Genereren van genetisch gemodificeerde Plasmodium berghei Sporozoïeten

Malaria wordt overgedragen door inoculatie van het sporozoietstadium van Plasmodium door geïnfecteerde muggen. Transgeen Plasmodium heeft ons in staat gesteld de biologie van malaria beter te begrijpen en heeft rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van malariavaccins. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methodologie om transgene Plasmodium berghei sporozoïeten te genereren.

Malaria is een dodelijke ziekte die wordt veroorzaakt door de parasiet Plasmodium en wordt overgedragen door de beet van vrouwelijke Anopheles-muggen . Het sporozoietstadium van Plasmodium dat door muggen in de huid van gewervelde gastheren wordt afgezet, ondergaat een fase van verplichte ontwikkeling in de lever voordat klinische malaria wordt geïnitieerd. We weten weinig over de biologie van de ontwikkeling van Plasmodium in de lever; toegang tot het sporozoietstadium en het vermogen om dergelijke sporozoïeten genetisch te modificeren zijn cruciale hulpmiddelen voor het bestuderen van de aard van Plasmodium-infectie en de resulterende immuunrespons in de lever. Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor het genereren van transgene Plasmodium berghei sporozoïeten. We modificeren P. berghei genetisch in het bloedstadium en gebruiken deze vorm om Anopheles-muggen te infecteren wanneer ze een bloedmaaltijd nemen. Nadat de transgene parasieten zich in de muggen hebben ontwikkeld, isoleren we het sporozoietstadium van de parasiet uit de speekselklieren van de mug voor in vivo en in vitro experimenten. We demonstreren de validiteit van het protocol door sporozoïeten te genereren van een nieuwe stam van P. berghei die het groen fluorescerende eiwit (GFP) subeenheid 11 (GFP₁₁) tot expressie brengt, en laten zien hoe het kan worden gebruikt om de biologie van malaria in het leverstadium te onderzoeken.

Ondanks de vooruitgang in de ontwikkeling van geneesmiddelen en onderzoek naar malariapreventie en -behandeling, blijft de wereldwijde ziektelast van malaria hoog. Elk jaar sterven meer dan een half miljoen mensen aan malaria, met de hoogste sterftecijfers onder kinderen die in malaria-endemische regio's wonen,^{zoals Afrika ten} zuiden van de Sahara. Malaria wordt veroorzaakt door de parasiet Plasmodium, die op mensen wordt overgedragen door de beet van vrouwelijke Anopheles-muggen die de parasiet in hun speekselklieren dragen. Het infectieuze stadium van Plasmodium - de sporozoïeten - wordt tijden....

Al het onderzoek met gewervelde dieren in ons laboratorium werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en protocollen voor diergebruik van de Universiteit van Georgia.

1. Generatie van P. berghei-geïnfecteerde muizen

1. Start een infectie in het bloedstadium bij mannelijke of vrouwelijke, 6-8 weken oude C57BL/6 (B6)-muizen met behulp van wildtype P. berghei-parasieten. Om dit te doen, brengt u gecryopreserveerd P. berghei-geïnfecteerd<.......

Het bepalen van de frequentie en ontwikkeling van schizonten is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat voldoende levensvatbare parasieten zich in het optimale stadium voor transfectie bevinden. Onrijpe schizonten kunnen worden onderscheiden van volledig volwassen schizonten door de aanwezigheid van minder merozoïeten die niet de hele intracellulaire ruimte van de RBC vullen (Figuur 1B). Het is belangrijk op te merken dat bij het maken van bloeduitstrijkjes uit gekweekt bloed, geïnfect.......

We hebben het bovenstaande protocol in ons laboratorium gebruikt om verschillende lijnen van transgene P. berghei-parasieten te maken. Hoewel geoptimaliseerd voor P. berghei, hebben we dit protocol ook met succes gebruikt om transgene P. yoelii-sporozoïeten te genereren. Na het injecteren van de getransfecteerde schizonten in muizen, zijn parasieten meestal niet later dan 3 d.p.i. detecteerbaar in alle groepen, inclusief de controle zonder plasmide. De selectie wordt pas gestart nadat parasite.......

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie AI168307 aan SPK.  We danken de UGA CTEGD Flow Cytometry Core en de UGA CTEGD Microscopy Core. We erkennen ook de bijdragen van Ash Pathak, Anne Elliot en het personeel van UGA Sporocore bij het optimaliseren van het protocol. We willen Dr. Daichi Kamiyama bedanken voor waardevolle inzichten, discussie en de ouderplasmiden die GFP₁₁ en GFP _1-10 bevatten. We willen ook de leden van het Kurup-lab bedanken voor hun constante steun, geduld en aanmoediging.