Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Summary

Di seguito viene presentato un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti di cellule di arto di topo (FACS) attivato dalla fluorescenza, adattato allo studio della regolazione della trascrizione nelle fibre muscolari mediante scissione sotto bersagli e rilascio mediante nucleasi (CUT&RUN).

Abstract

Le analisi dell'intero genoma con popolazioni di piccole cellule sono un vincolo importante per gli studi, in particolare nel campo delle cellule staminali. Questo lavoro descrive un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti dal muscolo dell'arto, un tessuto con un alto contenuto di proteine strutturali. I muscoli degli arti sezionati da topi adulti sono stati interrotti meccanicamente tritando in mezzo integrato con dispasi e collagenasi di tipo I. Al momento della digestione, l'omogenato è stato filtrato attraverso filtri cellulari e le cellule sono state sospese in un tampone FACS. La vitalità è stata determinata con una colorazione di vitalità fissabile e le cellule satelliti immunocolorate sono state isolate mediante FACS. Le cellule sono state lisate con Triton X-100 e i nuclei rilasciati sono stati legati a perle magnetiche di concanavalina A. I complessi nucleo/perla sono stati incubati con anticorpi contro il fattore di trascrizione o le modificazioni istoniche di interesse. Dopo i lavaggi, i complessi nucleo/microperla sono stati incubati con la proteina A-micrococcica nucleasi e la scissione della cromatina è stata iniziata con CaCl₂. Dopo l'estrazione del DNA, sono state generate e sequenziate librerie e i profili per il legame del fattore di trascrizione a livello di genoma e le modifiche covalenti degli istoni sono stati ottenuti mediante analisi bioinformatica. I picchi ottenuti per i vari marcatori istonici hanno mostrato che gli eventi di legame erano specifici per le cellule satelliti. Inoltre, l'analisi dei motivi noti ha rivelato che il fattore di trascrizione era legato alla cromatina attraverso il suo elemento di risposta affine. Questo protocollo è quindi adattato per studiare la regolazione genica nelle cellule satelliti dei muscoli degli arti dei topi adulti.

Introduction

I muscoli striati scheletrici rappresentano in media il 40% del peso totale del corpo umano¹. Le fibre muscolari mostrano una notevole capacità di rigenerazione in caso di lesione, che è descritta dalla fusione di miociti di nuova formazione e dalla generazione di nuove miofibre che sostituiscono quelle danneggiate². Nel 1961, Alexander Mauro riportò una popolazione di cellule mononucleate che definì cellule satelliti³. Queste cellule staminali esprimono il fattore di trascrizione 7 (PAX7) e si trovano tra la lamina basale e il sarcolemma delle fibre muscolari⁴. È stato rip....

Protocol

I topi sono stati tenuti in un ricovero accreditato, in conformità con le Linee Guida Nazionali per la Cura degli Animali (direttiva 86/609/CEE della Commissione Europea; Decreto francese n. 87-848) sull'uso di animali da laboratorio a fini di ricerca. Le manipolazioni previste sono state presentate al Comitato Etico (Com'Eth, Strasburgo, Francia) e al Ministero della Ricerca Francese (MESR) per la valutazione etica e l'autorizzazione secondo la direttiva 2010/63/UE con il numero APAFIS #22281.

Discussion

Il presente studio riporta un metodo standardizzato, affidabile e di facile esecuzione per l'isolamento e la coltura di cellule satelliti di topo, nonché la valutazione della regolazione trascrizionale mediante il metodo CUT&RUN.

Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la disgregazione muscolare e la digestione delle fibre per garantire un elevato numero di cellule raccolte. Nonostante l'aumento della concentrazione enzimatica, sono state ottenute più cellule viventi .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724