Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
आनुवंशिक रूप से संशोधित प्लास्मोडियम बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करना
मलेरिया संक्रमित मच्छरों द्वारा प्लास्मोडियम के स्पोरोज़ोइट चरण के टीकाकरण के माध्यम से फैलता है। ट्रांसजेनिक प्लाज्मोडियम ने हमें मलेरिया के जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति दी है और मलेरिया वैक्सीन विकास प्रयासों में सीधे योगदान दिया है। यहां, हम ट्रांसजेनिक प्लास्मोडियम बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करने के लिए एक सुव्यवस्थित पद्धति का वर्णन करते हैं।
मलेरिया परजीवी प्लाज्मोडियम के कारण होने वाली एक घातक बीमारी है और मादा एनोफिलीज मच्छरों के काटने से फैलती है। कशेरुक मेजबानों की त्वचा में मच्छरों द्वारा जमा प्लास्मोडियम का स्पोरोज़ोइट चरण नैदानिक मलेरिया शुरू करने से पहले यकृत में अनिवार्य विकास के चरण से गुजरता है। हम यकृत में प्लास्मोडियम विकास के जीव विज्ञान के बारे में बहुत कम जानते हैं; स्पोरोज़ोइट चरण तक पहुंच और आनुवंशिक रूप से ऐसे स्पोरोज़ोइट्स को संशोधित करने की क्षमता प्लास्मोडियम संक्रमण की प्रकृति और यकृत में परिणामी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यहां, हम ट्रांसजेनिक प्लास्मोडियम बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स की पीढ़ी के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम आनुवंशिक रूप से रक्त-चरण पी बर्गेई को संशोधित करते हैं और इस रूप का उपयोग एनोफिलीज मच्छरों को संक्रमित करने के लिए करते हैं जब वे रक्त भोजन लेते हैं। मच्छरों में ट्रांसजेनिक परजीवी के विकास के बाद, हम विवो और इन विट्रो प्रयोग के लिए मच्छर लार ग्रंथियों से परजीवी के स्पोरोज़ोइट चरण को अलग करते हैं। हम ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) सबयूनिट 11 (जीएफपी11) को व्यक्त करने वाले पी बर्गेई के एक नए स्ट्रेन के स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करके प्रोटोकॉल की वैधता का प्रदर्शन करते हैं, और दिखाते हैं कि यकृत-चरण मलेरिया के जीव विज्ञान की जांच के लिए इसका उपयोग कैसे किया जा सकता है।
मलेरिया की रोकथाम और उपचार में दवा विकास और अनुसंधान में प्रगति के बावजूद, मलेरिया का वैश्विक रोग बोझ उच्च बना हुआ है। हर साल मलेरिया से पांच लाख से अधिक लोग मर जाते हैं, जिसमें मलेरिया-स्थानिक क्षेत्रों में रहने वाले बच्चों में मृत्यु दर का उच्चतम स्तर देखा जाता है, जैसे कि उप-सहारा अफ्रीका1। मलेरिया परजीवी प्लाज्मोडियम के कारण होता है, जो मादा एनोफिलीज मच्छरों के काटने से मनुष्यों में फैलता है, जो उनकी लार ग्रंथियों में परजीवी को सहन करते हैं। प्लास्मोडियम का संक्रामक चरण-स्पोरोज़ोइट्स-रक्त भोजन के दौरान कशेरुक मेजबानों की त्वचा में जमा होता है और यकृत कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए रक्तप्रवा....
स्किज़ोन्ट्स की आवृत्ति और विकास का निर्धारण यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पर्याप्त व्यवहार्य परजीवी अभिकर्मक के लिए इष्टतम चरण में हैं। अपरिपक्व स्किज़ोन्ट्स को कम मेरोज़ोइट्स की उपस्.......
इस काम को एसपीके को AI168307 राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था। हम यूजीए सीटीईजीडी फ्लो साइटोमेट्री कोर और यूजीए सीटीईजीडी माइक्रोस्कोपी कोर को धन्यवाद देते हैं। हम प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में ऐश पाठक, ऐनी इलियट और यूजीए स्पोरोकोर के कर्मचारियों के योगदान को भी स्वीकार करते हैं। दाइची कामियामा को मूल्यवान अंतर्दृष्टि, चर्चा और जीएफपी 11 और जीएफपी 1-10 युक्त मूल प्लास्मिड के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम कुरूप प्रयोगशाला के सदस्यों को उनके निरंतर समर्थन, धैर्य और प्रोत्साहन के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
- WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
- Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
- Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
- Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
- Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
- Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
- Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
- Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
- Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
- Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
- Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
- Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
- Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
- Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
- Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
- de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
- Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
- Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
- Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
- Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved