito de que las espiroquetas estén exactamente en la fase de crecimiento correcta (mid-log, entre 2 × 107 células·mL−1 y 7 × 107 células·mL−1) al preparar células electrocompetentes12,13. Estas barreras técnicas, sin embargo, pueden ser más fáciles de superar que las barreras biológicas.

Los investigadores de la enfermedad de Lyme reconocen que los clones de B. burgdorferi se pueden dividir en dos grandes categorías con respecto a su capacidad para ser manipulados genéticamente13,14. Los aislados de alto paso, adaptados al laboratorio, a menudo se transforman fácilmente, pero generalmente han perdido los plásmidos esenciales para la infectividad, se comportan de manera fisiológicamente aberrante y no pueden infectar a un huésped mamífero o persistir dentro de un vector de garrapatas12,13. Si bien estos clones han sido útiles para diseccionar la biología molecular de la espiroqueta dentro del laboratorio, son de poco valor para estudiar la espiroqueta dentro del contexto biológico del ciclo enzoótico. Los aislados infecciosos de paso bajo, por otro lado, se comportan de manera fisiológica que refleja un estado infeccioso y pueden completar el ciclo infeccioso, pero generalmente son recalcitrantes a la introducción de ADN heterólogo y, por lo tanto, son difíciles de manipular para el estudio12,13. La dificultad para transformar aislados de paso bajo está relacionada con al menos dos factores diferentes: (i) los aislados de paso bajo a menudo se agrupan estrechamente, particularmente en las condiciones de alta densidad requeridas para la electroporación, bloqueando así muchas células de la aplicación completa de la carga eléctrica o el acceso al ADN en el medio13,15; y (ii) B. burgdorferi codifica al menos dos sistemas diferentes de modificación de restricción transmitida por plásmidos (R-M) que pueden perderse en aislados de paso alto14,16. Los sistemas R-M han evolucionado para permitir que las bacterias reconozcan y eliminen el ADN extraño17. De hecho, varios estudios en B. burgdorferi han demostrado que las eficiencias de transformación aumentan cuando la fuente del ADN es B. burgdorferi en lugar de Escherichia coli13,16. Desafortunadamente, adquirir la alta concentración requerida de ADN para la electroporación de B. burgdorferi es una perspectiva costosa y lenta. Otra preocupación potencial al electroporar y seleccionar aislados de paso bajo es que el proceso parece favorecer a los transformadores que han perdido el plásmido crítico asociado a virulencia, lp2514,18,19; por lo tanto, el acto mismo de manipular genéticamente aislados de B. burgdorferi de paso bajo mediante electroporación puede seleccionar clones que no son adecuados para el análisis biológicamente relevante dentro del ciclo enzoótico20. Dados estos problemas, un sistema en el que el ADN heterólogo podría electrotransformarse en clones de B. burgdorferi de alto paso y luego transferirse a aislados infecciosos de paso bajo por un método distinto de la electroporación podría ser una adición bienvenida a la creciente colección de herramientas moleculares disponibles para su uso en la espiroqueta de la enfermedad de Lyme.

Además de la transformación (la captación de ADN desnudo), hay otros dos mecanismos por los cuales las bacterias toman regularmente ADN heterólogo: la conjugación, que es el intercambio de ADN entre bacterias en contacto físico directo entre sí, y la transducción, que es el intercambio de ADN mediado por un bacteriófago21. De hecho, la capacidad del bacteriófago para mediar HGT ha sido utilizada como una herramienta experimental para diseccionar los procesos moleculares dentro de varios sistemas bacterianos22,23,24. B. burgdorferi no es naturalmente competente para la absorción de ADN desnudo, y hay poca evidencia de que B. burgdorferi codifique el aparato necesario para promover una conjugación exitosa. Informes anteriores han descrito, sin embargo, la identificación y caracterización preliminar de φBB-1, un bacteriófago templado de B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 empaqueta una familia de plásmidos de 30 kb encontrados dentro de B. burgdorferi25; Los miembros de esta familia han sido designados CP32. Consistente con un papel para φBB-1 en la participación en HGT entre cepas de B. burgdorferi, Stevenson et al. informaron un cp32 idéntico encontrado en dos cepas con cp32s dispares, lo que sugiere un intercambio reciente de esta cp32 entre estas dos cepas, probablemente a través de la transducción29. También hay evidencia de una recombinación significativa a través de HGT entre los cp32 en un genoma relativamente estable30,31,32,33. Finalmente, la capacidad de φBB-1 para transducir tanto cp32s como ADN vector lanzadera heterólogo entre células de la misma cepa y entre células de dos cepas diferentes ha sido demostrada previamente27,28. Dados estos hallazgos, φBB-1 se ha propuesto como otra herramienta a desarrollar para la disección de la biología molecular de B. burgdorferi.

El objetivo de este informe es detallar un método para inducir y purificar el fago φBB-1 de B. burgdorferi, así como proporcionar un protocolo para realizar un ensayo de transducción entre clones de B. burgdorferi y seleccionar y seleccionar posibles transductores.

Protocolo

Todos los experimentos con ADN recombinante y organismos BSL-2 fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Quinnipiac.

1. Preparación del cultivo de B. burgdorferi para la producción de φBB-1

  1. Preparar el medio Barbour-Stoenner-Kelly suplementado con suplementado con suero normal de conejo (BSK) inactivado por calor al 6,6%15. Para 1 L de 1x BSK, combinar los componentes enumerados en la Tabla 1 en 900 ml de agua, ajustar el pH a 7,6 utilizando 1 N de hidróxido de sodio y mezclar lentamente a 4 °C durante 2-4 h. Una vez completada la mezcla, verifique y reajuste el pH a 7.6 si es necesario, y aumente el volumen a 1 L con agua. Esterilizar el medio pasando a través de un filtro de 0,22 μM (ver Tabla de materiales) y usar fresco o almacenar a 4 °C durante ≤2 meses.
  2. De tres a cinco días antes de comenzar el protocolo de transducción, inocular 150 μL del clon o clones apropiados de B. burgdorferi en 15 ml de 1x BSK en tubos centrífugos cónicos estériles bien tapados (ver Tabla de materiales). Complementar el medio con la concentración apropiada de antibióticos o combinación de antibióticos para la selección y mantenimiento del ADN heterólogo dentro del clon o clones de B. burgdorferi (Tabla 2).
    NOTA: B. burgdorferi es un organismo de nivel 2 de bioseguridad. Tome todas las precauciones apropiadas mientras trabaja con este organismo. Realizar todos los trabajos con cultivos vivos de B. burgdorferi en un gabinete de bioseguridad clase II certificado y debidamente desinfectado. Deseche adecuadamente todo el material que entre en contacto con B. burgdorferi y los propios organismos según las pautas de los CDC34.
  3. Incubar los cultivos a 33 °C sin agitar hasta que los cultivos alcancen una densidad de ≥5 × 107 espiroquetas·mL−1, lo que tarda aproximadamente 3-5 días.

2. Determinar la densidad de los cultivos de B. burgdorferi (modificados de Samuels)15

  1. Para densidades anticipadas superiores a 5 × 106 células·mL−1, determinar la densidad celular mediante espectroscopia.
    1. Transfiera 1 ml de cultivo a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml y centrifugar a 8.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    2. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 y 1.8mM KH2PO4). Transfiera toda la suspensión celular a una cubeta transparente semi-micro UV.
    3. Determinar la densidad óptica de la muestra resuspendida a una longitud de onda de 600 nm (A600). Ponga a cero el espectrofotómetro (consulte la Tabla de materiales) contra PBS.
    4. Para calcular la concentración de espiroquetas·mL−1 en el cultivo original, multiplique la densidad óptica en A600 por 1,4 × 109.
  2. Para densidades anticipadas entre 5 × 104 células·mL−1 y 5 × 106 células·mL−1, determine la densidad celular utilizando una cámara de conteo de Petroff-Hausser (ver Tabla de materiales) para contar directamente el número de espiroquetas. Este método también se puede utilizar para densidades más altas después de una dilución adecuada.
    NOTA: La visualización de espiroquetas vivas requiere un microscopio modificado con un condensador de campo oscuro.
    1. Aplicar 10 μL de muestra a la cámara de recuento y cubrir con el vidrio adecuado. Para densidades superiores a 1 × 107, diluir la muestra en PBS para obtener 50-100 espiroquetas por campo.
    2. Cuente las células usando un microscopio de campo oscuro con un aumento de 200x-400x. Cuenta todo el campo de 25 grupos de 16 cuadrados pequeños en todos los planos.
    3. Multiplicar el número contado por el factor de dilución (si lo hubiera) y 5 × 104 para obtener células·mL−1 del cultivo original.

3. Inducción del fago de B. burgdorferi φBB-1

NOTA: Esterilice todos los artículos de vidrio y plástico en autoclave; esterilizar todas las soluciones mediante esterilización en autoclave o filtración a través de un filtro de 0,22 μM. Los pasos a continuación se presentan en base a volúmenes de 15 ml, pero el método es escalable a volúmenes más pequeños o más grandes dependiendo de las necesidades individuales del experimento.

  1. Para el cultivo de B. burgdorferi a partir del cual se producirá el fago (el donante), utilice la concentración calculada por cualquiera de los métodos en la etapa 2 para determinar el volumen de cultivo iniciador necesario para producir 4 ml de 2 × 108 espiroquetas·mL−1. Esto producirá una concentración final de 5 × 107 espiroquetas·mL−1 en 15 ml durante la etapa de recuperación (paso 3.6 a continuación).
  2. Centrifugar el volumen de cultivo calculado en el paso 3.1 a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en 4 ml de BSK fresco. Transfiera la muestra al tubo estéril más pequeño disponible para contener la muestra con un espacio mínimo en la cabeza.
  3. Añadir la cantidad adecuada de agente inductor a la concentración recomendada (Tabla 3) en base a un volumen de cultivo de 4 ml para inducir la producción de fagos. Tapa el tubo herméticamente y mezcla bien.
  4. Incubar la muestra a 33 °C durante 2-4 h.
  5. Después de la incubación, transfiera la muestra a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar la muestra a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante.
  6. Resuspender el pellet celular en 15 mL de 1x BSK.
    NOTA: Después de la inducción del fago, hay dos formas diferentes de proceder con el ensayo de transducción. Estos métodos se presentan en la Figura 1 y en los pasos 4 y 6.

4. Transducción durante el cocultivo después de la exposición del donante al agente inductor (Figura 1A)

NOTA: Este protocolo solo se puede usar cuando la cepa productora de fagos (donante) tiene resistencia a un antibiótico en particular y la cepa a transducir (receptor) tiene resistencia a otro antibiótico.

  1. Preparar un cultivo de B. burgdorferi para ser utilizado como receptor en los ensayos de transducción, como se describe para la cepa donante en el paso 1 anterior. Sobre la base de la densidad determinada como en el paso 2, calcular el volumen necesario para producir 15 ml de 1 × 107 espiroquetas·mL−1.
  2. Centrifugar el volumen de cultivo calculado en el paso 4.1 a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante.
  3. Resuspender el pellet en 1 mL de cultivo a partir del paso 3.6 (donante de fagos resuspendido). Agregue el receptor resuspendido nuevamente a la cultura con el donante. No suplementar con antibióticos. El volumen total que contiene ambos cultivos es de 15 mL.
  4. Incubar a 33 °C durante 72-96 h.
  5. Realizar la selección de transductores mediante recubrimiento en fase sólida después del cocultivo como se describe en el paso 7.

5. Precipitación de polietilenglicol (PEG) para recuperar fagos para su uso en ensayos de transducción

NOTA: Este protocolo se puede utilizar en los casos en que la cepa productora de fagos (donante) tiene resistencia a un antibiótico en particular y la cepa a transducir (receptor) no tiene resistencia a los antibióticos o resistencia a otro antibiótico.

  1. Complementar el cultivo del paso 3.6 con el antibiótico adecuado a la concentración indicada en la Tabla 2. Incubar la muestra a 33 °C durante 72-96 h.
  2. Preparar soluciones para la precipitación de PEG.
    1. Preparar 500 mL de NaCl 5 m. Esterilizar en autoclave y dejar enfriar antes de usar. Conservar a temperatura ambiente.
    2. Preparar 500 mL de PEG al 40% disolviendo 200 g de PEG8000 en 400 mL de agua; Calentar suavemente mientras se remueve hasta que la solución esté bien mezclada. Llevar el volumen hasta 500 mL con agua. Para disolver completamente el PEG8000 y esterilizar la solución, esterilice en autoclave la solución y enfríe antes de su uso. Conservar a temperatura ambiente.
    3. Preparar 100 ml de medio de suspensión (SM; 100 mM NaCl, 10 mMMgSO4 y 50 mM Tris-HCl [pH 7.5]). Esterilizar en autoclave. Conservar a 4 °C.
  3. Para la precipitación PEG del fago del clon donante de B. burgdorferi (a partir del paso 3.6), después de 72-96 h de incubación, centrifugar las muestras a 8.000 x g durante 20 min a 4 °C.
  4. Decantar el sobrenadante en un tubo cónico limpio de 50 ml; Deseche el pellet celular. Añadir 5 M de NaCl a una concentración final de 1 M. Mezclar bien. Mece suavemente a temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Centrifugar las muestras a 8.000 g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante en un tubo cónico limpio de 50 ml; El pellet puede ser pequeño o estar ausente. Agregue una solución de PEG8000 al sobrenadante al 40% hasta una concentración final del 10%. Mezclar bien y poner en hielo durante más de 1 h hasta toda la noche.
    NOTA: Los tiempos más largos no parecen correlacionarse con un aumento significativo de la recuperación de fagos.
  6. Centrifugar las muestras a 8.000 x g durante 20 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y elimine la mayor cantidad de líquido en exceso posible sin perder ningún pellet, que contiene las partículas del fago.
  7. Resuspenda el pellet en un volumen mínimo de SM, usando el SM para lavar el costado de la botella y recoger cualquier partícula potencial de fagos. La proporción recomendada es de 400 μL de SM por 10 ml de sobrenadante original, pero dependiendo del tamaño del pellet, se puede requerir más o menos SM para la resuspensión completa.
  8. Tratar la muestra de fagos recuperados con un volumen igual de cloroformo basado en el volumen de resuspensión. Mezclar bien la muestra y luego centrifugar a 8.000 x g durante 10 min. Retire la capa acuosa (superior) a un tubo limpio, evitando cualquiera de las capas gruesas de la interfaz.
    NOTA: φBB-1 es un bacteriófago sin envoltura y no es susceptible al tratamiento con cloroformo25. Este paso se realiza para interrumpir aún más cualquier estructura unida a la membrana (es decir, células o ampollas) y para matar cualquier contaminante celular potencial. El cloroformo es un orgánico volátil y debe usarse solo en una campana extractora bien ventilada; Desechar el material que contenga cloroformo como residuo orgánico.
  9. Determinar el volumen recuperado después del primer tratamiento con cloroformo y tratar la muestra de nuevo con una cantidad de cloroformo igual al 10% de ese volumen. Mezclar bien y centrifugar a 8.000 x g durante 10 min. Retire la capa acuosa (superior), teniendo cuidado de evitar cualquiera de la interfaz o capa orgánica. Transfiera la capa acuosa a un tubo limpio.
  10. Utilizar el fago inmediatamente (como se describe en el paso 6) o conservar a 4 °C.
    NOTA: No se recomienda la congelación de muestras de fagos φBB-1. Aunque la estabilidad de φBB-1 a 4 °C no se ha investigado rigurosamente, las muestras almacenadas a 4 °C hasta 1 mes después de la recuperación se han utilizado con éxito en ensayos de transducción.

6. Ensayo de transducción después de la precipitación de PEG de φBB-1 (Figura 1B)

  1. Preparar cultivos de B. burgdorferi para ser utilizados como receptor en ensayos de transducción, como se describe para la cepa donante en el paso 1 anterior. Sobre la base de la densidad determinada como en el paso 2, calcular el volumen de cultivo del receptor necesario para producir 15 mL de 1 × 107 espiroquetas·mL−1.
  2. Centrifugar el volumen de cultivo calculado en el paso 6.1 a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en 14,5 ml de BSK fresco.
  3. Añadir ≤500 μL de muestra de fagos precipitados con PEG (a partir del paso 5) al cultivo del clon receptor. Mezclar bien e incubar a 33 °C durante 72-96 h.
    NOTA: La cantidad de fagos recuperados durante la precipitación de PEG puede ser variable, dependiendo de una serie de factores. Sin embargo, a partir de un cultivo de 15 ml de la cepa inducida de B. burgdorferi CA-11.2A, 500 μL contienen típicamente 50-1,000 fagosviables 28. Los volúmenes de recuperación de fagos ≥500 μL afectan negativamente el crecimiento de B. burgdorferi , probablemente debido al aumento de la proporción de SM a BSK.
  4. Realizar la selección de transductores mediante recubrimiento en fase sólida después de mezclarlos con fagos precipitados con PEG como se describe en el paso 7.

7. Selección de transductores

NOTA: El recubrimiento en fase sólida de los transductores potenciales se realiza utilizando una modificación de una sola capa del protocolo descrito por primera vez por Samuels15. Las colonias de B. burgdorferi crecen dentro del agar, por lo que para la selección de transductores por recubrimiento en fase sólida, las muestras deben agregarse al medio mientras se vierten las placas. Un método alternativo para la selección de transformadores utilizando un método de dilución en placas de 96 pocillos también se ha descrito anteriormente35. Esta técnica también podría ser efectiva para la selección de transductores, pero aún no se ha probado para este propósito.

  1. Determine el número de placas necesarias para la selección de transductores en función del número de muestras de los ensayos de transducción y los controles que se van a platear.
    NOTA: Normalmente, se vierten dos placas por muestra, una equivalente a aproximadamente el 10% del volumen de cultivo y otra que incluye el resto del cultivo. Además, vierta las placas que sirven como controles negativos para probar individualmente que la preparación de fagos y / o los clones parentales utilizados como donante y receptor no crecen en presencia de los antibióticos utilizados durante la selección. También se recomienda preparar el material de recubrimiento para al menos dos placas adicionales. Por ejemplo, si el número de muestras y controles a emplatar es ocho, prepare suficiente mezcla de recubrimiento para 10 placas.
  2. Prepare soluciones para el recubrimiento como se describe a continuación.
    NOTA: Cada placa será de 30 mL, compuesta por 20 mL de BSK 1.5x para recubrimiento y 10 mL de agarosa al 2.1% (relación 2:1). Esto producirá una placa con concentraciones finales de 1x BSK y 0,7% de agarosa. Por ejemplo, para 10 placas, prepare una mezcla de recubrimiento total de 300 ml, que consista en 200 ml de BSK 1.5x y 100 ml de agarosa al 2.1%.
    1. Prepare 1 L de 1.5x BSK como se describe para 1x BSK en el paso 1.1 usando las cantidades de cada componente enumeradas para 1.5x BSK en la Tabla 1. Almacene como se describe para 1x BSK.
    2. Preparar agarosa al 2,1% en agua y autoclave. Use la solución de agarosa fresca o guárdela a temperatura ambiente. Si se almacena a temperatura ambiente, microondas con la tapa suelta hasta que esté completamente fundido antes de emplatar.
    3. Determinar el volumen de antibiótico(s) necesario(s) para alcanzar la concentración adecuada (Tabla 2) en función de toda la mezcla de recubrimiento.
      NOTA: Si el volumen total de la solución de recubrimiento final es de 300 ml, mezcle 200 ml de BSK 1.5x y suficiente antibiótico para asegurar que los 300 ml completos tengan la concentración final correcta de antibióticos. Si tanto el donante como el receptor en el ensayo de transducción tienen diferentes genes de resistencia a los antibióticos, la mezcla de recubrimiento debe contener ambos antibióticos. Si el fago precipitado por PEG del donante (como se preparó en el paso 5) codifica un marcador de resistencia a los antibióticos y el receptor no tiene ninguno, la mezcla de recubrimiento debe contener solo un antibiótico.
  3. Según el número de placas que se verterán, transfiera la cantidad apropiada de 1.5x BSK y antibiótico(s) a una botella estéril lo suficientemente grande como para contener toda la mezcla de chapado. Equilibrar en un baño maría a 56 °C durante ≥15 min.
  4. Equilibrar la agarosa fundida del autoclave o microondas en un baño maría a 56 °C durante ≥15 min.
  5. Después del equilibrio, añadir la cantidad determinada de agarosa al 2,1% a la botella con el BSK 1,5x (con antibiótico) y volver a poner la solución de recubrimiento en el baño maría a 42 °C durante 10-15 min.
    NOTA: Las temperaturas más altas pueden dañar o matar las espiroquetas36. Si utiliza el mismo baño de agua que el anterior, enfríe el baño de agua a 42-45 °C antes de iniciar el temporizador para el equilibrio. No deje que la solución de recubrimiento se equilibre a 42 °C durante más de 20 minutos o comenzará a solidificarse mientras vierte las placas.
  6. Durante el equilibrio, prepare las muestras de B. burgdorferi para ser plateadas. Transfiera la cantidad a chapar a un tubo centrífugo cónico estéril de 50 ml (consulte la Tabla de materiales).
    1. Si se coloca una cantidad inferior a 1,5 ml (<5% del volumen final de la placa de 30 ml), transfiera la muestra al nuevo tubo y agregue la mezcla de recubrimiento directamente a la muestra durante el recubrimiento.
    2. Para volúmenes mayores, transfiera el volumen deseado de cultivo al nuevo tubo y luego centrifugar a 6.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Decantar todo menos 100-500 μL del sobrenadante y utilizar el resto para resuspender el pellet completamente antes del chapado.
    3. Para las placas de control después del cocultivo, añadir ≥107 células de los clones donantes o receptores a tubos centrífugos cónicos estériles de 50 ml. Si el volumen es superior a 1,5 ml, centrifugar y resuspender el pellet como en el paso 7.6.2. Si se realizó un ensayo de transducción utilizando el fago precipitado con PEG, además del clon receptor, agregue 100-250 μL de la muestra de fagos en un tubo cónico estéril de 50 ml para el recubrimiento.
  7. Después de que la solución de recubrimiento se haya equilibrado a 42-45 °C durante 10-15 min, transferir 30 ml de la solución de recubrimiento a un tubo con la muestra adecuada; Inmediatamente dispense la mezcla de recubrimiento y la muestra en una placa etiquetada. Repita con una pipeta nueva para cada muestra a emplatar.
  8. Deje que las placas se solidifiquen durante 15-20 min y luego colóquelas en una incubadora a 33 °C suplementada con 5% deCO2. No invierta las placas durante al menos 48 h después de verterlas.
  9. Dependiendo de los antecedentes del clon receptor, verifique que las colonias aparezcan dentro de la agarosa en las placas de selección después de 10-21 días de incubación. Escoja al menos 5-10 colonias que crezcan en la placa en presencia de ambos antibióticos usando una pipeta de borosilicato 5.75 esterilizada con tapones de algodón (ver Tabla de materiales) e indíquelas en 1.5 ml de 1x BSK con los antibióticos apropiados.
  10. Cultivar las colonias inoculadas a 33 °C como en el paso 1.3 durante 3-5 días o hasta que alcancen una densidad de aproximadamente 20-40 espiroquetas por campo con un aumento de 200x utilizando microscopía de campo oscuro.
    NOTA: Una vez tamizadas (ver paso 8), las espiroquetas pueden congelarse para su almacenamiento a largo plazo a −80 °C mezclando un volumen igual de cultivo con una mezcla de 60% de glicerol y 40% 1x BSK esterilizado por filtración a través de un filtro de 0,22 μm.

8. Verificación de posibles transductores

NOTA: Examine los clones que crecen en placas en presencia de dos antibióticos para verificar que representan transductores verdaderos en el fondo anticipado (receptor). Estos métodos se basan en la amplificación, y potencialmente secuenciación, de regiones específicas por la reacción en cadena de la polimerasa. Los protocolos y prácticas detallados para realizar PCR en B. burgdorferi se describen en otra parte (para un ejemplo reciente, ver Seshu et al.37). Seleccione los cebadores utilizados para cribar los transductores en función de las cepas utilizadas. A continuación se describen algunas sugerencias sobre cómo abordar la detección de los transductores.

  1. Prepare los lisados de B. burgdorferi para la detección por PCR.
    NOTA: El siguiente protocolo se utiliza para producir lisados de B. burgdorferi lavados a partir de células cultivadas cultivadas como en el paso 7.9 para el análisis inmediato del ADN por PCR. Este método está diseñado para minimizar la interferencia de inhibidores potenciales en BSK, pero no se recomienda para producir ADN de alta calidad para secuenciación o almacenamiento. Para ello, utilice un protocolo o kit para la extracción total del genoma (véase la Tabla de materiales). Se recomienda encarecidamente que los lisados de los clones parentales (tanto las cepas donantes como las receptoras) también se preparen al mismo tiempo para incluirlos en cada análisis.
    1. Transfiera 500 μL de cada transductor potencial seleccionado y cultivado como en el paso 7.10 a un tubo de microcentrífuga limpio.
    2. Centrifugar los cultivos durante 10 min a 8.000 x g a temperatura ambiente.
    3. Retirar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 500 μL de TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Centrifugar durante 5 min a 8.000 x g a temperatura ambiente.
    4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet en 50 μL de agua con calidad de PCR. Hervir las muestras durante 10 min. Dejar enfriar brevemente, y luego centrifugar a 8.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    5. Para cada PCR, utilizar inmediatamente 2 μL de la parte superior de la muestra centrifugada; Evite molestar el pellet.
  2. Examinar los transductores potenciales para los genes específicos que codifican la resistencia a los antibióticos mediante PCR. Consulte la Tabla 4 para los cebadores para la detección de marcadores de resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en los ensayos de transducción.
    NOTA: Aunque es raro en nuestra experiencia, puede ocurrir una mutación espontánea a los antibióticos aminoglucósidos utilizados para la selección de ADN heterólogo en B. burgdorferi.
  3. Examine los transductores potenciales también utilizando otro marcador de cepa o clon para confirmar que el fondo es el del receptor. Incluya tanto el donante como el padre receptor en estos análisis. Detectar marcadores específicos de la cepa utilizando secuencias basadas en las cepas utilizadas y protocolos de laboratorio individuales para determinar la integridad de la cepa.
  4. Si intenta transducir en clones virulentos para su uso dentro del vector garrapata o huésped mamífero o para la comparación directa con otro clon, determine el contenido completo de plásmidos de los transductores y los clones originales. Esto se hace para asegurar el mismo contenido de plásmidos que el de la cepa comparativa o la presencia de los elementos genéticos necesarios para la propagación dentro del ciclo enzoótico, como se describe en otra parte 18,19,37,38,39.

Resultados

El uso de bacteriófagos para mover ADN entre cepas o clones de B. burgdorferi más fácilmente transformables que son recalcitrantes a la electrotransformación representa otra herramienta para la investigación molecular continua de los determinantes de la enfermedad de Lyme. El ensayo de transducción descrito en este documento puede modificarse según sea necesario para facilitar el movimiento de ADN entre cualquier clon de interés utilizando uno o dos antibióticos para la selección de posibles transducto...

Discusión

El uso de la transducción podría representar un método para superar al menos algunas de las barreras biológicas y técnicas asociadas con la electrotransformación de B. burgdorferi 1,4,13,37. En muchos sistemas, el bacteriófago puede mover el ADN del huésped (no profago) entre las células bacterianas mediante transducción generalizada o especializada 22,23,24,49,50.

Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

El autor desea agradecer a Shawna Reed, D. Scott Samuels y Patrick Secor por su útil discusión y a Vareeon (Pam) Chonweerawong por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Ciencias Biomédicas y becas de investigación de la facultad a Christian H. Eggers de la Escuela de Ciencias de la Salud de la Universidad de Quinnipiac.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)Millipore SigmaS2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)USA Scientific1450-0810holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)Millipore SigmaCAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)Thermo Fisher Scientific13-678-8Aautoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LEDot Scientific inc.AGLE-500
Bacto NeopeptoneGibcoDF0119-17-9
Bacto TC YeastolateGibco255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)Gemini Bio-Products700-104P
Chloroform (for molecular biology)Thermo Fisher ScientificBP1145-1CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)US BiologicalC5900-01cell culture grade
ErythromycinResearch Products International CorpE57000-25.0
Gentamicin reagent solutionGibco15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)Thermo Fisher ScientificBP350-500
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-500
Kanamycin sulfateThermo Fisher Scientific25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)Millipore SigmaSLGSM33SSto filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin CThermo Fisher ScientificBP25312CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamineMP Biomedicals, LLC100068
Oligonucleotides (primers for PCR)IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)G Biosciences786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)Thermo Fisher ScientificFB0875712
Petroff-Hausser counting chamberHausser scientificHS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glassHausser scientificHS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)Thermo Fisher ScientificBP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)Pel-Freez Biologicals31119-3heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettesUSA Scientific9750-9150
Sodium bicarbonateThermo Fisher ScientificBP328-500
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificBP358-1
Sodium pyruvateMillipore SigmaP8674-25G
Spectronic Genesys 5Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solutionMillipore SigmaS6501-50G
Trisodium citrate dihydrateMillipore SigmaS1804-500Gsodium citrate for BSK

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