Microscopie à force atomique en mode contact en tant que technique rapide d’observation morphologique et d’analyse des dommages cellulaires bactériens

Résumé

Ici, nous présentons l’application de la microscopie à force atomique (AFM) comme une méthode simple et rapide pour la caractérisation bactérienne et analysons des détails tels que la taille et la forme bactériennes, les biofilms de culture bactérienne et l’activité des nanoparticules en tant que bactéricides.

Résumé

La microscopie électronique est l’un des outils nécessaires pour caractériser les structures cellulaires. Cependant, la procédure est compliquée et coûteuse en raison de la préparation de l’échantillon pour l’observation. La microscopie à force atomique (AFM) est une technique de caractérisation très utile en raison de sa haute résolution en trois dimensions et de l’absence de toute exigence de vide et de conductivité de l’échantillon. AFM peut imager une grande variété d’échantillons avec différentes topographies et différents types de matériaux.

AFM fournit des informations topographiques 3D haute résolution du niveau angström à l’échelle du micron. Contrairement à la microscopie traditionnelle, AFM utilise une sonde pour générer une image de la topographie de surface d’un échantillon. Dans ce protocole, l’utilisation de ce type de microscopie est suggérée pour la caractérisation morphologique et cellulaire des bactéries fixées sur un support. Des souches de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), d’Escherichia coli (ATCC 25922) et de Pseudomonas hunanensis (isolées à partir d’échantillons de bulbes d’ail) ont été utilisées. Dans ce travail, des cellules bactériennes ont été cultivées dans des milieux de culture spécifiques. Pour observer les dommages cellulaires, Staphylococcus aureus et Escherichia coli ont été incubés avec différentes concentrations de nanoparticules (NP).

Une goutte de suspension bactérienne a été fixée sur un support en verre, et des images ont été prises avec AFM à différentes échelles. Les images obtenues ont montré les caractéristiques morphologiques de la bactérie. De plus, en utilisant l’AFM, il a été possible d’observer les dommages à la structure cellulaire causés par l’effet des NP. Sur la base des images obtenues, l’AFM de contact peut être utilisé pour caractériser la morphologie des cellules bactériennes fixées sur un support. L’AFM est également un outil approprié pour l’étude des effets des NP sur les bactéries. Comparée à la microscopie électronique, l’AFM est une technique peu coûteuse et facile à utiliser.

Introduction

Différentes formes bactériennes ont été relevées pour la première fois par Antony van Leeuwenhoek au 17ème siècle¹. Les bactéries existent sous une grande diversité de formes depuis l’Antiquité, allant des sphères aux cellules ramifiées². La forme cellulaire est une condition fondamentale pour les taxonomistes bactériens pour décrire et classer chaque espèce bactérienne, principalement pour la séparation morphologique des phylums à Gram positif et à Gram négatif³. Plusieurs éléments sont connus pour déterminer les formes cellulaires bactériennes, qui sont tous impliqués dans les couvertures cellulaires et le support en tant que composants de la paroi cellulaire et de la membrane, ainsi que dans le cytosquelette. De cette façon, les scientifiques continuent d’élucider les mécanismes et processus chimiques, biochimiques et physiques impliqués dans la détermination des formes cellulaires bactériennes, qui sont tous définis par des grappes de gènes qui définissent les formes bactériennes ^2,4.

De plus, les scientifiques ont montré que la forme en bâtonnet est probablement la forme ancestrale des cellules bactériennes, puisque cette forme cellulaire semble optimale dans les paramètres significatifs des cellules. Ainsi, les cocci, les spirales, les vibrions, les filamenteux et d’autres formes sont considérés comme des adaptations à divers environnements; En effet, des morphologies particulières ont évolué indépendamment à plusieurs reprises, suggérant que les formes des bactéries pourraient être des adaptations à des environnements particuliers ^3,5. Cependant, tout au long du cycle de vie des cellules bactériennes, la forme de la cellule change, et cela se produit également en réponse génétique à des conditions environnementales dommageables³. La forme et la taille des cellules bactériennes déterminent fortement la rigidité, la robustesse et le rapport surface/volume de la bactérie, et cette caractéristique peut être exploitée pour les procédés biotechnologiques⁶.

La microscopie électronique est utilisée pour étudier des échantillons biologiques en raison du fort grossissement qui peut être atteint au-delà des microscopes à base de lumière. La microscopie électronique à transmission (MET) et la microscopie électronique à balayage (MEB) sont les techniques les plus couramment utilisées à cette fin; Cependant, les échantillons nécessitent certains traitements avant d’être placés dans la chambre du microscope afin d’obtenir des images appropriées. Une couverture dorée sur les échantillons est nécessaire, et le temps utilisé pour l’acquisition totale de l’image ne doit pas être trop long. En revanche, la microscopie à force atomique (AFM) est une technique largement utilisée dans l’analyse des surfaces, mais est également utilisée dans l’étude d’échantillons biologiques.

Il existe plusieurs types de modes AFM utilisés dans l’analyse de surface, tels que le mode contact, le mode sans contact ou le tapotement, la microscopie à force magnétique (MFM), l’AFM conductrice, la microscopie à force piézoélectrique (PFM), le tapping de la force de crête (PFT), la résonance de contact et le volume de force. Chaque mode est utilisé dans l’analyse des matériaux et fournit des informations différentes sur la surface des matériaux et leurs propriétés mécaniques et physiques. Cependant, certains modes AFM sont utilisés pour l’analyse d’échantillons biologiques in vitro, comme le PFT, car le PFT permet d’obtenir des données topographiques et mécaniques sur des cellules en milieu liquide⁷.

Dans ce travail, nous avons utilisé le mode le plus basique inclus dans chaque modèle AFM ancien et simple: le mode contact. AFM utilise une sonde pointue (environ <50 nm de diamètre) pour balayer les zones inférieures à 100 μm. La sonde est alignée sur l’échantillon afin d’interagir avec les champs de force associés à l’échantillon. La surface est balayée avec la sonde pour maintenir la force constante. Ensuite, une image de la surface est générée en surveillant le mouvement du porte-à-faux lorsqu’il se déplace sur la surface. Les informations recueillies fournissent les propriétés nanomécaniques de la surface, telles que l’adhérence, l’élasticité, la viscosité et le cisaillement.

En mode de contact AFM, le porte-à-faux est balayé à travers l’échantillon à une déviation fixe. Cela permet de déterminer la hauteur des échantillons (Z), ce qui représente un avantage par rapport aux autres techniques de microscope électronique. Le logiciel AFM permet la génération d’un balayage d’image 3D par l’interaction entre la pointe et la surface de l’échantillon, et la déviation de la pointe est corrélée à la hauteur de l’échantillon grâce à un laser et un détecteur.

En mode statique (mode contact) à force constante, la sortie présente deux images différentes : la hauteur (topographie z) et la déviation ou le signal d’erreur. Le mode statique est un mode d’imagerie simple et précieux, en particulier pour les échantillons robustes dans l’air qui peuvent supporter les charges élevées et les forces de torsion exercées par le mode statique. Le mode de déflexion ou d’erreur est utilisé en mode force constante. Cependant, l’image topographique est encore améliorée en ajoutant le signal de déviation à la structure de surface. Dans ce mode, le signal de déviation est également appelé signal d’erreur car la déviation est le paramètre de rétroaction ; Toutes les caractéristiques ou morphologies qui apparaissent dans ce canal sont dues à « l’erreur » dans la boucle de rétroaction ou, plutôt, à la boucle de rétroaction nécessaire pour maintenir un point de consigne de déflexion constant.

La conception unique de l’AFM le rend compact - assez petit pour tenir sur une table - tout en ayant une résolution suffisamment élevée pour résoudre les étapes atomiques. L’équipement AFM a un coût inférieur à celui des autres microscopes électroniques et les coûts de maintenance sont minimes. Le microscope ne nécessite pas de laboratoire avec des conditions spéciales telles qu’une salle blanche ou un espace isolé; Il n’a besoin que d’un bureau sans vibrations. Pour l’AFM, les échantillons n’ont pas besoin de subir une préparation élaborée comme pour d’autres techniques (couverture dorée, minceur); Seul un échantillon sec doit être fixé au porte-échantillon.

Nous utilisons le mode de contact AFM pour observer les morphologies bactériennes et les effets des NP. La population et la morphologie cellulaire des bactéries fixées sur un support peuvent être observées, ainsi que les dommages cellulaires produits par les nanoparticules sur les espèces bactériennes. Les images obtenues par le mode contact AFM confirment qu’il s’agit d’un outil puissant et qu’il n’est pas limité par des réactifs et des procédures compliquées, ce qui en fait une méthode simple, rapide et économique pour la caractérisation bactérienne.

Protocole

1. Isolement et identification des bactéries

1. Isolement d’une souche endophytique à partir de méristèmes de bulbe d’ail:
   1. Placer des fragments de 2 mm de méristèmes de bulbes d’ail préalablement pelés, désinfectés et coupés sur de la gélose trypticase soja (TSA) comme milieu de croissance riche, et incuber à 25 °C pendant 1 jour.
   2. Sur la base des différences morphologiques des colonies bactériennes - forme, taille, couleur, bord, lumière transmise, lumière réfléchie, texture, consistance et production de pigments - décrire les différents morphotypes observés et purifier par stries croisées une colonie représentative de chaque morphotype.
   3. Conserver toutes les souches bactériennes purifiées dans 30% de glycérol à -80 °C.
   4. Identifier une souche sélectionnée au hasard (9AP) en séquençant l’ADNr 16S. Extraire l’ADN en suivant la méthode de Hoffman et Winston⁸.
   5. Amplifier l’ARNr 16S par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) avec 100 ng d’ADN, 1x tampon de polymérase, 4 mM MgCl₂, 0,4 mM dNTP, 10 pmol chacun d’oligonucléotides universels 27F/1492r et 1 U d’ADN polymérase⁹. Utiliser les conditions suivantes du thermocycleur: 95 °C pendant 5 min pour la dénaturalisation initiale; suivi de 35 cycles de 1 min à 94 °C comme température de dénaturalisation, 1 min à 56 °C comme température d’hybridation et 1 min à 72 °C comme température d’extension; puis 10 min à 72 °C comme prolongement final.
   6. Séquence capillaire du produit PCR utilisant les mêmes oligonucléotides; Utiliser la méthode Didésoxy-Terminal avec le kit d’installation matricielle pour le séquençage capillaire¹⁰, et effectuer l’électrophorèse dans un système multicapillaire automatisé¹¹.
   7. Modifiez manuellement les séquences, comparez la séquence avec la bibliothèque GenBank à l’aide d’une recherche BLAST et identifiez provisoirement la souche avec l’étalon-or d’au moins 98,7% d’identité avec l’espèce la plus proche^12,13.
      NOTE: La souche 9AP a été identifiée comme appartenant à l’espèce de Pseudomonas hunanensis, avec une identité de 99,86% avec la séquence de la souche P. hunanensis LV (JX545210).

2. Préparation d’échantillons bactériens pour observation morphologique par AFM

1. Dans des conditions stériles, placez une goutte de la suspension bactérienne (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) sur une lame de verre.
2. Fixez les échantillons sur la lame par chauffage à sec. Passez doucement la lame sur une flamme plusieurs fois jusqu’à ce que l’échantillon soit sec.
   NOTE: La fixation des échantillons est une technique de routine en microbiologie pour observer les organismes procaryotes fixes et simuler leur structure en tant que cellules vivantes aussi fidèlement que possible.
3. Placez les échantillons fixes dans une boîte de Petri et apportez-les à l’équipement AFM pour observation.
   REMARQUE : Comme les échantillons peuvent être modifiés par les conditions météorologiques au fil du temps, prévoyez un temps maximal de 24 heures pour l’analyse dans l’équipement AFM. Gardez les échantillons exempts de poussière.

3. Effet antibactérien des nanoparticules de MgO contre les bactéries

NOTE : La synthèse et la caractérisation des NP MgO ont été publiées précédemment¹⁴. Dans ce travail, l’activité antibactérienne des nanomatériaux a été estimée sur la base du manuel du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) utilisant des méthodes de macrodilution et de microdilution pour l’inhibition^15,16.

1. Estimation de l’activité inhibitrice minimale (CMI) et bactéricides (CMB)
   1. Précroissance des souches
      1. Inoculer une quantité appropriée d’Escherichia coli ou de Staphylococcus aureus dans un bouillon nutritif pour obtenir une concentration finale de 1 × 10⁸ UFC/mL.
      2. Incuber la suspension à 37 °C (± 2 °C) pendant 18-24 h.
   2. Post-croissance des souches acclimatées
      1. Immerger une boucle bactériologique stérile dans la suspension, en touchant le fond du tube.
      2. Effectuer des stries, avec la boucle, sur gélose à l’éosine et au bleu de méthylène et sur gélose nutritive.
      3. Incuber les gélose à 37 °C (± 2 °C) pendant 24 h.
   3. Sélection des colonies pour la préparation de l’inoculum standardisé
      1. Prenez trois à cinq colonies avec le même type morphologique en touchant le sommet de la colonie dans la boîte de Petri avec une boucle bactériologique.
      2. Transférer et immerger la sélection dans 3-5 ml de bouillon Müller-Hinton.
      3. Incuber à 37 °C (± 2 °C) pour obtenir une turbidité de 1 × 10 8 UFC/mL ou de 2 × 10⁸ UFC/mL.
         REMARQUE : Dans ce travail, les normes de turbidité McFarland ont été utilisées comme référence pour les suspensions bactériologiques; plus précisément, l’étalon 0,5 correspond approximativement à une suspension homogène d’E. coli de 1,5 × 10⁸ cellules/mL. Un spectrophotomètre UV-Vis a été utilisé pour mesurer la turbidité.
      4. Prendre 1 mL et l’ajouter à 9 mL de bouillon stérile. Prélever 200 μL de cette dilution et l’ajouter à 19,8 mL de bouillon stérile pour obtenir une concentration finale de 5 × 10^{5 UFC} /mL.
   4. Concentrations requises de nanoparticules de MgO
      1. Utilisez un ultrasonateur pour la préparation des solutions.
      2. Suspendre le nanomatériau dans de l’eau stérile à deux fois la concentration requise pour obtenir des solutions en série.
      3. Ajouter ces suspensions à des tubes stériles contenant du bouillon Müller-Hinton pour obtenir la nouvelle gamme de concentrations requise pour l’expérience.
         NOTA : Les concentrations de NP MgO suivantes ont été appliquées pour la microdilution : 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1 000 ppm, 2 000 ppm, 3 000 ppm, 4 000 ppm et 8 000 ppm.
   5. Préparation de la microdilution¹⁵
      1. Préparez une nouvelle plaque de microtitrage stérile à 96 puits (microplaque). Étiqueter la colonne no 12 de la microplaque en tant que colonne de stérilité; Étiqueter la colonne n° 11 comme colonne de contrôle de la croissance.
      2. Ajouter 120 μL de suspensions de nanoparticules avec les différentes concentrations aux colonnes n ° 1-10.
      3. Inoculer 120 μL de bactéries (5 × 10^{5 UFC} /mL) dans les puits des colonnes no 1 à 10.
         REMARQUE : Pour cette étude, la rangée G et la rangée H étaient des témoins ayant consommé de la ceftriaxone aux concentrations suggérées par les normes de l’ICLS : 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm et 0,03 ppm.
      4. Incuber la microplaque de 96 puits pendant 24 h à 37 °C (35 °C ± 2 °C). Enfin, analysez les puits.
2. Observation des changements morpho-structuraux induits par les nanoparticules de MgO dans les souches bactériennes par AFM
   1. Prélever 250 μL dans les puits des essais de microdilution, mélanger avec 750 μL d’eau stérile et centrifuger à 2 000 × g de 2 min à 5 min à 5 °C.
   2. Lavez les précipités trois fois avec 1 mL d’eau stérile à chaque fois, et à la fin des lavages, ajoutez-y 500 μL d’eau.
   3. Pour obtenir les images AFM, prélever 10-20 μL de la suspension finale de chaque puits de départ, effectuer un frottis sur une lame préalablement nettoyée par ultrasons (30 min), et sécher à température ambiante pendant 1 h.

4. Mesures AFM

REMARQUE: Ici, le microscope à force atomique en mode contact a été monté sur un poste de travail anti-vibration qui a permis l’isolation du microscope de toute source vibratoire mécanique et a maintenu le système à niveau. Les interférences électriques sont réduites grâce aux filtres de ligne et à la protection contre les surtensions. L’AFM utilisé ici aligne automatiquement le faisceau laser sur le photodétecteur.

1. Allumez l’ordinateur et l’AFM, puis sélectionnez le mode Contact, les sondes contAI-G et les options Pente automatique dans les outils logiciels. Les valeurs par défaut du contrôleur Z sont Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10 000, I-Gain = 1 000, D-Gain = 0 et Tension de pointe = 0 mV.
2. Placez les échantillons en mode de contact AFM à l’aide d’une tête de plage de balayage de 70 μm. Nous avons utilisé des porte-à-faux en silicium ContAI-G avec une constante de ressort de 0,13 N/m.
3. Utilisez un appareil photo monté sur deux lentilles intégrées dans la tête de numérisation pour obtenir une vue rapide de la surface de la zone sous la sonde.
4. Effectuez manuellement un déplacement dans le plan XY afin de choisir la zone souhaitée. La sonde est conçue pour approcher électroniquement l’échantillon de surface jusqu’à ce que les conditions de contact soient atteintes. Ajustez électroniquement le plan de mesure XY du scanner et la surface de l’échantillon en réduisant les pentes dans les directions XY.
5. Utilisez les paramètres standard du logiciel : 1 ligne par seconde à 256 points par ligne.
6. Tout d’abord, effectuez une plage de balayage complète d’une zone de 70 μm x 70 μm; Ensuite, sélectionnez une zone plus petite à l’aide de l’outil Zoom. L’AFM optimise automatiquement la plage de graphiques en Z.
   REMARQUE: En diminuant les lignes par seconde, le temps total de balayage augmente, la qualité du balayage est mieux définie et une partie du bruit de la mesure est également effacée.
7. Pour sélectionner une nouvelle zone dans l’échantillon, rétractez électroniquement le porte-à-faux et déplacez l’échantillon le long du plan XY. Réalisez une nouvelle analyse à l’aide de la procédure décrite aux étapes 4.5 et 4.6.
   REMARQUE: Les scans obtenus sont affichés dans une échelle de barres unicolore, dans laquelle les couleurs claires sont associées à des altitudes plus élevées, et les couleurs sombres sont associées à des altitudes plus profondes. Le logiciel AFM génère une vue 3D du scan qui permet d’apprécier les détails de la surface mesurée.
8. Effectuez le traitement des données à l’aide du nivellement ligne par ligne dans le menu Outils de l’image dans la sélection de filtre, qui est la méthode de nivellement la plus utilisée et la plus simple.
   Remarque : Cette méthode de nivellement prend chaque ligne horizontale ou verticale produite dans l’image AFM et l’adapte à une équation polynomiale.
9. Optimisez la hauteur maximale et minimale dans la barre de couleur à droite afin d’obtenir la meilleure résolution d’image.
10. Effectuez l’analyse d’image à l’aide du menu Analyse de la barre d’outils. Déterminez les hauteurs et les distances en sélectionnant les points initiaux et finaux une fois l’outil souhaité sélectionné.
    REMARQUE : Les utilisateurs doivent essayer les différents filtres du menu Outils pour éviter les artefacts d’image de pointe dus à l’aplatissement utilisé dans le processus de nivellement. Les artefacts d’image apparaissent sous forme de lignes de traînée et sont montrés dans certaines des images AFM.

Résultats

Des images de la morphologie et de la taille des souches de S. aureus et de P. hunanensis , ainsi que de l’organisation de la population des deux souches, ont été prises par microscopie à force atomique en mode contact. Les images de S. aureus ont montré que sa population était répartie par zones avec des agrégats de cocci (Figure 1A). Avec une augmentation de l’échelle, il y avait une plus grande appréciation de la distribution de la population et de...

Discussion

La microscopie est une technique couramment utilisée dans les laboratoires biologiques qui permet d’étudier la structure, la taille, la morphologie et la disposition cellulaire des échantillons biologiques. Pour améliorer cette technique, plusieurs types de microscopes peuvent être utilisés qui diffèrent les uns des autres en termes de caractéristiques optiques ou électroniques, qui déterminent le pouvoir de résolution de l’instrument.

Dans la recherche scientifique, l’utilisa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions