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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo in cui un modello di xenotrapianto derivato dal paziente di leucemia linfoblastica acuta viene utilizzato come strategia per valutare e monitorare le tossicità associate alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico mirato al CD19.

Abstract

La terapia cellulare del recettore T dell'antigene chimerico (CART) è emersa come un potente strumento per il trattamento di più tipi di tumori maligni CD19 + , che ha portato alla recente approvazione da parte della FDA di diverse terapie cellulari CART (CART19) mirate al CD19. Tuttavia, la terapia cellulare CART è associata a un insieme unico di tossicità che portano la loro morbilità e mortalità. Ciò include la sindrome da rilascio di citochine (CRS) e la neuroinfiammazione (NI). L'uso di modelli murini preclinici è stato cruciale nella ricerca e nello sviluppo della tecnologia CART per valutare sia l'efficacia che la tossicità CART. I modelli preclinici disponibili per testare questa immunoterapia cellulare adottiva includono modelli murini singeneici, xenotrapianti, transgenici e umanizzati. Non esiste un singolo modello che rispecchi perfettamente il sistema immunitario umano e ogni modello ha punti di forza e di debolezza. Questo documento sui metodi mira a descrivere un modello di xenotrapianto derivato dal paziente utilizzando blasti leucemici da pazienti con leucemia linfoblastica acuta come strategia per valutare le tossicità associate a CART19, CRS e NI. Questo modello ha dimostrato di ricapitolare le tossicità associate a CART19 e l'efficacia terapeutica come visto nella clinica.

Introduzione

La terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico T (CART) ha rivoluzionato il campo dell'immunoterapia del cancro. Ha dimostrato di avere successo nel trattamento della leucemia linfoblastica acuta recidivante / refrattaria (LLA), del linfoma a grandi cellule B, del linfoma mantellare, del linfoma follicolare e del mieloma multiplo 1,2,3,4,5,6,7, portando a recenti approvazioni della FDA. Nonostante il successo iniziale negli studi clinici, il trattamento con terapia cellulare CART provoca tossicità spesso gravi e occasionalmente letali. Le tossicità più comuni dopo la terapia cellulare CART includono lo sviluppo di CRS e NI, noti anche come sindrome da neurotossicità associata alle cellule effettrici immunitarie (ICANS)8,9. La CRS è causata dalla sovraattivazione e dalla massiccia espansione delle cellule CART in vivo, che porta alla successiva secrezione di più citochine infiammatorie, tra cui interferone-γ, fattore di necrosi tumorale α, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) e interleuchina-6 (IL-6). Ciò si traduce in ipotensione, febbre alta, sindrome da perdita capillare, insufficienza respiratoria, insufficienza multiorgano e, in alcuni casi, morte10,11. La CRS si sviluppa nel 50-100% dei casi dopo terapia cellulare CART1911,12,13. ICANS è un altro evento avverso unico associato alla terapia cellulare CART ed è caratterizzato da edema cerebrale generalizzato, confusione, ottunndazione, afasia, debolezza motoria e, occasionalmente, convulsioni 9,14. Qualsiasi grado di ICANS si verifica fino al 70% dei pazienti e i gradi 3-4 sono riportati nel 20-30% dei pazienti 5,10,15,16. Nel complesso, CRS e ICANS sono comuni e possono essere fatali.

La gestione di ICANS dopo terapia cellulare CART è impegnativa. La maggior parte dei pazienti con ICANS sperimenta anche CRS17, che spesso può essere trattata con l'antagonista del recettore IL-6 tocilizumab o steroidi18. Un precedente rapporto ha rivelato che l'intervento precoce con tocilizumab ha ridotto il tasso di CRS grave, ma non ha influenzato l'incidenza o la gravità di ICANS19. Attualmente, non esiste un trattamento efficace o un agente profilattico per ICANS ed è fondamentale studiare strategie preventive20.

Si ritiene che le cellule mieloidi e le citochine/chemochine associate siano i principali motori dello sviluppo di CRS e ICANS21. Mentre la CRS è direttamente correlata all'estrema elevazione delle citochine e all'espansione delle cellule T, la fisiopatologia di ICANS è in gran parte sconosciuta22,23. Pertanto, è imperativo stabilire un modello murino che riassuma queste tossicità dopo la terapia cellulare CART per studiare i meccanismi e sviluppare strategie preventive.

Esistono diversi modelli animali preclinici attualmente utilizzati per studiare, ottimizzare e convalidare l'efficacia delle cellule CART, nonché per monitorare le loro tossicità associate. Questi includono topi singeneici, xenograft, transgenici immunocompetenti, transgenici umanizzati e xenograft derivati dal paziente, oltre a modelli di primati. Tuttavia, ciascuno di questi modelli presenta degli svantaggi e alcuni non riflettono i veri problemi di efficacia o sicurezza delle celle CART24,25. Pertanto, è imperativo scegliere attentamente il modello migliore per gli obiettivi previsti dello studio.

Questo articolo cerca di descrivere la metodologia utilizzata per valutare le tossicità associate alle cellule CART, CRS e NI, utilizzando un modello in vivo di xenotrapianto derivato da pazienti (PDX) ALL (Figura 1). In particolare, nei metodi qui descritti, le cellule CART19 generate nel laboratorio degli autori vengono utilizzate seguendo i protocolli precedentemente descritti. In breve, le cellule T umane vengono isolate da cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) di donatori sani tramite una tecnica di gradiente di densità, stimolate con perline CD3 / CD28 il giorno 0 e trasdotte lentiviralmente il giorno 1 con CAR composte da un frammento variabile a catena singola mirato a CD19 fuso a domini di segnalazione 4-1BB e CD3ζ. Queste cellule CART vengono quindi espanse, de-beaded il giorno 6 e crioconservate il giorno 8 26,27,28,29,30. Come descritto in precedenza, i topi sono sottoposti a trattamento linfodepletivo, seguito dalla somministrazione di blasti leucemici derivati dal paziente (LLA)28. In primo luogo, l'attecchimento del tumore viene verificato tramite raccolta di sangue sottomandibolare. A seguito della creazione di un carico tumorale appropriato, le cellule CART19 vengono somministrate ai topi. Quindi, i topi vengono pesati quotidianamente per valutare il benessere. La risonanza magnetica per piccoli animali (MRI) viene eseguita per valutare NI, insieme al sanguinamento della coda per valutare l'espansione delle cellule T e la produzione di citochine / chemochine. Le tecniche descritte di seguito sono altamente raccomandate per essere utilizzate come modello per studiare le tossicità associate alle cellule CART in un modello PDX.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) della Mayo Clinic, dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) e dell'Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04).

NOTA: Tutti i materiali utilizzati per lavorare con i topi devono essere sterili.

1. Iniezione di busulfan ai topi NSG

  1. Ottenere topi maschi, di 8-12 settimane, immunocompromessi, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) e pesarli prima dell'iniezione.
    NOTA: Per la significatività statistica, si raccomanda di utilizzare almeno cinque topi per gruppo e di ripetere questo esperimento almeno una volta con topi femmina.
  2. Preparare busulfan per iniezione intraperitoneale (i.p.). Utilizzando una siringa da insulina da 1 ml, riempire lentamente e con attenzione la siringa con esattamente 30 mg/kg di busulfan, seguita da iniezione endovenosa nei topi, e rimetterli nella gabbia.

2. Iniezione di TUTTI i blasti derivati dal paziente (CD19+) ai topi NSG

NOTA: Questo protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la biosicurezza della Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).

  1. Raccogliere blasti leucemici primari dal sangue periferico di pazienti con LLA recidivante e refrattaria.
  2. Preparare le cellule bersaglio per l'iniezione endovenosa (e.v.).
    1. Contare le cellule bersaglio CD19+ utilizzando un emocitometro e registrare il volume finale e la concentrazione delle cellule.
      NOTA: Per determinare la vitalità cellulare, si consiglia vivamente di utilizzare il blu di tripano durante il conteggio delle cellule.
    2. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Risospendere il pellet cellulare in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) ad una concentrazione finale di 50 × 106 cellule/ml in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e posizionare su ghiaccio.
    4. Vortice di dita il tubo di microcentrifuga da 1,5 mL contenente le cellule bersaglio fino a quando le cellule sono completamente omogeneizzate.
    5. Utilizzando una siringa da insulina da 1 ml, riempire lentamente e con attenzione la siringa con esattamente 100 μL delle cellule bersaglio preparate e far scorrere la siringa per rimuovere le bolle.
      NOTA: Il volume di 100 μL somministrerà 5 × 106 cellule a ciascun topo.
    6. Posizionare i topi sotto una luce calda per 5-10 minuti. Una volta che la vena caudale diventa ingorgata e più visibile ad occhio nudo, posizionare i topi in una camera di confinamento / contenimento appropriata.
    7. Pulire la coda del topo con un tampone imbevuto di alcool. Iniettare le cellule bersaglio direttamente nella vena della coda (e.v.) e riposizionare il topo nella gabbia. Dopo l'inoculazione delle cellule bersaglio, monitorare i topi quotidianamente o come raccomandato dal comitato etico animale locale.

3. Valutazione dell'attecchimento tumorale

  1. A partire da 6 settimane dopo l'iniezione della cellula bersaglio, valutare l'attecchimento del tumore utilizzando la citometria a flusso per misurare l'espressione delle cellule CD19+ nel sangue periferico.
  2. Saggio del sangue periferico per valutare l'espansione di CD19+
    1. Prelevare il sangue dai topi 6-8 settimane dopo l'iniezione di cellule CART19.
      NOTA: Diversi metodi possono essere utilizzati per prelevare il sangue. Per questo protocollo, la raccolta del sangue sottomandibolare è il metodo preferito di scelta.
    2. Anestetizzare il topo con isoflurano in una camera di induzione con isoflurano al 5%. Una volta ottenuta l'anestesia, mantenere all'1-3% l'isoflurano inalato attraverso un cono nasale.
      NOTA: Si consiglia vivamente di applicare unguento oftalmico per prevenire la secchezza oculare.
    3. Rimuovere il mouse dalla camera e tenere il topo con la mano non dominante afferrando la pelle flaccida sul collo. Forare la vena con una lancetta leggermente dietro la mandibola.
      NOTA: Solo la punta dell'ago (1-2 mm) è necessaria per entrare nella vena.
    4. Mentre il sangue gocciola, raccogliere almeno 50 μL in un tubo rivestito di eparina e mescolare bene invertendo il tubo su e giù più volte. Trasferire 30 μL di sangue in un tubo di polistirene a fondo rotondo da 5 ml.
      NOTA: Per il sangue rimanente, ruotare lungo il tubo a 17.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il siero (strato di surnatante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL pulita ed etichettata e conservarla a -80 °C (per l'uso nel test delle citochine).
    5. Aggiungere 2 mL di tampone di lisi (10x tampone lisante a base di cloruro di ammonio diluito a 1x utilizzando acqua priva di nucleasi) nel tubo inferiore rotondo da 5 mL contenente il sangue. Mescolare molto bene vorticando il tubo. Incubare il tubo a temperatura ambiente per 20 minuti per garantire una corretta lisi dei globuli rossi.
    6. Aggiungere 2 ml di tampone di flusso (PBS, 0,2 g/L di cloruro di potassio, 0,2 g/L di fosfato di potassio monobasico, 8 g/L di cloruro di sodio e 1,15 g/L di fosfato di sodio bibasico contenente il 2% di siero fetale bovino e l'1% di azoturo di sodio).
    7. Centrifugare il tubo a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante e aggiungere 2 ml di buffer di flusso. Ripetere questa fase di lavaggio 2x.
    8. Decantare accuratamente il contenuto del tubo. Osservare la piccola quantità di liquido con un pellet rimasto nel tubo. Aggiungere 100 μL di buffer di flusso e risospendere molto bene.
    9. Trasferire tutto il liquido rimanente nel tubo di flusso da 5 mL in una piastra da 96 pozzetti. Assicurati che ogni campione sia etichettato correttamente. Aggiungere 100 μL di buffer di flusso ai pozzetti corrispondenti e centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 650 × g per 3 minuti a 4 °C.
  3. Valutare l'espansione delle cellule bersaglio CD19+ mediante citometria a flusso (Figura 2).
    1. Preparare una miscela master contenente 0,3 μL di colorante vivo/morto, 0,13 μg (2,5 μL) di anticorpo CD19 antiuomo, 0,06 μg (2,5 μL) di anticorpo CD45 antiuomo, 5 μg (2,5 μL) di CD45 antitopo e 42,2 μL di tampone di flusso per un totale di 50 μL per campione. Incubare al buio a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Lavare con 150 μL di tampone di flusso seguito da centrifugazione a 650 × g per 3 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 195 μL di tampone di flusso e 5 μL di perline di conteggio.
    3. Acquisire su un citometro a flusso per determinare il livello di espressione delle cellule CD19+ . Ai fini del gating e dell'analisi, prima gate la popolazione di interesse (CD19+) in base alle caratteristiche di dispersione in avanti rispetto a quelle laterali, seguita da una singola popolazione di gating, e poi cellule vive. Una volta che le cellule vive sono gated, valutare la popolazione CD45 umana rispetto alla popolazione CD45 del topo e, dalla popolazione umana, eliminare la popolazione target CD19 + .
  4. Quantificare per determinare la quantità presente in 70 μL, e quindi esprimere in celle/μL usando l'equazione (1):
    Conta assoluta delle cellule CD19+ = ([cellule CD19+/sfere di conteggio] × numero di sfere di conteggio entro 5 μL)/70
    NOTA: Ripetere il test del sangue periferico ogni 5 giorni per valutare l'espansione delle cellule CD19+ . Raccogliere non più di 200 μL di sangue cumulativamente ogni 2 settimane in conformità con le linee guida del comitato etico animale locale. Una volta che i topi hanno raggiunto un carico di malattia di ≥10 cellule/μL, randomizzare a cellule CART19 o gruppi di controllo (sezione 4).

4. Somministrazione di cellule CART19 in vivo

  1. Preparazione delle cellule CART19 (~Giorno 80):
    NOTA: La generazione di celle CART19 è stata precedentemente pubblicata 27,30,31. Questa procedura deve essere eseguita all'interno di un armadio di biosicurezza di livello 2+ utilizzando tecnica asettica e dispositivi di protezione individuale.
    1. Scongelare le celle CART19 in un contenitore a bagnomaria (37 °C). Quindi, lavare le cellule in mezzo di cellule T calde (TCM) per rimuovere il dimetilsolfossido.
      NOTA: La MTC è composta da siero AB umano (v / v) al 1%, 1% da penicillina-streptomicina-glutammina (v / v) e da cellule ematopoietiche prive di siero 27,30.
    2. Centrifugare le cellule CART19 a 300 × g per 8 minuti a 4 °C e risospendere in MTC caldo fino a una concentrazione finale di 2 × 106 cellule/ml. Lasciare riposare le cellule CART in un incubatore (37 °C, 5% CO2) durante la notte, ma per non più di 16 ore.
  2. Somministrazione di cellule CART19 tramite iniezione endovenosa (Giorno ~80)
    1. Contare le cellule CART19 e centrifugare a 300 × g per 8 minuti a 4 °C.
    2. Risospendere le cellule CART19 con 10 ml di PBS e centrifugare a 300 × g per 8 minuti a 4 °C.
    3. Risospendere le cellule CART19 a una concentrazione finale di 40 × 106 cellule/ml con PBS, trasferire le cellule in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 mL e metterle su ghiaccio.
    4. Eseguire iniezioni di vene della coda delle cellule CART19 (come descritto sopra) iniettando 100 μL di cellule risospese e.v.
      NOTA: Un volume di 100 μL somministrerà 4 × 106 cellule a ciascun topo. Includere un gruppo di topi non trattati come controllo negativo.

5. Valutazione della tossicità associata alle cellule CART19

  1. Dopo la somministrazione di cellule CART19, monitorare i topi 2 volte al giorno per valutare eventuali cambiamenti nel loro benessere, come debolezza motoria, corpo curvo e perdita di peso corporeo.
    NOTA: Tutti questi cambiamenti fisici sono correlati con i sintomi della CRS in questo modello28.
  2. Una volta che i topi iniziano a sviluppare debolezza motoria e riduzione del peso (riduzione del 10-20% rispetto al basale), raccogliere sangue periferico per analizzare il carico tumorale e condurre l'isolamento sierico per le citochine secondo la metodologia descritta nella sezione 3 (Figura 3).
  3. Conservare le provette di microcentrifuga sierica a -80 °C e utilizzare i sieri per analizzare le chemochine e le citochine utilizzando un test multiplex (Figura 4).
    NOTA: Se i topi mostrano segni di paralisi degli arti posteriori, appaiono moribondi o letargici, e la perdita di peso è > il 20% del loro peso corporeo fino al punto che limita la loro capacità di raggiungere cibo e / o acqua, allora saranno sottoposti a eutanasia.

6. Imaging MRI

NOTA: Uno scanner MRI preclinico (per piccoli animali) con un magnete a foro verticale è stato utilizzato per la risonanza magnetica in vivo e l'acquisizione di immagini32,33.

  1. Mescolare 120 μL di gadolinio + 880 μL di soluzione salina e caricare in una siringa da insulina da 1 ml. Iniettare 100 μL in ciascun topo (i.p.).
    NOTA: Il gadolinio deve essere iniettato 15-20 minuti prima dell'inizio dell'esperimento.
  2. Anestetizzare il topo usando isoflurano (2-3%) in una camera di induzione per 10-15 minuti.
    NOTA: Si consiglia vivamente di applicare unguento oftalmico per prevenire la secchezza degli occhi.
  3. Posizionare la spina del mouse sulla sonda della culla compatibile con il roditore. Quindi, procedere a posizionare il mouse agganciando i denti alla barra del morso.
  4. Tirare la testa del mouse nella bobina del volume di 25 mm e regolare il cono del naso legato al sistema di anestesia isoflurano. Stringere la manopola della barra del morso per mantenere la posizione per tutta la durata della scansione.
    NOTA: Se si esegue una risonanza magnetica con mezzo di contrasto, assicurarsi che il gadolinio (in questo caso) o l'agente di contrasto vengano iniettati almeno 10 minuti prima di inserire l'apparecchio nel magnete. Durante tutto il tempo dell'imaging, i topi saranno anestetizzati dall'inalazione del 2-3% di isoflurano nell'aria attraverso il cono del naso e la loro frequenza respiratoria sarà monitorata simultaneamente.
  5. Per la valutazione della respirazione, utilizzare un dispositivo di monitoraggio respiratorio / respiratorio.
    NOTA: È importante valutare anche la temperatura corporea al fine di prevenire possibili ipotermie dovute all'esposizione prolungata all'anestesia. Si consiglia di utilizzare cuscinetti termici per controllare la temperatura corporea.
    1. Collegare la sonda del monitor di respirazione vicino al diaframma e fissarla con nastro chirurgico. Mantenere la frequenza respiratoria tra 20-60 respiri al minuto in modo che le condizioni del topo siano stabili.
      NOTA: questa frequenza fornisce immagini MRI più stabili e previene gli artefatti di movimento nell'immagine acquisita. Se la frequenza respiratoria è superiore all'intervallo 20-60 respiri al minuto, aumentare la concentrazione di isoflurano. Se la frequenza respiratoria è inferiore a 20 respiri al minuto, l'anestesia è troppo profonda; Pertanto, la concentrazione deve essere ridotta.
  6. Inserire la sonda animale nel foro di piccole dimensioni all'interno del sistema di risonanza magnetica per piccoli animali a foro verticale. Regolare la testa dell'animale al centro della bobina. Fissare l'apparecchio con la serratura in modo che possa stare in posizione verticale e collegare lo strumento al computer.
  7. Aprire e utilizzare il software (ad esempio, Paravision) per impostare le posizioni di scansione e i tipi di scansioni. Determinare le posizioni assiali e sagittali ottimali mantenendoli coerenti per tutti i gruppi sperimentali.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare l'acquisizione di una scansione di prova come riferimento prima delle scansioni MRI a lunghezza intera.
  8. Procedere con la raccolta dei dati MRI (come precedentemente descritto32,34,35,36). Ottenere immagini MRI pesate sia T1 che T2 utilizzando la configurazione suggerita menzionata di seguito.
    1. Per le immagini MRI pesate in T1, utilizzare la sequenza multislice multiecho (MSME) pesata T1 con un tempo di ripetizione (TR) di 300 ms, un tempo di eco (TE) di 9,5 ms, un campo visivo (FOV) di 4 cm x 2 cm x 2 cm e una matrice di 192 x 96 x 96.
    2. Per le immagini MRI pesate in T2, utilizzare una sequenza Multislice Multiecho (MSME) con un TR di 300 ms, un TE di 9,5 ms, un FOV di 4 cm x 2 cm x 2 cm e una matrice di 192 x 96 x 96 è stata utilizzata.
  9. Una volta completate le scansioni, rimuovere la sonda dal foro. Estrarre delicatamente il mouse rimuovendo i denti dalla barra del morso. Monitorare l'animale in una gabbia separata fino a quando non è completamente cosciente e ha riacquistato un'adeguata funzione motoria.
  10. Dopo l'estrazione dei dati dal software, utilizzare il software di analisi per la quantificazione e il rendering del volume 3D (Figura 4) delle regioni di iperintensità.
    NOTA: Se possibile, si consiglia vivamente di avere due osservatori in cieco separati per l'analisi dei dati.

Risultati

Lo scopo di questo protocollo è valutare le tossicità associate alle cellule CART utilizzando un modello di topi PDX da cellule tumorali di pazienti con LLA (Figura 1). In primo luogo, i topi NSG hanno ricevuto iniezioni i.p. di busulfan (30 mg / kg) con l'obiettivo di immunosopprimerli e facilitare l'attecchimento delle cellule CART28. Il giorno seguente, hanno ricevuto ~ 5 × 106 PBMC (i.v.) derivati da TUTTI i pazienti. I topi sono stati monitorati per...

Discussione

In questo rapporto è stata descritta una metodologia per valutare le tossicità associate alle cellule CART utilizzando un modello ALL PDX. Più specificamente, questo modello cerca di imitare due tossicità potenzialmente letali, CRS e NI, che i pazienti spesso sperimentano dopo l'infusione di cellule CART. Riassume molti segni distintivi delle tossicità CART osservate nella clinica: perdita di peso, disfunzione motoria, neuroinfiammazione, produzione di citochine infiammatorie e chemochine e infiltrazione di diverse ...

Divulgazioni

S.S.K. è inventore di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Novartis (attraverso un accordo tra Mayo Clinic, University of Pennsylvania e Novartis) e a Mettaforge (attraverso Mayo Clinic). R.L.S. e S.S.K. sono inventori di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Humanigen. S.S.K. riceve finanziamenti per la ricerca da Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs e Lentigen.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato in parte supportato attraverso il National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), il Dipartimento della Difesa (CA201127), la pipeline K2R DELLA Mayo Clinic (S.S.K.), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (S.S.K.) e la Predolin Foundation (R.L.S.). Inoltre, vorremmo ringraziare lo staff della Mayo Clinic NMR Core Facility. La Figura 1 è stata creata nel BioRender.com

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
 APC Anti-Human CD19Biolegend302211
Alcohol Prep PadWecol6818
Analyze 14.0 softwareAnalyzeDirect Inc.N/Ahttps://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)Akorn17478-062-35Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution BD349202Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringesBD329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45Biolegend304032
Bruker Avance II 7 Tesla Bruker BiospinN/AMRI machine
Busulfan (NSC-750)SelleckchemS1692
CountBright absolute counting beadsInvitrogenC36950
CytoFLEX System B4-R2-V2Beckman CoulterC10343flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144 
ERT Control/Gating Module SA InstrumentsModel 1030Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
HemocytometerBright-LineZ359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; USCorning35-060-CI
Isoflurane (Liquid)Sigma-Aldrich792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
Microvette 500 Lithium heparinSarstedt20.1345.100Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads PanelMillipore SigmaHCYTMAG-60K-PX38Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
OmniscanGe Healthcare Inc.0407-0690-10Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45Biolegend103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
Round Bottom Polysterene Test tubeCorning352008
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
Stainless Steel Surgical BladeBard-Parker371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

Riferimenti

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin's lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. Cancer Research. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

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