Geração de Esporozoítos Geneticamente Modificados de Plasmodium berghei

Resumo

A malária é transmitida através da inoculação do estágio de esporozoíto do Plasmodium por mosquitos infectados. O Plasmodium Transgênico nos permitiu compreender melhor a biologia da malária e contribuiu diretamente para os esforços de desenvolvimento de vacinas contra a malária. Aqui, descrevemos uma metodologia simplificada para gerar esporozoítos transgênicos de Plasmodium berghei .

Resumo

A malária é uma doença mortal causada pelo parasita Plasmodium e é transmitida através da picada de fêmeas de mosquitos Anopheles . O estágio de esporozoíto do Plasmodium depositado por mosquitos na pele de hospedeiros vertebrados passa por uma fase de desenvolvimento obrigatório no fígado antes de iniciar a malária clínica. Sabemos pouco sobre a biologia do desenvolvimento do Plasmodium no fígado; o acesso ao estágio de esporozoíto e a capacidade de modificar geneticamente tais esporozoítos são ferramentas críticas para estudar a natureza da infecção por Plasmodium e a resposta imune resultante no fígado. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração de esporozoítos transgênicos de Plasmodium berghei . Nós modificamos geneticamente o estágio sanguíneo de P. berghei e usamos essa forma para infectar mosquitos Anopheles quando eles tomam uma refeição de sangue. Após o desenvolvimento dos parasitas transgênicos nos mosquitos, isolamos o estágio de esporozoíto do parasita das glândulas salivares do mosquito para experimentação in vivo e in vitro . Demonstramos a validade do protocolo gerando esporozoítos de uma nova cepa de P. berghei expressando a proteína fluorescente verde (GFP) subunidade 11 (GFP₁₁), e mostramos como ele pode ser usado para investigar a biologia da malária em estádio hepático.

Introdução

Apesar dos avanços no desenvolvimento de medicamentos e na pesquisa para prevenção e tratamento da malária, a carga global de doenças da malária permanece alta. Mais de meio milhão de pessoas morrem de malária a cada ano, com os níveis mais altos de mortalidade observados entre crianças que vivem em regiões endêmicas de malária, como a África Subsaariana¹. A malária é causada pelo parasita Plasmodium, que é transmitido aos seres humanos através da picada de fêmeas de mosquitos Anopheles portadores do parasita em suas glândulas salivares. O estágio infeccioso do Plasmodium - os esporozoítos - são depositados na pele dos hospedeiros vertebrados durante uma refeição de sangue e viajam pela corrente sanguínea para infectar as células do fígado, onde passam pelo desenvolvimento obrigatório (constituindo malária pré-eritrocitária) antes de infectar os eritrócitos. A infecção dos eritrócitos inicia o estágio sanguíneo da malária e é responsável pela totalidade da morbidade e mortalidade associadas à doença ^2,3.

A natureza obrigatória do desenvolvimento pré-eritrocitário do Plasmodium tornou-o um alvo atraente para os esforços profiláticos de desenvolvimento de vacinas e fármacos⁴. Um pré-requisito para o estudo da biologia da malária pré-eritrocitária, bem como o desenvolvimento de vacinas ou drogas direcionadas ao estágio hepático, é o acesso aos esporozoítos de Plasmodium. Além disso, nossa capacidade de gerar esporozoítos de Plasmodium geneticamente modificados tem sido fundamental para o sucesso de tais esforços de pesquisa5,6,7,8,9. Linhagens transgênicas de Plasmodium expressando proteínas repórteres fluorescentes ou luminescentes têm permitido acompanhar seu desenvolvimento in vivo e in vitro^10,11. Parasitas geneticamente atenuados (GAPs), gerados pela deleção de múltiplos genes no Plasmodium, também são alguns dos mais promissores candidatos vacinais^12,13.

Modelos de malária em roedores e primatas não humanos têm nos ajudado a entender os mecanismos das interações parasita-hospedeiro na malária humana devido às semelhanças na biologia e no ciclo de vida entre as espécies de Plasmodium ¹⁴. O uso de espécies de Plasmodium que infectam roedores, mas não humanos (por exemplo, P. berghei) permite a manutenção do ciclo de vida completo do parasita e a geração de esporozoítos infecciosos para o estudo da malária em estágio hepático em um ambiente controlado de nível 1 de biossegurança. Uma variedade de protocolos separados já existe para a geração de parasitas transgênicos do Plasmodium em estágio sanguíneo 15, infecção de mosquitos¹⁶ e isolamento de esporozoítos¹⁷. Aqui, delineamos um protocolo abrangente combinando essas metodologias para gerar e isolar esporozoítos transgênicos de P. berghei, utilizando a nova cepa transgênica PbGFP₁₁ como exemplo. A PbGFP 11 trafega a 11ª fita β da proteína fluorescente verde (GFP) superpasta, GFP₁₁, para o vacúolo parasitóforo (PV) gerado nos hepatócitos hospedeiros. A PbGFP₁₁ é usada em conjunto com hepatócitos transgênicos (Hepa1-6 background) expressando resíduos que constituem o fragmento GFP 1-10 (GFP 1-10) no citoplasma (células Hepa GFP _1-10). A PbGFP₁₁ relata lise PV nos hepatócitos hospedeiros através da autocomplementação e da reforma da GFP funcional e do sinal verde de fluorescência¹⁸. De notar, GFP 11 é codificado como uma série de sete sequências tandem em PbGFP₁₁ para aumentar o sinal de fluorescência resultante. Ao colorir esporozoítos de PbGFP₁₁ com o corante citoplasmático CellTrace Violet (CTV), podemos rastrear os parasitas. A lise desses parasitas intracelulares corados pelo CTV resulta em extravasamento de CTV para o citoplasma da célula hospedeira e coloração da célula hospedeira. Além de visualizar e distinguir a lise do Plasmodium PV e/ou do parasita em hepatócitos hospedeiros, esse sistema pode ser usado de forma confiável para estudar as vias imunes responsáveis por qualquer um desses processos, através da perturbação genética ou terapêutica dos componentes moleculares dessas vias.

Protocolo

Todas as pesquisas envolvendo animais vertebrados em nosso laboratório foram realizadas de acordo com as diretrizes e protocolos de uso de animais da Universidade da Geórgia.

1. Geração de camundongos infectados por P. berghei

1. Iniciar a infecção em estágio sanguíneo em camundongos C57BL/6 (B6) machos ou fêmeas com 6-8 semanas de idade usando parasitas selvagens de P. berghei. Para isso, transferir sangue criopreservado infectado por P. berghei (2 x 10⁵ hemácias infectadas), reconstituído em 400 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), para um ou dois camundongos doadores por via intraperitoneal (i.p.).
2. Transferir sangue fresco coletado através de sangramento retro-orbital dos camundongos doadores 5 dias após a infecção (d.p.i.) para dois camundongos B6 virgens. Para fazer isso, colete 200 μL de sangue, reconstitua com 300 μL de PBS e injete 200 μL i.p. nos camundongos receptores. Garantir que a parasitemia nos doadores neste momento seja de 2%-5%^19,20.
3. Monitorar a parasitemia conforme descrito anteriormente^19,20, a partir de 2 d.p.i. nos receptores. Quando a parasitemia varia de 3%-5% (cerca de 5 d.p.i.), eutanasiar os camundongos receptores e, em seguida, coletar sangue através de punção cardíaca ou sangramento retro-orbital. Eutanásia dos camundongos por inalação de dióxido de carbono seguida de deslocamento cervical, ou de acordo com diretrizes institucionais.
   NOTA: Uma vez que a parasitemia excede 5%, a eficiência da transfecção pode ser reduzida devido ao aumento da prevalência de hemácias infectadas multiplicadoramente.

2. Geração de esquizontos na cultura

1. Recolher sangue dos ratinhos infectados no passo 1.3 (aproximadamente 2 ml no total de dois ratinhos) em 5 ml de solução de Alsever (ver Tabela de Materiais) num ambiente estéril. Execute as etapas 2.1 a 3.12 em condições estéreis.
   NOTA: As condições estéreis incluem o uso de luvas, limpeza de luvas e superfícies com etanol 70%, o emprego de consumíveis e materiais estéreis e o trabalho dentro de um gabinete de biossegurança.
2. Centrifugar o sangue durante 8 minutos a 450 x g à temperatura ambiente (TR). Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio RPMI completo (RPMI 1640 com 20% de soro fetal bovino [SFB] e 1% de penicilina-estreptomicina, v/v).
3. Centrifugar por 8 min a 450 x g em RT. Ressuspender o pellet em 25 mL de meio RPMI completo e transferir para um frasco de cultura T75 com tampa filtrante.
4. Colocar em estufa a 36,5 °C e 5% CO₂, agitando suavemente para manter as células em suspensão durante 16 horas.
5. No ponto de tempo de 16 h, verifique o desenvolvimento de esquizont. Para isso, colete 500 μL da amostra, centrifugue a 450 x g por 8 min, ressuspenda o pellet em 10 μL de meio RPMI completo e prepare um esfregaço fino de sangue. Manchar o esfregaço sanguíneo com a coloração de Giemsa¹⁹ (ver Tabela de Materiais) e determinar a frequência dos esquizontos (Figura 1).
6. Para uma eficiência de transfecção ideal, 60%-70% dos parasitas devem estar no estágio esquizonto. Se for determinado um limite inferior a este limiar, continue a cultivar como no passo 2.4 e verifique de hora em hora se o limiar acima é ultrapassado antes de prosseguir.

3. Transfecção de esquizontos de Plasmodium

1. Preparar um tampão de centrifugação de gradiente reconstituindo 13 ml de meio de depósito com gradiente de densidade (ver Tabela de Materiais) com 1,44 ml de NaCl 1,5 M e 5,6 ml de NaCl 0,15 M num tubo de centrifugação de 50 ml.
2. Transferir 25 mL de hemocultura para um tubo de centrifugação fresco de 50 mL. Coloque cuidadosamente 20 mL de tampão de centrifugação gradiente no fundo do tubo de centrifugação usando uma pipeta de vidro estreita para criar uma coluna de gradiente. Tome cuidado para não perturbar as camadas líquidas e interfaces e garanta uma divisão clara entre o buffer e a mídia.
3. Centrifugar por 20 min a 450 x g sem freio em RT. Usando uma pipeta de Pasteur, remova cuidadosamente a camada de esquizonta¹⁵ localizada na interface do meio de cultura e o tampão de centrifugação de gradiente e coloque-a em um novo tubo de centrifugação de 50 mL.
4. Ressuspender os esquizontos isolados em meio RPMI completo e elevar o volume total para 40 mL. Centrifugar a 450 x g por 8 min em RT e descartar o sobrenadante.
5. Ressuspender os esquizontos em 10 mL de meio RPMI completo. Em seguida, transferir 1 mL dessa solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para cada transfecção e centrifugar a 16.000 x g por 5 s para peletizar as hemácias infectadas. As hemácias infectadas derivadas de dois camundongos da maneira acima podem ser usadas para até 10 transfecções separadas.
6. Combinar 100 μL do tampão de eletroporação (solução de nucleofector do kit de eletroporação; ver Tabela de Materiais) em RT com 5 μg de DNA plasmidial alvo circular ou linearizado (em volume máximo de 10 μL), conforme aplicável para cada transfecção em tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mL. Uma amostra "sem plasmídeo" deve ser incluída como controle para transfecção e seleção de antibióticos.
7. Remover o sobrenadante após centrifugação do passo 3.5 e ressuspender cuidadosamente as hemácias infectadas na solução nucleofector preparada + ADN plasmidial (a partir do passo 3.6).
8. Transferir a suspensão (solução de nucleofector + plasmídeo + esquizontos; máximo de 110 μL) para cubetas de eletroporação. Transfect usando um programa de nucleofector adequado (U-033, ver Tabela de Materiais).
   Observação : verifique se as etapas 3.8 a 3.10 são executadas no RT.
9. Adicione 100 μL de meio RPMI completo à cubeta e transfira toda a solução (agora 200 μL de volume total) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e mantenha em RT.
10. Injetar a solução de 200 μL de parasitas transfectados em camundongos por via intravenosa (i.v.), trabalhando para minimizar o tempo entre a transfecção e a injeção final em camundongos.
    NOTA: Esquizontes transfectados são injetados em camundongos menos de 5 min após a eletroporação para maximizar a eficiência do protocolo.

4. Seleção dos parasitas transfectados

1. Verificar os níveis de parasitemia nos camundongos inoculados com os esquizontos transfectados diariamente a partir de 2 d.p.i. para verificar a infecção.
2. Uma vez verificada a infecção, iniciar a seleção de drogas usando a administração oral da droga em água potável, oferecida ad libitum.
   NOTA: A pirimetamina foi empregada como marcador de droga selecionável para o plasmídeo. Neste caso, 17,5 mg de pirimetamina foram adicionados a 250 mL de água limpa (concentração final de 70 mg/L). Além disso, 10 g de açúcar foram adicionados a essa água para incentivar o consumo adequado da água contendo pirimetamina por camundongos.
3. Monitorar a parasitemia a cada dois dias usando esfregaços de sangue feitos com 5 μl de sangue, a partir de 6 dias após o início do tratamento com pirimetamina. A ausência de parasitas detectáveis após 15 dias indica falha na transfecção; Nesse caso, reinicie o processo da etapa 1.1 para uma nova tentativa.
4. Quando a parasitemia atinge pelo menos 1%, transfira os parasitas para camundongos B6 virgens para a criação de estoques de parasitas em estágio sanguíneo. Continuar a seleção nos camundongos recém-infectados até que a parasitemia atinja 2%-5%, momento em que gere estoques e criopreserve²¹.

5. Infecção de mosquitos com as linhagens transgênicas

1. Infectar camundongos B6 com 200 μL de sangue contendo os parasitas selecionados (2 x 10⁵ hemácias infectadas/camundongo, i.v.). Determinar a parasitemia nesses camundongos no dia da alimentação e infecção do mosquito. A parasitemia entre 2%-5% é ideal para a infecção de mosquitos. Uma vez verificada, transferir imediatamente a infecção para as fêmeas de mosquitos Anopheles stephensi de acordo com os passos 5.2-5.4).
   NOTA: As incubadoras contendo mosquitos para infecção devem ser mantidas a 20,5 °C, com 80% de umidade e em um ciclo claro/escuro de 12 h (luzes acesas entre 07:00 e 19:00).
2. No dia anterior à infecção do mosquito, separe as fêmeas de mosquitos colocando uma fonte de calor em cima da gaiola contendo mosquitos machos e fêmeas, como uma bexiga de plástico fina ou luva cheia de água aquecida a 37 °C. Remova as fêmeas de mosquitos, que são atraídas pela fonte de calor, usando um aspirador de insetos e transfira-os para uma gaiola separada e menor para infecção.
   NOTA: Os mosquitos machos podem ser distinguidos dos mosquitos fêmeas por seu tamanho corporal ligeiramente reduzido e antenas plumosas.
3. Injetar um anestésico geral nos camundongos infectados (por exemplo, tribromoetanol/avertin a 2%). Garanta a anestesia completa apertando firmemente a almofada do pé de cada mouse. Se não reagirem, estão suficientemente sedados e prontos para transferir a infecção para os mosquitos.
4. Coloque os camundongos anestesiados sobre as fêmeas de mosquitos enjauladas (a partir do passo 5.2) sob decúbito esternal. Espalhe manualmente as patas dianteiras e traseiras para fornecer a maior área de superfície para a alimentação do mosquito. Deixe os camundongos infectados sobre cada gaiola por um total de 15 min, verificando a cada 5 min para garantir que os camundongos não estejam acordados. Uma vez concluída a alimentação, eutanasiar os camundongos usando deslocamento cervical, ou de acordo com o protocolo institucional de uso de animais, e descartá-los com segurança.

6. Coleta de esporozoítos

1. Verifique o intestino médio do mosquito para oocistos em aproximadamente 10 d.p.i. para verificar a infecção bem-sucedida e o desenvolvimento de Plasmodium dentro dos mosquitos. Isole o intestino médio do mosquito do abdômen removendo o segmento abdominal terminal usando pinças. Visualize o intestino médio sob luz polarizada para a presença de oocistos²².
2. Espera-se que esporozoítos selvagens estejam presentes nas glândulas salivares de mosquitos 18-21 dias após se alimentarem de camundongos infectados. No dia 18, dissecar 5-10 mosquitos para avaliar o número de esporozoítos.
   NOTA: Os mosquitos são lavados e mortos em etanol. Posteriormente, os mosquitos mortos são lavados duas vezes com PBS para remover detritos antes da dissecção.
3. Para isolar e contar os esporozoítos, remova cuidadosamente a cabeça do mosquito enquanto aplica pressão no tórax do mosquito usando pinça ou uma agulha de dissecação fina. As glândulas salivares permanecem aderidas à cabeça removida (Figura 2).
4. Remova quaisquer restos adicionais de mosquito das glândulas salivares e coloque em um tubo de microcentrífuga contendo 400 μL de meio de dissecção de mosquito (meio Ealge modificado de Dulbecco [DMEM] com 1% de soro de camundongo, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina; ver Tabela de Materiais).
5. Interrompa as glândulas salivares isoladas passando por uma seringa agulhada de 30 G 15-20 vezes. Coloque 10 μL das glândulas salivares rompidas no meio de dissecção do mosquito em um hemocitômetro e conte. Ressuspender na concentração desejada de meio de dissecação de mosquito ou PBS para injeção em camundongos, inoculação em culturas de células ou criopreservação a longo prazo^23,24.

Resultados

Determinar a frequência e o desenvolvimento de esquizontos é fundamental para garantir que parasitas viáveis suficientes estejam no estágio ideal para transfecção. Esquizontes imaturos podem ser diferenciados de esquizontes totalmente maduros pela presença de menos merozoítos que não preenchem todo o espaço intracelular da hemácia (Figura 1B). É importante notar que, ao fazer esfregaços sanguíneos a partir de sangue cultivado, as hemácias infectadas podem se romper, resultando...

Discussão

Utilizamos o protocolo acima em nosso laboratório para criar várias linhagens de parasitas transgênicos de P. berghei. Embora otimizado para P. berghei, também usamos com sucesso este protocolo para gerar esporozoítos transgênicos de P. yoelii. Depois de injetar os esquizontos transfectados em camundongos, os parasitas são detectáveis tipicamente no máximo 3 d.p.i. em todos os grupos, incluindo o controle sem plasmídeo. A seleção é iniciada somente após a detecção da parasitemia...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3