Метод электропорации для преобразования риккетсии spp. с флуоресцентным белково-экспрессирующим челночным вектором в клеточных линиях клещей

Резюме

Электропорация — это быстрый, широко распространенный метод введения экзогенной ДНК в род Rickettsia. Данный протокол обеспечивает полезный метод электропорации для трансформации облигатных внутриклеточных бактерий рода Rickettsia.

Аннотация

Риккетсиозы вызываются широким спектром облигатных внутриклеточных бактерий, принадлежащих к роду Rickettsia , которые могут передаваться позвоночным хозяевам через укус инфицированных членистоногих векторов. На сегодняшний день возникающие или вновь возникающие эпидемические риккетсиозы остаются риском для здоровья населения из-за трудностей в диагностике, поскольку методы диагностики ограничены и не стандартизированы или общедоступны. Ошибочный диагноз, возникающий в результате отсутствия распознавания признаков и симптомов, может привести к задержке лечения антибиотиками и плохим результатам для здоровья. Всестороннее понимание характеристик риккетсии в конечном итоге улучшит клиническую диагностику, оценку и лечение с улучшенным контролем и профилактикой заболевания.

Функциональные исследования риккетсиальных генов имеют решающее значение для понимания их роли в патогенезе. В данной работе описана процедура электропорации штамма Rickettsia parkeri Tate's Hell с челночным вектором pRAM18dSFA и селекция трансформированного R. parkeri в культуре клеток клещей с антибиотиками (спектиномицин и стрептомицин). Также описан способ локализации трансформированного R. parkeri в клещевых клетках с использованием конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии, полезной методики проверки трансформации в векторных клеточных линиях. Подобные подходы подходят и для трансформации других риккетсий.

Введение

Риккетсиозы вызываются широким спектром облигатных внутриклеточных бактерий, которые принадлежат к роду Rickettsia (семейство Rickettsiaceae, отряд Rickettsiales). Род Rickettsia классифицируется на четыре основные группы на основе филогенетических характеристик ^1,2: группа пятнистой лихорадки (SFG), которая содержит те риккетсии, которые вызывают наиболее тяжелые и смертельные клещевые риккетсиозы (например, Rickettsia rickettsii, возбудитель пятнистой лихорадки Скалистых гор), группа тифа (TG, например, Rickettsia prowazekii, возбудитель эпидемического тифа), переходная группа (TRG, например, Rickettsia felis, возбудитель пятнистой лихорадки, переносимой блохами), и предковая группа (AG, например, Rickettsia bellii).

Среди старейших известных трансмиссивных заболеваний риккетсиозы в основном приобретаются после передачи патогенов через укусы инфицированных членистоногих переносчиков, включая клещей, блох, вшей и клещей ^3,4. Хотя открытие эффективных антибиотиков улучшило результаты лечения, возникающие и вновь возникающие эпидемические риккетсиозы продолжают бросать вызов традиционным стратегиям профилактики и контроля. Таким образом, всестороннее понимание взаимодействия риккетсии/хозяина/вектора в конечном итоге создаст прочную основу для разработки новых подходов к профилактике и лечению этих древних заболеваний.

В природе горизонтальный перенос генов (HGT) у бактерий происходит путем конъюгации, трансдукции и трансформации⁵. Бактериальная трансформация in vitro использует эти концепции HGT, хотя внутриклеточная природа риккетсий представляет некоторые проблемы. Ограниченные условия роста и плохо изученные системы конъюгации и трансдукции у разных видов риккетсий препятствовали применению методов конъюгации и трансдукции у риккетсий ^6,7,8. По сравнению с другими облигатными внутриклеточными бактериальными родами (например, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma и Ehrlichia), род Rickettsia отличается в отношении стратегий роста и репликации в цитоплазме клеток, что создает специфические проблемы для генетической модификации риккетсий из-за их уникальных особенностей образа жизни⁹.

Первоначальное препятствие, которое необходимо преодолеть при попытке генетической модификации риккетсий, заключается в достижении успешной трансформации. Таким образом, разработка осуществимого подхода с высокой эффективностью трансформации была бы чрезвычайно ценной для разработки генетических инструментов для риккетсий. Здесь мы сосредоточимся на электропорации, широко признанном методе трансформации, который был использован для успешного введения экзогенной ДНК в несколько видов риккетсий, включая Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii и Rickettsia buchneri 10,11,12 ^,13,14,15,16.

В данной статье описывается процедура электропорации штамма R. parkeri Tate's Hell (присоединение: GCA_000965145.1) с челночным вектором pRAM18dSFA, полученным из штамма Rickettsia amblyommatis AaR/SC плазмиды pRAM18, спроектированного для кодирования mKATE, дальнекрасого флуоресцентного белка, и aadA, придающего резистентность к спектиномицину и стрептомицину 13,15,20. Трансформированные R. parkeri жизнеспособны и стабильно поддерживаются при выделении антибиотиков в клеточных линиях клещей. Кроме того, показано, что локализация трансформированного R. parkeri в живых клетках клещей с помощью конфокальной микроскопии может быть использована для оценки качества скоростей трансформации в векторных клеточных линиях.

протокол

1. Размножение и очистка R. parkeri из культуры клещевых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры культивирования клеток должны выполняться в шкафу биобезопасности класса II.

1. Подготовка R. parkeri-инфицированные клетки клещей
   1. Выращивайте клетки ISE6 в колбах для культивирования клеток размером^{25 см2} при 34 °C в 5 мл среды L15C300¹⁷, дополненных 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 5% триптозно-фосфатным бульоном (TPB) и 0,1% липопротеиновым концентратом (LPC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ISE6 (клеточная линия эмбриона Ixodes scapularis) является клеточной линией клещей, широко используемой во многих лабораториях и, таким образом, является важной моделью для изучения взаимодействия клещей и патогенов 17,18,19. Скорость роста клеток ISE6 медленнее, чем у клеток млекопитающих, со временем удвоения популяции ≥72 ч. Например, клеткам ISE6, субкультивированным из 100% сливающейся культуры в соотношении 1:5, потребуется 3-4 недели, чтобы восстановить 100% слияние. Здоровые клетки ISE6, как правило, округляются с многочисленными прилипшими нитями¹⁷.
   2. Подсчитайте клетки ISE6 с помощью гемоцитометра под световым микроскопом. Использовать в концентрации ~10⁶ клеток/мл (100% слияние).
      1. Осторожно промойте клетки из колбы средой и рассейте клетки путем пипетирования, чтобы получить однородную клеточную суспензию. Добавьте 20 мкл клеточной суспензии между гемоцитометром и накройте стекло, чтобы подсчитать клетки с помощью гемоцитометра.
   3. Добавьте бесклеточный хозяин дикого типа R. parkeri²⁰ (среднее число: 5 × 10^7-10 × 10⁷) в клеточные культуры ISE6 в колбах для клеточных культур^{по 25 см2} . Инкубируют инфицированные культуры клеток R. parkeri при 34 °C в 5 мл полной среды, состоящей из среды L15C300, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% бикарбоната натрия (NaHCO₃) и 25 мМ HEPES до заражения 90%-100% клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень инфицирования R. parkeri в клетках ISE6 определяется окрашиванием Giemsa, а время инкубации для достижения 90%-100% инфекции колеблется в среднем от 5 дней до 7 дней.
   4. Определите скорость заражения с помощью окрашивания Giemsa.
      1. В шкафу биобезопасности повторно суспендируют инфицированные клеточные культуры и переносят 50 мкл суспензии в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
      2. Разбавить суспензию полной средой (разведение 1:5) и центрифугу 100 мкл на предметные стекла микроскопа с помощью центрифуги при 113 × г в течение 5 мин. Чтобы сохранить живое R. parkeri , используйте центрифугу с герметичным ротором, который предназначен для удаления из центрифуги. Это позволяет транспортировать герметичный ротор внутрь и из капота.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку R. parkeri все еще живы до центрифугирования, образец необходимо содержать до тех пор, пока риккетсии не будут убиты. Таким образом, центрифуга, используемая для вращения культуры R. parkeri на слайде, должна иметь герметичный ротор, который предназначен для поднятия из центрифуги. С ротором в ламинарной проточной вытяжке загрузите образцы в узел слайда воронкообразного микроскопа, повторно запечатайте ротор и поместите герметичный ротор обратно в центрифугу. Затем включите центрифугу, и образцы осаждаются на предметные стекла микроскопа. После завершения пробега снимите герметичный ротор с центрифуги и поместите его в ламинарную вытяжку. Там откройте крышку ротора и разгрузите затвор воронки-микроскопа внутри капота. После высыхания погрузите стекла микроскопа в абсолютный метанол, который убивает все патогены. Воронки и металлические носители погружены в разбавленный DMQ, который убивает R. parkeri.
      3. Высушите горки на воздухе и зафиксируйте в абсолютном метаноле на 5 мин при комнатной температуре (RT).
      4. Окрашивайте слайды пятном Giemsa (4% в буфере Соренсона, рН 6,6) в течение 30 мин при 37 °C и смывайте водой в течение 5 с.
      5. Определить процент заражения (количество клеток, инфицированных риккетсиями/100 клеток) с помощью световой микроскопии.
         ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны типичные результаты окрашивания Giemsa.
2. Приготовление бесклеточного R. parkeri
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда 90%-100% клеток в культуре инфицированы, риккетсии должны быть выделены из клеток ISE6 и должна быть выполнена электропорация.
   1. Добавьте стерильную зернистость из карбида кремния 60-90 в стерильные микроцентрифужные трубки объемом около 0,2 мл.
   2. Удалите 2 мл среды из 100% R. parkeri-инфицированных культур (шаг 1.1.3) и повторно суспендируйте клетки в оставшихся 3 мл среды.
   3. Переложите равные части этой суспензии в трубы, подготовленные на этапе 1.2.1.
   4. Вращайте каждую трубку на высокой скорости в течение 30 с, а затем поместите трубки на лед. Дайте песку осесть в течение нескольких секунд под действием силы тяжести.
   5. В шкафу биобезопасности класса II иметь готовый стерильный шприц Luer-lock объемом 5 мл с вытянутым плунжером и концом плунжера, закрепленным в полистирольной основе для конических труб объемом 15 мл.
   6. Используя стерильный, 1 мл барьерный наконечник пипетки, установленный на подходящем пипеторе, удалите супернатант вихревого лизата ячейки из трубки, следя за тем, чтобы не аспирировать песок. Вставьте наконечник пипетки в отверстие ступицы шприца и вытолкните содержимое в шприц с мягким давлением. В качестве альтернативы используйте стерильную барьерную пипетку Пастера 2 мл, управляемую резиновой колбой.
   7. Прикрепите стерилизованный фильтр размером пор 2 мкм к шприцевому концентратору и фильтруйте культуру R. parkeri со стадии 1,2,6 в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.
   8. Соберите R. parkeri путем центрифугирования при 13 600 × г при 4 °C в течение 5 мин и выбросьте супернатант.
   9. Повторно суспендируют гранулу в 1,2 мл ледяной сахарозы 300 мМ и центрифугу снова при 13 600 × г при 4 °C в течение 5 мин. Повторите ресуспензию и центрифугирование в общей сложности две промывки сахарозы.
   10. Смешайте гранулы R. parkeri в одну охлажденную стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл в 50 мкл ледяной сахарозы 300 мМ на трансформацию. Поскольку одна колба R. parkeri размером^{25 см2} обеспечивает достаточное количество риккетсий для двух-трех превращений, добавляют 100-150 мкл 300 мМ холодной сахарозы.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При желании количество риккетсий может быть рассчитано с помощью счетной камеры Петроффа-Хауссера. При использовании начальной прививки 5 × 10⁷ -10 × 10⁷ бесклеточных R. parkeri, в среднем потребуется 5-7 дней, чтобы достичь 90%-100% инфекции, в результате чего будет примерно 5 × 10^7-10 × 10¹⁰ бесклеточных R. parkeri.
   11. Аккуратно повторно суспендируйте гранулу путем пипетки до тех пор, пока она не будет полностью диспергирована. Разделите образец на порции по 50 мкл в охлажденных, стерильных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При желании жизнеспособность риккетсии может быть оценена с помощью проточной цитометрии после окрашивания флуоресцентным красителем ²¹.

2. Трансформация R. parkeri с плазмидой pRAM18dSFA

1. На льду добавьте 3 мкг свободной от эндотоксинов плазмиды pRAM18dSFA^ДНК 13,15,20 в каждую трубку, содержащую 50 мкл суспензии R. parkeri, и осторожно, но тщательно перемешайте смесь кончиком пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При получении плазмидной ДНК используйте набор для очистки, который включает в себя этап удаления эндотоксинов для получения плазмидной ДНК²³ без эндотоксинов. Мы обнаружили, что диапазон плазмидных концентраций от 1 мкг до 3 мкг на 50 мкл суспензии R. parkeri приводил к успешным превращениям, тогда как увеличение количества плазмиды до 10 мкг ингибировало трансформацию.
2. Переложите вышеуказанную смесь ДНК и R. parkeri в охлажденную, стерильную электропорационную кювету с зазором 0,1 см (осторожно постучите по кювете до равномерного распределения смеси) и дайте ей постоять на льду в течение 10-30 мин.
3. Удалите среду из 100% сливающейся культуры клеток ISE6 и повторно суспендируйте клеточные слои в 1,5 мл свежей среды с буфером NaHCO₃ и HEPES (описанным выше на этапе 1.1.3). Используйте одну колбу сливающихся клеток для каждого преобразования.
4. Перенесите повторно суспендированные клетки в стерильную микроцентрифужную трубку объемом 2 мл (одна трубка на 25^см2 колбы клеток ISE6).
5. Электропорат смеси R. parkeri/pRAM18dSFA при 1,8 кВ, 200 Ом, 25 мкФ с помощью электропоратора.
6. Используя стерильную, удлиненную передаточную пипетку с тонким наконечником, переведите небольшое количество клеточной суспензии ISE6 (этап 2.4) в кювету и осторожно потяните жидкость вверх и вниз, чтобы промыть кювету. Переложите смесь в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую оставшуюся часть клеточной суспензии ISE6, и осторожно смешайте трансформационную смесь с клетками.
7. Центрифугируйте преобразованные образцы при 700 × g в течение 2 мин при RT, а затем увеличьте скорость центрифугирования до 13 600 × g в течение 1 мин больше при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Две скорости центрифугирования способствуют риккетсиальному связыванию с клетками и входу в них: 700 × g используется для вытягивания клеток ISE6, в то время как 13 600 × g используется для вытягивания риккетсий.
8. Дайте образцам постоять при RT или 34 °C в течение 15 мин до 1 ч.
9. Повторное суспендирование трансформантов (два или три) в ячейках ISE6 с помощью стерильного 2 мл барьерного наконечника пипетки, установленного на пипетке, и перенос в две или три колбы для культивирования клеток^{размером 25 см2} , содержащие 3,5 мл свежей среды с буфером NaHCO₃ и HEPES. В качестве альтернативы используйте стерильную барьерную пипетку Пастера 2 мл, управляемую резиновой колбой.
10. Раскачать колбы, чтобы равномерно распределить смесь, а затем инкубировать при 34 °C.
11. Через 16-24 ч добавляют 10 мкл спектиномицина (50 мг/мл) и 10 мкл стрептомицина (50 мг/мл) в каждую колбу на стадии 2.10.

3. Наблюдение за трансформированным Р. Паркери

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эпифлуоресцентный микроскоп с фильтрами родамина/TRITC для наблюдения за колбами, приготовленными на этапе 2.11 через 3-7 дней. Как только бляшки проявляются в культурах (5-14 дней), можно увидеть трансформированные R. parkeri , которые экспрессируют красный флуоресцентный белок mKATE, кодируемый на плазмиде pRAM18dSFA.

1. Конфокальная микроскопия
   1. Повторно суспендируют клеточные культуры из колб стадии 2,11 и смешивают 100 мкл этих клеточных культур с 5 мкл раствора Hoechst 33342 в течение 10-30 мин при РТ в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst 33342 представляет собой клеточно-проницаемое ядерное контрокрашение, которое связывается с ДНК живых клеток клещей и испускает синюю флуоресценцию.
   2. Центрифугу 50 мкл смеси наносят на стекла микроскопа с помощью центрифуги при 5 × г в течение 3 мин.
   3. Добавьте 3 мкл 1x PBS к месту клеток, нанесенных на слайде, наложите на него крышку и посмотрите с помощью конфокального микроскопа (объектив 60x). Для флуоресцентной визуализации используют следующие параметры возбуждения и излучения: для 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), возбуждение при 350 нм, излучение при 470 нм; для тетраметилродамина (TRITC) возбуждение при 557 нм, эмиссия при 576 нм.

Результаты

Морфология R. parkeri в клетках ISE6 под световым микроскопом после окрашивания Giemsa показана на рисунке 1. На рисунке 2 трансформированный R. parkeri , экспрессирующий красный флуоресцентный белок в клетках ISE6, показан с использованием конфокальной микро?...

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем метод введения экзогенной ДНК, закодированной на челночной плазмиде pRAM18dSFA, в риккетсии с использованием электропорации. В этой процедуре бесклеточные риккетсии были очищены от клеток-хозяев, преобразованы риккетсиальным челночным вектором и выпущены на клещев...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette	Bio-Rad	1652083
2 μm pore size filter	GE Healthcare Life Sciences Whatman	6783-2520
5 mL Luer-lock syringe	BD	309646
60-90 silicon carbide grit	LORTONE, inc	591-056
absolute methanol	Fisher Scientific	A457-4
Bacto tryptose phosphate broth	BD	260300
Cytospin centrifuge Cytospin4	Thermo Fisher Scientific	A78300003	The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	QIAGEN	12362	used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet	Perfector Scientific	TP03-5301
fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108	The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS	Bio-Rad	165-2105 & 165-2110
hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	267110
HEPES	Millipore-Sigma	H4034
ImageJ Fiji	National Institute of Health		raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain	Gibco	2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	41300039
lipoprotein concentrate	MP Biomedicals	191476
Nikon Diaphot	Nikon		epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope	Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber	Hausser Scientific	Chamber 3900
sodium bicarbonate	Millipore-Sigma	S5761
Vortex	Fisher Vortex Genie 2	12-812