Generering av genetiskt modifierade Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria överförs genom inokulering av sporozoitstadiet av Plasmodium av infekterade myggor. Transgent Plasmodium har gjort det möjligt för oss att förstå malarians biologi bättre och har bidragit direkt till utvecklingen av malariavaccin. Här beskriver vi en strömlinjeformad metodik för att generera transgena Plasmodium berghei-sporozoiter.

Malaria är en dödlig sjukdom som orsakas av parasiten Plasmodium och överförs genom bett av honmyggor . Sporozoitstadiet av Plasmodium som deponeras av myggor i huden på ryggradsdjur genomgår en fas av obligatorisk utveckling i levern innan klinisk malaria inleds. Vi vet lite om biologin bakom Plasmodiums utveckling i levern; tillgång till sporozoitstadiet och förmågan att genetiskt modifiera sådana sporozoiter är viktiga verktyg för att studera arten av Plasmodium-infektion och det resulterande immunsvaret i levern. Här presenterar vi ett omfattande protokoll för generering av transgena Plasmodium berghei-sporozoiter. Vi genmodifierar P. berghei i blodstadiet och använder denna form för att infektera Anopheles-myggor när de tar en blodmåltid. Efter att de transgena parasiterna har utvecklats i myggorna isolerar vi parasitens sporozoitstadium från myggornas spottkörtlar för in vivo och in vitro-experiment . Vi demonstrerar protokollets giltighet genom att generera sporozoiter av en ny stam av P. berghei som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet (GFP) subenhet 11 (GFP₁₁), och visar hur det kan användas för att undersöka biologin bakom levermalaria.

Trots framsteg inom läkemedelsutveckling och forskning om förebyggande och behandling av malaria är den globala sjukdomsbördan av malaria fortfarande hög. Över en halv miljon människor dör av malaria varje år, och den högsta dödligheten bland barn som lever i malariaendemiska regioner,^{såsom Afrika söder} om Sahara1. Malaria orsakas av parasiten Plasmodium, som överförs till människor genom bett av honmyggor av hona som bär parasiten i sina spottkörtlar. Det infektiösa stadiet av Plasmodium - sporozoiterna - deponeras i huden hos ryggradsdjuren under en blodmåltid och färdas genom blodomloppet för ....

All forskning som involverar ryggradsdjur i vårt laboratorium utfördes i enlighet med University of Georgias riktlinjer och protokoll för djuranvändning.

1. Generering av P. berghei-infekterade möss

1. Initiera infektion i blodstadiet hos han- eller honmöss, 6-8 veckor gamla C57BL/6 (B6) med vildtypsparasiter av P. berghei. För att göra detta, överför kryokonserverat P. berghei-infekterat blod (2 x 10⁵ infekterade röda blodkroppa.......

Att bestämma frekvensen och utvecklingen av schizonter är avgörande för att säkerställa att tillräckligt många livskraftiga parasiter är i det optimala stadiet för transfektion. Omogna schizonter kan skiljas från fullt mogna schizonter genom närvaron av färre merozoiter som inte fyller hela det intracellulära utrymmet i RBC (Figur 1B). Det är viktigt att notera att när man gör blodutstryk från odlat blod kan infekterade röda blodkroppar brytas upp, vilket resulterar i obse.......

Vi har använt ovanstående protokoll i vårt laboratorium för att skapa flera linjer av transgena P. berghei-parasiter. Även om det är optimerat för P. berghei, har vi också framgångsrikt använt detta protokoll för att generera transgena P. yoelii sporozoiter. Efter att ha injicerat de transfekterade schizonterna i möss kan parasiter vanligtvis inte påvisas senare än 3 dpi i alla grupper, inklusive kontrollen utan plasmid. Selektionen påbörjas först när parasitemi har upptäckts.......

Detta arbete stöddes av National Institutes of Healths anslag AI168307 till SPK.  Vi tackar UGA CTEGD Flow Cytometry Core och UGA CTEGD Microscopy Core. Vi erkänner också bidragen från Ash Pathak, Anne Elliot och personalen på UGA Sporocore för att optimera protokollet. Vi vill tacka Dr. Daichi Kamiyama för värdefulla insikter, diskussioner och de moderplasmider som innehåller GFP₁₁ och GFP _1-10. Vi vill också tacka medlemmarna i Kurup-labbet för deras ständiga stöd, tålamod och uppmuntran.