Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Riepilogo

Di seguito viene presentato un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti di cellule di arto di topo (FACS) attivato dalla fluorescenza, adattato allo studio della regolazione della trascrizione nelle fibre muscolari mediante scissione sotto bersagli e rilascio mediante nucleasi (CUT&RUN).

Abstract

Le analisi dell'intero genoma con popolazioni di piccole cellule sono un vincolo importante per gli studi, in particolare nel campo delle cellule staminali. Questo lavoro descrive un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti dal muscolo dell'arto, un tessuto con un alto contenuto di proteine strutturali. I muscoli degli arti sezionati da topi adulti sono stati interrotti meccanicamente tritando in mezzo integrato con dispasi e collagenasi di tipo I. Al momento della digestione, l'omogenato è stato filtrato attraverso filtri cellulari e le cellule sono state sospese in un tampone FACS. La vitalità è stata determinata con una colorazione di vitalità fissabile e le cellule satelliti immunocolorate sono state isolate mediante FACS. Le cellule sono state lisate con Triton X-100 e i nuclei rilasciati sono stati legati a perle magnetiche di concanavalina A. I complessi nucleo/perla sono stati incubati con anticorpi contro il fattore di trascrizione o le modificazioni istoniche di interesse. Dopo i lavaggi, i complessi nucleo/microperla sono stati incubati con la proteina A-micrococcica nucleasi e la scissione della cromatina è stata iniziata con CaCl₂. Dopo l'estrazione del DNA, sono state generate e sequenziate librerie e i profili per il legame del fattore di trascrizione a livello di genoma e le modifiche covalenti degli istoni sono stati ottenuti mediante analisi bioinformatica. I picchi ottenuti per i vari marcatori istonici hanno mostrato che gli eventi di legame erano specifici per le cellule satelliti. Inoltre, l'analisi dei motivi noti ha rivelato che il fattore di trascrizione era legato alla cromatina attraverso il suo elemento di risposta affine. Questo protocollo è quindi adattato per studiare la regolazione genica nelle cellule satelliti dei muscoli degli arti dei topi adulti.

Introduzione

I muscoli striati scheletrici rappresentano in media il 40% del peso totale del corpo umano¹. Le fibre muscolari mostrano una notevole capacità di rigenerazione in caso di lesione, che è descritta dalla fusione di miociti di nuova formazione e dalla generazione di nuove miofibre che sostituiscono quelle danneggiate². Nel 1961, Alexander Mauro riportò una popolazione di cellule mononucleate che definì cellule satelliti³. Queste cellule staminali esprimono il fattore di trascrizione 7 (PAX7) e si trovano tra la lamina basale e il sarcolemma delle fibre muscolari⁴. È stato riportato che esprimono il cluster di differenziazione 34 (CD34; un marcatore ematopoietico, progenitore endoteliale e delle cellule staminali mesenchimali), l'integrina alfa 7 (ITGA7; un marcatore del muscolo liscio, cardiaco e scheletrico), nonché il recettore delle chemochine C-X-C di tipo 4 (CXCR4; un marcatore linfocitario, ematopoietico e di cellule satelliti)⁵. In condizioni basali, le cellule satelliti risiedono in un particolare microambiente che le mantiene in uno stato di quiescenza⁶. In caso di danno muscolare, si attivano, proliferano e vanno incontro a miogenesi⁷. Tuttavia, contribuendo solo a una frazione minore del numero totale di cellule muscolari, le loro analisi dell'intero genoma sono particolarmente impegnative, specialmente in contesti fisiologici (<1% delle cellule totali).

Sono stati descritti vari metodi per l'isolamento della cromatina dalle cellule satelliti, che coinvolgono l'immunoprecipitazione della cromatina seguita da massicci esperimenti di sequenziamento parallelo (ChIP-seq) o di scissione sotto bersagli e tagmentazione (CUT&Tag). Tuttavia, queste due tecniche presentano alcuni limiti significativi che rimangono incontestati. Infatti, ChIP-seq richiede un'elevata quantità di materiale di partenza per generare una quantità sufficiente di cromatina, gran parte della quale viene persa durante la fase di sonicazione. CUT&Tag è più appropriato per un basso numero di cellule, ma genera più siti di clivaggio fuori bersaglio rispetto a ChIP-seq a causa dell'attività della trasposasi Tn5. Inoltre, poiché questo enzima ha un'elevata affinità per le regioni a cromatina aperta, l'approccio CUT&Tag potrebbe essere utilizzato preferenzialmente per analizzare le modificazioni istoniche o i fattori di trascrizione associati a regioni del genoma attivamente trascritte, invece dell'eterocromatina^{silenziata 8,9}.

Di seguito viene presentato un protocollo dettagliato che consente l'isolamento delle cellule satelliti muscolari degli arti di topo mediante FACS per la scissione sotto i bersagli e il rilascio utilizzando l'analisi della nucleasi (CUT&RUN)^10,11. Le varie fasi comportano l'interruzione meccanica del tessuto, l'ordinamento cellulare e l'isolamento dei nuclei. L'efficacia del metodo, per quanto riguarda la preparazione di una sospensione cellulare vitale, è stata dimostrata eseguendo l'analisi CUT&RUN per le modificazioni degli istoni covalenti e i fattori di trascrizione. La qualità delle cellule isolate rende il metodo descritto particolarmente interessante per la preparazione della cromatina che cattura fedelmente lo stato di occupazione genomica nativa ed è probabile che sia adatta per catturare la conformazione cromosomica in combinazione con il sequenziamento ad alto rendimento in loci specifici (4C-seq) o a livelli a livello di genoma (Hi-C).

Protocollo

I topi sono stati tenuti in un ricovero accreditato, in conformità con le Linee Guida Nazionali per la Cura degli Animali (direttiva 86/609/CEE della Commissione Europea; Decreto francese n. 87-848) sull'uso di animali da laboratorio a fini di ricerca. Le manipolazioni previste sono state presentate al Comitato Etico (Com'Eth, Strasburgo, Francia) e al Ministero della Ricerca Francese (MESR) per la valutazione etica e l'autorizzazione secondo la direttiva 2010/63/UE con il numero APAFIS #22281.

1. Preparazione della sospensione cellulare per l'isolamento di cellule satelliti mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) (Figura 1)

1. Isolamento del tessuto muscolare
   1. Decontaminare gli strumenti per la dissezione muscolare, comprese pinze, bisturi e forbici, utilizzando un detergente (Tabella 1) e risciacquare abbondantemente con acqua distillata.
   2. Preparare due provette da 2 mL (Tabella 1), ciascuna contenente 1 mL di tampone per l'isolamento muscolare, e posizionarle sul ghiaccio per raccogliere i muscoli prelevati.
   3. Sacrificare due topi maschi C57/Bl6J di 10 settimane con asfissia da CO₂ seguita da lussazione cervicale. Spruzzare etanolo al 70% su ogni topo intero. Staccare la pelle dall'arto posteriore usando una pinza. Sezionare tutti i muscoli degli arti che circondano il femore, la tibia e il perone (circa 1 mg di muscoli per topo).
      NOTA: Il numero di cellule satelliti diminuisce dopo 15 settimane di età.
   4. Mettere i muscoli degli arti prelevati in provette da 2 mL contenenti 1 mL di tampone di isolamento muscolare preparato al punto 1.1.2. Raccogli i muscoli del secondo topo seguendo la stessa procedura. Tritare i muscoli raccolti con le forbici su ghiaccio fino ad ottenere frammenti più piccoli di 1 mm³ .
      NOTA: I muscoli sono stati raccolti e tritati principalmente come descritto¹². Eseguire la digestione dei tessuti seguendo il passaggio 1.2 o 1.3.
2. Digestione tissutale con l'enzima collagenasi
   1. Trasferire la sospensione muscolare tritata dai due topi versandoli in una provetta da 50 mL (Tabella 1) contenente 18 mL di tampone di isolamento muscolare (integrato con 5 mL [5 U/mL] di dispasi e 5 mg di collagenasi di tipo I) (Tabella 1).
   2. Chiudere bene la provetta e sigillarla con pellicola da laboratorio (Tabella 1). Immergerlo orizzontalmente a bagnomaria agitato (Tabella 1) a 37 °C a 100 giri/min per 30 min.
   3. Dopo 30 minuti, aggiungere 5 mg di collagenasi di tipo I. Tenere le provette per altri 30 minuti sotto agitazione in un bagnomaria agitato a 37 °C a 100 giri/min.
   4. Dopo la digestione, pipettare la sospensione muscolare su e giù 10 volte con una pipetta da 10 ml per migliorare l'efficienza della dissociazione. Centrifugare a 4 °C a 400 x g per 5 min. Un pellet trasparente sarà visibile sul fondo del tubo. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta da 10 mL, lasciando 5 mL di terreno nella provetta.
      NOTA: Lasciare il terreno aiuta a evitare di stressare le cellule. Aggiungere 10 mL di tampone per l'isolamento muscolare fresco e risospendere il pellet pipettando su e giù con una pipetta da 10 mL.
   5. Posizionare i filtri cellulari da 100 μm, 70 μm e 40 μm (uno per ogni tipo) (Tabella 1) su provette aperte da 50 mL. Pipettare la sospensione sui filtri cellulari successivi (100 μm, 70 μm, 40 μm) e raccogliere il flusso nelle provette da 50 mL, contenenti cellule inferiori a 40 μm.
   6. Centrifugare la sospensione a 4 °C a 400 x g per 5 min. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta da 10 mL fino a quando rimangono 2 mL, quindi utilizzare una pipetta da 0,2-1 mL fino a quando rimangono 100-200 μL. Risospendere il pellet in 2 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (Tabella 2). Incubare su ghiaccio per 3 min.
   7. Centrifugare a 4 °C a 400 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta da 20-200 μL. Risospendere le cellule in 100 μL di tampone FACS freddo (Tabella 2). Mettere sul ghiaccio.
3. Metodo alternativo per la digestione dei tessuti con l'enzima Liberase thermolysin low (TL)
   1. Seguire le descrizioni nel passaggio 1.1. per l'isolamento dei tessuti.
   2. Per la disaggregazione tissutale mediata da Liberase, prelevare i muscoli in 2 mL di tampone di isolamento del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Tabella 2), invece del tampone di isolamento muscolare descritto nel passaggio 1.1.2.
   3. Trasferire la sospensione muscolare tritata dai due topi versandoli in una provetta da 50 mL (Tabella 1) contenente 18 mL di tampone di isolamento RPMI integrato con 300 o 600 μL di Liberase TL a 5 mg/mL (Tabella 1) (cioè, 0,083 mg/mL e 0,167 mg/mL concentrazioni finali, rispettivamente)¹³.
   4. Chiudere bene la provetta e sigillarla con pellicola da laboratorio (Tabella 1). Immergerlo orizzontalmente a bagnomaria agitato (Tabella 1) a 37 °C a 100 giri/min per 30 min.
   5. Dopo la digestione, pipettare la sospensione muscolare su e giù 10 volte con una pipetta da 10 ml per dissociare e migliorare l'efficienza della dissociazione.
   6. Centrifugare a 4 °C a 400 x g per 5 min. Un pellet trasparente sarà visibile sul fondo del tubo. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta da 10 mL, lasciando 5 mL di terreno nella provetta. Lasciare il terreno aiuta a evitare di stressare le cellule. Aggiungere 10 mL di tampone di isolamento RPMI fresco e risospendere il pellet pipettando su e giù con una pipetta da 10 mL.
   7. Posizionare i filtri cellulari da 100 μm, 70 μm e 40 μm (uno per ogni tipo) (Tabella 1) su provette aperte da 50 mL.
   8. Pipettare la sospensione su filtri cellulari successivi (100 μm, 70 μm, 40 μm) e raccogliere il flusso nelle provette da 50 mL, contenenti cellule inferiori a 40 μm.
   9. Centrifugare la sospensione a 4 °C a 400 x g per 5 min. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta da 10 mL fino a quando rimangono 2 mL, quindi utilizzare una pipetta da 0,2-1 mL fino a quando rimangono 100-200 μL.
   10. Risospendere il pellet in 2 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (Tabella 2). Incubare su ghiaccio per 3 min.
   11. Centrifugare a 4 °C a 400 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta da 20-200 μL.
   12. Risospendere le cellule in 100 μL di tampone FACS freddo (Tabella 2). Mettere sul ghiaccio.
4. Preparazione della sospensione cellulare per l'isolamento FACS
   1. Trasferire 10 μL della sospensione cellulare ottenuta nella fase 1.2.12 in una provetta fresca da 1,5 mL. Questo campione costituirà il controllo non colorato o il controllo negativo (Figura 2). Aggiungere 190 μL di tampone FACS, trasferire in una provetta da 5 mL (Tabella 1) e conservare su ghiaccio.
   2. Centrifugare i restanti 90 μL della sospensione cellulare ottenuta nella fase 1.2.12 a 4 °C a 400 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante con una pipetta (volume di punta di 20-200 μL). Incubare le cellule con 400 μL di colorante di vitalità fissabile (Tabella 3) diluito in terreno Eagle modificato (DMEM) privo di siero per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
   3. Lavare le cellule mediante centrifugazione a 4 °C a 400 x g per 5 minuti e aggiungere 100 μL di tampone FACS. Capovolgere delicatamente le provette tre volte e centrifugare di nuovo a 4 °C a 400 x g per 5 min.
   4. Durante il tempo di centrifugazione, preparare 100 μL di una miscela principale di anticorpi primari accoppiati a fluorofori e diretti contro CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 e CXCR4 (Tabella 3), diluiti in tampone FACS.
   5. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante cellulare utilizzando una pipetta (volume della punta di 20-200 μL) e aggiungere la miscela di anticorpi da 100 μL. Capovolgere delicatamente il tubo tre volte. Non vorticare. Incubare al buio su ghiaccio per 30 min.
   6. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta da 20-200 μL e aggiungere 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x per lavare le cellule. Capovolgere delicatamente il tubo tre volte. Ripetere la centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante con una pipetta da 20-200 μL.
   7. Risospendere il pellet cellulare in 500 μL di tampone FACS e trasferire la sospensione in una provetta da 5 mL.
      NOTA: la sospensione cellulare ottenuta dalla digestione di Liberase viene lavorata allo stesso modo.
5. Selezione delle cellule satelliti da parte di FACS
   1. Ruotare brevemente la sospensione cellulare (2-5 sec) ed elaborare le cellule su un citometro a flusso dotato di un ugello da 100 μm (Tabella 1).
   2. Determinare le varie dimensioni del gate in base al campione non colorato conservato al punto 1.4.1 (Figura 2).
   3. Rivestire una provetta da 5 mL con 1 mL di siero fetale puro di vitello (FCS) per migliorare la raccolta cellulare e aggiungere 500 μL di tampone FACS.
   4. Sostituire il campione non colorato con il campione marcato con anticorpi.
   5. Selezionare la popolazione di interesse in base all'area di dispersione diretta (FSC-A) e all'area di dispersione laterale (SSC-A) (Figura 3A) e rimuovere le celle doppiette con l'FSC-A e l'altezza di dispersione diretta (FSC-H) (Figura 3B)¹⁴.
   6. Identificare le cellule viventi con colorazione negativa alla vitalità fissabile (Figura 3C).
   7. Selezionare le celle negative per CD31, CD45, TER119 e CD11b (Figura 3D).
   8. Per identificare le cellule satelliti, selezionare prima le cellule positive per CD34 e ITGA7 (Figura 3E), quindi selezionare le cellule CXCR4 positive sulla popolazione selezionata per CD34 e ITGA7 (Figura 3F).
   9. Raccogliere le cellule selezionate (tra 40.000 e 80.000 cellule, a seconda della qualità del preparato) nella provetta rivestita da 5 mL contenente 500 μL di tampone FACS.

2. Validazione della popolazione isolata in coltura tissutale

1. Rivestimento vetrino con idrogel
   1. Diluire 280 μL di una matrice qualificata con cellule staminali embrionali umane (hESC) idrogel puro (Tabella 1) in 12 mL di terreno DMEM/F12 privo di siero.
   2. Rivestire un vetrino della camera (Tabella 1) con la soluzione di idrogel e incubarlo per una notte a 4 °C.
   3. Il giorno successivo, incubare il vetrino della camera a 37 °C e 5% di CO₂ per 1 ora prima della semina cellulare.
2. Crescita e differenziamento cellulare
   1. Placcare circa 20.000 cellule, ottenute dalla fase 1.5.9, per pozzetto, e farle crescere nel terreno di coltura (Tabella 2) per 5 giorni. Acquisire immagini a contrasto di fase utilizzando un microscopio in campo chiaro (Figura 4A), prima di elaborarle per l'analisi in immunofluorescenza per garantire la qualità della preparazione (Figura 4B).
   2. Per indurre la miogenesi, far crescere cellule satelliti amplificate dal punto 2.2.1 in mezzo miogenico (Tabella 2) per altri 7 giorni. Acquisire immagini a contrasto di fase utilizzando il microscopio in campo chiaro (Figura 4C) prima di elaborarle per l'analisi in immunofluorescenza per garantire la qualità della preparazione (Figura 4D).
3. Analisi di immunocitofluorescenza
   1. Rimuovere delicatamente il terreno, lavare le cellule che sono state coltivate sul vetrino della camera con 100 μL di PBS 1x due volte e fissarle con 100 μL di paraformaldeide al 4 % (PFA) a RT per 1 ora.
      NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito con cura. Un piccolo volume di terreno deve essere sempre tenuto nella camera per evitare di stressare le cellule e il PBS deve essere versato attraverso le pareti della camera.
   2. Lavare le cellule tre volte con 100 μL di PBS 1x, integrato con lo 0,1% di Tween 20 (PBST) per permeabilizzare le membrane cellulari.
   3. Bloccare i segnali aspecifici mediante incubazione in 100 μL di 1x PBST integrato con 5% di FCS (PBST-FCS) a RT per 1 ora.
   4. Incubare le cellule con 100 μL di una miscela principale di anticorpi anti-PAX7 e anti-distrofina (DMD) (diluiti in 1x PBST-FCS) a 4 °C durante la notte, per rilevare rispettivamente le cellule satelliti e le miofibre.
   5. Lavare le cellule tre volte con 100 μL di 1x PBST e incubarle con 100 μL di anticorpi secondari di capra anti-topo Cy3 o di capra anti-coniglio Alexa 488 (Tabella 3) diluiti in 1x PBST-FCS a RT per 1 ora.
   6. Dissociare i pozzetti della camera dal vetrino utilizzando l'attrezzatura fornita dal fornitore, aggiungere 20 μL di mezzo di montaggio acquoso con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e coprire il vetrino con un vetrino coprioggetto (Tabella 1).
   7. Osservare e catturare l'immagine delle cellule colorate con un microscopio confocale.
   8. Elaborare le immagini utilizzando un software di analisi delle immagini (Figure 4B,D).

3. Analisi CUT&RUN

1. Preparazione del campione per l'analisi CUT&RUN su celle satelliti isolate da FACS
   NOTA: CUT&RUN è stato eseguito essenzialmente come descritto^10,15. La composizione del buffer è presentata in Tabella 2.
   1. Per il test CUT&RUN, utilizzare circa 40.000 cellule ottenute nel metodo 1, fase 1.5.9, per campione/anticorpo che deve essere testato.
   2. Centrifugare le cellule satelliti isolate da FACS a RT a 500 x g per 10 minuti, quindi scartare il surnatante utilizzando una pipetta (volume del puntale di 20-200 μL).
   3. Lavare le cellule con 1 mL di PBS 1x, centrifugarle a RT a 500 x g per 5 minuti, scartare il surnatante utilizzando una pipetta (volume del puntale 0,2-1 mL) e risospenderle in 1 mL di tampone per estrazione nucleare a freddo (Tabella 2). Incubare su ghiaccio per 20 min.
   4. Durante l'incubazione, preparare una provetta da 1,5 mL contenente 850 μL di tampone per legante a freddo (Tabella 2) e aggiungere 20 μL di microsfere magnetiche rivestite di concanavalina A per campione (Tabella 1).
   5. Lavare le perline due volte con 1 mL di tampone per legatura a freddo utilizzando una griglia magnetica (Tabella 1). Per ogni lavaggio o sostituzione del tampone durante la procedura, lasciare che le perle si accumulino sul lato della provetta sul rack magnetico per 5 minuti prima di rimuovere il surnatante eliminato con una pipetta (volume del puntale di 0,2-1 mL). Quindi, risospendere delicatamente in 300 μL di tampone di legame a freddo.
   6. Centrifugare i nuclei a 4 °C a 600 x g per 5 minuti e risospenderli delicatamente in 600 μL di tampone di estrazione nucleare. Miscelare delicatamente i 600 μL di nuclei estratti con i 300 μL di liquame di concanavalina A e incubare a 4 °C per 10 min.
   7. Rimuovere il surnatante utilizzando un rack magnetico, come descritto al punto 3.1.4, e risospendere delicatamente i nuclei legati alle microsfere con 1 mL di tampone bloccante a freddo (Tabella 2). Incubare a RT per 5 min.
   8. Rimuovere il surnatante utilizzando una rastrelliera magnetica e lavare due volte i nuclei legati alle microsfere con 1 mL di tampone di lavaggio a freddo (Tabella 2). Durante il secondo lavaggio, dividere equamente i nuclei legati alle microsfere in provette da 1,5 mL. Ogni provetta verrà trattata con un anticorpo specifico nella fase successiva.
      NOTA: In questo esempio, 250 μL di nuclei legati a microsfere sono stati divisi in quattro provette da 1,5 mL.
   9. Separare il surnatante utilizzando un rack magnetico, come descritto al punto 3.1.4, e aspirare con una pipetta. Risospendere delicatamente i complessi nucleo/microsfere con un anticorpo primario specifico (Tabella 3), o una IgG di un'altra specie (in questo caso coniglio) diluita in 250 μL di tampone di lavaggio a freddo. Incubare a 4 °C per una notte agitando delicatamente.
      NOTA: Gli anticorpi utilizzati in questo caso sono diretti contro AR, H3K4me2 e H3K27ac.
   10. Rimuovere il surnatante con un rack magnetico, come descritto al punto 3.1.4, lavare due volte i nuclei legati alle microsfere con 1 mL di tampone di lavaggio a freddo e risospendere in 100 μL di tampone di lavaggio a freddo.
   11. Diluire la proteina A-micrococcica nucleasi a 1,4 ng/μL in 100 μL per campione di tampone di lavaggio a freddo.
   12. Aggiungere 100 μL di proteina A-micrococcica nucleasi ai 100 μL di campione ottenuti al punto 3.1.11 e incubare a 4 °C per 1 h agitando.
   13. Rimuovere il surnatante con una rastrelliera magnetica, come descritto al punto 3.1.4, lavare due volte con 1 mL di tampone di lavaggio a freddo e risospendere i nuclei legati alle microsfere in 150 μL di tampone di lavaggio a freddo.
   14. Per avviare la scissione del DNA, aggiungere 3 μL di 100 mM di CaCl₂ ai 150 μL di campione, mescolare rapidamente con un gesto e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Arrestare la reazione aggiungendo 150 μL di tampone di arresto e incubare a 37 °C per 20 minuti per digerire l'RNA e rilasciare i frammenti di DNA.
   15. Per l'estrazione del DNA, centrifugare i campioni a 16.000 x g a 4 °C per 5 minuti.
   16. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microfuge e scartare il pellet e le perline.
   17. Aggiungere 3 μL di sodio dodecil solfato (SDS) al 10% e 2,5 μL di proteinasi K. 20 mg/mL Miscelare per inversione. Incubare per 10 minuti a 70 °C (senza agitazione).
   18. Aggiungere 300 μL di alcool fenolo/cloroformio/isoamilico, vortex, trasferire in provette ad aggancio di fase da 2 mL (pre-centrifugate per 5 minuti a 16.000 x g) e centrifugare per 5 minuti a 16.000 x g a 4 °C.
   19. Aggiungere 300 μL di cloroformio nella stessa provetta e centrifugare per 5 minuti a 16.000 x g a 4 °C. Prelevare il surnatante (~300 μL) con una pipetta (volume del puntale di 0,2-1 mL) e trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 mL.
   20. Aggiungere 1 μL di glicogeno (concentrazione di 20 mg/mL).
   21. Aggiungere 750 μL di etanolo al 100% e precipitare per una notte a -20 °C.
   22. Pellet il DNA mediante centrifugazione per 15 minuti a 16.000 x g a 4 °C. Lavare il pellet con 1 mL di etanolo al 100%, centrifugare per 5 minuti a 16.000 x g, scartare il surnatante, centrifugare per 30 s a 16.000 x g e rimuovere il liquido con una pipetta (volume del puntale 20-200 μL).
   23. Asciugare il pellet all'aria per ~5 min. Risospendere in 25 μL di 1 mM di Tris-HCl (pH 8) e 0,1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; pH 8).
2. Analisi bioinformatica
   1. Preparare librerie da DNA immunoclivato e sequenziarle come letture a 100 bp con l'aiuto della piattaforma genomica come descritto¹⁶.
   2. Rimuovere le letture che si sovrappongono alla regione della blacklist ENCODE (V2) e separare le letture rimanenti in due gruppi: dimensione del frammento <120 bp (senza nucleosoma, in generale per i fattori di trascrizione) e dimensione del frammento >150 bp (con nucleosomi, normalmente per i marcatori istonici). Mappare il genoma di riferimento mm10 usando Bowtie 2 (v2.3.4.3)¹⁷.
   3. Genera file di grandi dimensioni con bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
   4. Conserva le letture mappate in modo univoco per ulteriori analisi.
   5. Genera file bedgraph grezzi con genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
   6. Utilizzare l'algoritmo SEACR 1.3 (opzione rigorosa) per la chiamata di picco. Caricare il file del bedgraph dei dati di destinazione in formato bedgraph UCSC che omette le regioni contenenti il segnale zero e il file del bedgraph dei dati di controllo (IgG) per generare una soglia empirica per il picco di chiamata¹⁸.
   7. Eseguire un'analisi di correlazione di Pearson con deeptools per determinare la somiglianza tra i campioni¹⁹. Utilizzare la riga di comando multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, seguito da plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
   8. Visualizzare i profili di intensità dell'intero genoma con IGV²⁰ utilizzando i file bedgraph e i picchi di file bed ottenuti da SEACR.
   9. Utilizzare HOMER per l'annotazione dei picchi e la ricerca dei motivi²¹.
   10. Infine, confrontare i set di dati con quelli pubblicati in precedenza con il browser ChIP-Atlas Peak per visualizzarli su IGV e/o l'analisi dell'arricchimento utilizzando i file bed generati da SEACR come set di dati di input²².

Risultati

Le cellule satelliti dei muscoli scheletrici del topo sono state isolate combinando i protocolli di Gunther et al. (di seguito Protocollo 1)¹² e di Liu et ^al.23 (di seguito Protocollo 2). Poiché sono state osservate fibre muscolari non digerite dopo la digestione quando si utilizzava la concentrazione di collagenasi e dispasi proposta nel Protocollo 1, la quantità di enzimi è stata aumentata per migliorare la dissociazione delle fibre muscolari, come descritto nei passag...

Discussione

Il presente studio riporta un metodo standardizzato, affidabile e di facile esecuzione per l'isolamento e la coltura di cellule satelliti di topo, nonché la valutazione della regolazione trascrizionale mediante il metodo CUT&RUN.

Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la disgregazione muscolare e la digestione delle fibre per garantire un elevato numero di cellule raccolte. Nonostante l'aumento della concentrazione enzimatica, sono state ottenute più cellule viventi ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724