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要約

このプロトコルは膵臓のβ細胞のmitophagyの量的な分析のための2つの方法を輪郭を描く: 最初に、細胞透過性のミトコンドリア特定の染料の組合せ、および二番目に、遺伝的にコードされたmitophagyのレポーター。これら2つの手法は補完的であり、特定のニーズに基づいて展開できるため、ミトコンドリアの品質管理に定量的に取り組む際の柔軟性と精度を高めることができます。

要約

マイトファジーは、最適なミトコンドリア機能を維持するために必要な品質管理メカニズムです。機能不全のβ細胞マイトファジーは、不十分なインスリン放出をもたらします。マイトファジーの高度な定量的評価には、多くの場合、遺伝子レポーターの使用が必要です。ミトコンドリアを標的としたpH感受性二重励起レシオメトリックプローブを発現し、フローサイトメトリーでマイトファジーを定量化するmt-Keimaマウスモデルは、β細胞で最適化されています。酸性と中性のmt-Keima波長の放射の比率は、マイトファジーを頑健に定量化するために使用できます。しかし、複雑な遺伝子マウスモデルや、初代ヒト膵島などのトランスフェクションが困難な細胞を扱う場合、遺伝的マイトファジーレポーターの使用は困難な場合があります。このプロトコルはMtPhagyを使用して第一次膵島のβ細胞mitophagyを定量化する新しい補足の染料ベースの方法を記述する。MtPhagyは、ミトコンドリアに蓄積し、ミトコンドリアが低pH環境にあるとき(マイトファジー中のリソソームなど)に蛍光強度を増加させる、pH感受性の細胞透過性色素です。MtPhagy 色素を、β細胞を選択する Zn2+ インジケーターであるフルオジン-3-AM、およびミトコンドリア膜電位を評価するためのテトラメチルローダミン、エチルエステル(TMRE)と組み合わせることで、フローサイトメトリーを介してβ細胞内のマイトファジーフラックスを特異的に定量できます。これら2つのアプローチは高度に補完的であり、多数のβ細胞モデルにおけるミトコンドリアの品質管理の評価において柔軟性と精度を可能にします。

概要

膵臓のβ細胞は、代謝要求を満たすためにインスリンを産生および分泌し、β細胞機能障害は、1型糖尿病と2型糖尿病の両方で高血糖と糖尿病発症の原因となります。β細胞は、ミトコンドリアのエネルギーと代謝出力を介してグルコース代謝とインスリン分泌を結合し、機能的なミトコンドリア質量の予備力に依存します1,2,3。最適なβ細胞機能を維持するために、β細胞はミトコンドリアの品質管理メカニズムに依存して、老化または損傷したミトコンドリアを除去し、機能的なミトコンドリア質量を維持します4。選択的ミトコンドリアオートファジーは、マイトファジーとも呼ばれ、ミトコンドリア品質管理経路の重要な要素です。

生細胞におけるマイトファジーの評価は、マイトファジー中に起こるミトコンドリアpHの変化に依存することがよくあります。ミトコンドリアのpHはわずかにアルカリ性で、健康なミトコンドリアは通常、pH中性のサイトゾルに存在します。マイトファジーの間、損傷または機能不全のミトコンドリアは選択的にオートファゴソームに取り込まれ、最終的に酸性リソソーム内で除去されます5。mt-Keima6、mitoQC7、CMMR8などのいくつかのin vivoトランスジェニックマイトファジーレポーターマウスモデル、およびCox8-EGFP-mCherryプラスミド9などのトランスフェクタブルマイトファジープローブは、このpH変化を利用してマイトファジーの定量的評価を提供します。mt-Keima pH感受性二重励起レシオメトリックプローブを発現するトランスジェニックマウスの使用は、フローサイトメトリーによる膵島およびβ細胞のマイトファジー評価に最適化されています10,11。酸性から中性へのmt-Keima波長発光の比(561 nmの酸性励起と480 nmの励起に対する酸性の割合)は、マイトファジー6,12の頑健な定量化に用いることができる。

このプロトコルはmtKeimaのtransgenicマウス10,11から隔離される第一次膵島およびβセルのmitophagyの流束を査定するために最大限に活用されたアプローチを記述する。mt-Keimaは高感度プローブですが、複雑な動物育種スキームや細胞のトランスフェクションが必要であり、他の遺伝子モデルや初代ヒト膵島と組み合わせて作業する場合、困難な場合があります。さらに、中性細胞集団と酸性細胞集団を同定するために複数の蛍光レーザーと検出器を使用することで、他の蛍光レポーターのコンビナトリアル使用を制限することができます。

これらの課題を克服するために、このプロトコルでは、孤立したマウス膵島からのβ細胞のマイトファジーを強力に検出するための補完的な単一の蛍光チャネル、色素ベースの方法も説明します。MtPhagy法と呼ばれるこのアプローチは、3つの細胞透過性色素の組み合わせを利用して、β細胞を選択し、マイトファジーを活発に受けている細胞集団を定量し、ミトコンドリア膜電位(MMPまたはΔψm)を同時に評価します。

これらの色素の最初のものは、Ex/Em 494/516 nm13を有する細胞透過性Zn2+指示薬であるFluozin-3-AMです。マウス膵島は、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞など、機能的に異なる細胞の不均一な集団で構成されています。β細胞はマウス膵島内の細胞の約80%を占め、インスリン顆粒内のZn2+濃度が高いため、他の膵島細胞タイプと区別することができ14,15、フルオジン-3-AMの高集団としてβ細胞の同定を可能にします。化学結合を介してミトコンドリアに固定化され、弱い蛍光を発するpH感受性染料であるMtPhagy色素もこのプロトコルで利用されています16。マイトファジー誘導により、損傷したミトコンドリアが酸性リソソームに取り込まれ、MtPhagy色素は低pH環境(Ex/Em 561/570-700 nm)内で蛍光強度を増加させます。

さらに、テトラメチルローダミン、エチルエステル(TMRE)は、MMPの評価に使用されます。TMREは細胞透過性の正電荷を帯びた色素(Ex/Em 552/575 nm)であり、膜電位によって維持される相対的な負電荷により、健康なミトコンドリアによって隔離される17。損傷したミトコンドリアや不健康なミトコンドリアは、膜電位を消散させ、TMREを隔離する能力を低下させます。これらの色素を併用すると、マイトファジーを起こしているβ細胞は、フローサイトメトリーによってフルオジン高MtPhagy高TMRE低集団として識別できます。マイトファジーは静的プロセスではなく動的プロセスであるため、このプロトコルは、MMP18の消散後にマイトファジーを誘導するK +-イオノフォアであるバリノマイシンを使用してマイトファジーフラックスを評価するように最適化されました。バリノマイシンの存在下と非存在下でのマイトファジーの比較により、異なるサンプルグループにおけるマイトファジーフラックスの評価が可能になります。

現在のアプローチは色素ベースの性質を持っているため、ヒト膵島やその他のトランスフェクションが困難な細胞タイプに外挿することができ、mt-Keimaプロトコルとは異なり、複雑な動物育種スキームの必要性を回避します。このプロトコルの包括的な目標は、2つの独立したフローサイトメトリーベースの方法を介して、単一細胞レベルでβ細胞のマイトファジーを定量化することです。まとめると、このプロトコルは、ミトコンドリアの品質管理の定量的研究における精度と柔軟性の両方を可能にする2つの強力で補完的な方法を説明しています。

プロトコル

このプロトコルで提示された動物実験は、ミシガン大学の施設的動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました。この研究には、15週間の通常の脂肪食(RFD)または高脂肪食(HFD)のいずれかを摂取した20週齢の雄のC57BL / 6Jマウスを使用しました。

1. 色素ベースのMtPhagyアプローチによるマイトファジーの評価(方法1)

  1. マウス膵島の準備と治療
    1. 以下の手順に従って、膵島培養とバリノマイシン曝露を行います。
      1. 前述の方法に従って、通常の脂肪食(RFD)または高脂肪食(HFD、60 kcal%脂肪19)マウスのいずれかから膵島を分離します2,10。
      2. 100ユニット/mLの抗真菌性抗生物質、50ユニット/mLのペニシリン-ストレプトマイシン、1 mMピルビン酸ナトリウム、10 mMのHEPES、および10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMI培地中で、37°Cで一晩培養した膵島サンプルを採取します( 資料表を参照)。この培地を「膵島培地」と呼ぶことにする。
      3. ピペットを使用して、条件ごとに100個の膵島を、2 mLの膵島培地中の6cmシャーレに選びます。
        注:このプロトコルに使用される条件:(1)未染色対照:未染色RFD膵島;(2)DAPIのみのコントロール:DAPIで染色されたRFD膵島。(3)フルオジン-3-AMのみのコントロール:フルオジン-3-AMで染色されたRFD膵島。(4)MtPhagyのみのコントロール:MtPhagyで染色されたRFD膵島。(5)TMREのみのコントロール:TMREで染色されたRFD膵島。(6)未処理のRFD:MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM、およびDAPIで染色されたRFD膵島。(7)バリノマイシン曝露RFD膵島:バリノマイシンに曝露され、MtPhagy、TMRE、フルオジン-3-AM、およびDAPIで染色されたRFD膵島。(8)未処理のHFD:MtPhagy、TMRE、Fluorozin-3-AM、およびDAPIで染色されたHFD膵島。(9)バリノマイシン曝露HFD膵島:バリノマイシンに曝露され、MtPhagy、TMRE、フルオジン-3-AM、およびDAPIで染色されたHFD膵島。
      4. バリノマイシンに曝露された条件(7)および(9)(上記の注を参照)では、2 μLの250 nΜのバリノマイシンストック( 材料表を参照)をペトリ皿の膵島に3時間添加し、マイトファジーを誘導します。
    2. 単一細胞の解離を実行します。
      1. バリノマイシンに3時間曝露した後、ピペットを使用して、各条件から100個の膵島を別々の微量遠心チューブに摘み取ります。
      2. 膵島を350 x g で10°Cで1分間スピンし、ピペットを使用して上清を廃棄します。
      3. サンプルを 1 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 2 回洗浄し、各洗浄の間にスピンステップ(350 x g/1 分、10 °C)します。洗浄のたびにピペットで上清を廃棄してください。
      4. 膵島を単一細胞に解離させるには、500 μLの0.05%トリプシン(37°Cに予熱)を1つのサンプルの微量遠心チューブに添加して、膵島の過剰消化を防ぎます。膵島が目に見える形で分散するまで、繰り返し上下にピペットで移動します。
      5. 予熱した膵島培地1 mLを直ちに添加し、トリプシンを中和します。トリプシン処理と中和を各サンプルに対して1つずつ繰り返します。
      6. サンプルを 500 x g で 10 °C で 5 分間スピンします。 ペレットを乱さないように注意しながら、ピペットで上清を取り除きます。
        注:ペレットは、バリノマイシンに曝露されたサンプルではデリケートです。
      7. 100ユニット/mLの抗真菌性抗生物質、50ユニット/mLのペニシリン-ストレプトマイシン、1 mMピルビン酸ナトリウム、10 mMのHEPES、および10%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加したRPMI培地、フェノールレッドなしでサンプルを2回洗浄します。この媒体を「膵島流動媒体」と呼ぶことにする。各洗浄の間にスピンステップ(350 x g/1分、10°C)を含めます。洗浄のたびにピペットで上清を廃棄してください。
    3. 細胞をMtPhagy、TMRE、Fluorozin-3-AM、およびDAPIで染色し、フローサイトメトリーの準備をします。
      1. 膵島サンプルを500 μLの膵島流動培地に再懸濁します。
      2. 0.25 μL の 100 μM MtPhagy ストック( 材料表を参照)を、MtPhagy 色素を投与するチューブに添加します(条件 4、6、7、8、9、ステップ 1.1.1 に注)。
      3. 0.25 μL の 100 μM TMRE ストック( 材料表を参照)を、TMRE 色素を添加するチューブに添加します(条件 5、6、7、8、9)。
      4. フルオジン-3-AM色素を添加するチューブに、0.25 μLの1 mM Fluorozin-3-AMストック( 材料表を参照)を添加します(条件3、6、7、8、9)。
      5. ボルテックスチューブを低速で5秒間混合します。
      6. 微量遠心チューブをアルミホイルで包んで光から保護し、37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーションの途中で、ボルテックスチューブを低速で5〜10秒間混合します。
      7. インキュベーション後、サンプルを350 x g で10°Cで1分間遠心分離します。 上清はピペットで廃棄してください。
      8. サンプルを500 μLの膵島流動培地に再懸濁します。0.2 μg/mL の DAPI(材料表を参照)を条件 2、6、7、8、9 に添加します。
      9. サンプルを350 x g で10°Cで1分間スピンします。 ピペットを使用して上清を廃棄し、500 μLの膵島流動培地に再懸濁します。
      10. サンプルを氷の上に置きます。
  2. フローサイトメトリー
    1. 装置を起動します( 材料表を参照)。
      注:適切なフィルターを備えたフローサイトメーターであれば、どれでも機能します。この試験では、以下のフィルターを使用しました:(1)DAPIのVL1:励起/発光-405 nm/440 nm(50 nm);(2)フルオジン-3-AMのBL1:励起/発光-488 nm/530 nm(30 nm);(3)MtPhagy色素のBL2:励起/発光 - 488 nm/590 nm(40 nm);(4) TMREのYL1:励起/発光 - 561 nm/585 nm (16 nm)。
    2. 前方散乱(FSC)と側方散乱(SSC)の電圧を調整して、細胞集団が散布図の中心になるようにします。このプロトコルでは、セルがFSC-A対FSC-A 内に均等に収まるようにするために、FSCで120V、SSCで260Vの電圧を使用しました。SSC-Aプロット(図1A)。
    3. 非単一セルを除外するには、FSC-H vs.FSC-Wの後にSSC-Hが続く vs.SSC-W(図1B、C)。
    4. DAPIの電圧と補償を調整して、ライブβセルをフィルタリングします。未染色のRFDサンプルに基づいて、使用する各蛍光色素の蛍光ゲートを設定します(図1D-F)。
      注:各チャネルに使用される電圧:(1)VL1:320-360 V;(2)BL1:300-340 V;(3)BL2:260-300 V;(4)YL1:300-340 V。
    5. ゲートが確立されたら、サンプルごとに 10,000 個のイベントを収集します。
      注:このゲーティングアプローチを利用して、基礎条件下およびバリノマイシン誘導時のマイトファジーレベルをRFD膵島とHFD膵島の両方で評価しました(図2)。
    6. 分析のためにデータをFCSファイルとして保存します。

2. 遺伝子コードmt-Keimaレポーターを用いたマイトファジーの評価(方法2)

  1. マウス膵島調製と単一細胞解離
    1. 以下の手順に従って、膵島培養とバリノマイシン曝露を行います。
      1. 野生型(WT)およびmt-Keima/+(mt-Keima)マウスから膵島を単離する6.この方法では、20週齢の雄のWTまたはmt-Keima/+給餌RFDマウスを使用しました。
      2. 膵島培地中で37°Cで一晩培養した膵島サンプル。
      3. ピペットを使用して、条件ごとに100個の膵島を、2 mLの膵島培地を含む6cmのシャーレに選びます。
        注:このプロトコルに使用される条件:(1)染色されていないコントロール:染色されていないWT膵島;(2)DAPIのみのコントロール:DAPIで染色されたWT膵島。(3)フルオジン-3-AMのみのコントロール:フルオジン-3-AMで染色されたWT膵島。(4)mt-Keimaのみのコントロール:未染色のmt-Keima/+島。(5)未処理:フルオジン-3-AMおよびDAPIで染色されたmt-Keima/+膵島。(6)バリノマイシン:バリノマイシンに曝露され、フルオジン-3-AMおよびDAPIで染色されたmt-Keima/+膵島。
      4. 状態(6)のバリノマイシン曝露では、2 μLの250 nMバリノマイシンストックをペトリ皿の膵島に3時間添加し、マイトファジーを誘導します。
    2. 単一細胞の解離を実行します。
      1. ステップ1.1.2の説明に従って、単一細胞の解離ステップを実行します。
    3. 細胞をフルオジン-3-AMおよびDAPIで染色します。
      1. 膵島サンプルを500 μLの膵島流動培地に再懸濁します。
      2. 0.25 μL の 1 mM Fluorozin-3-AM ストックを、Fluorozin-3-AM 色素を添加したチューブに添加します(条件 3、5、6)。
      3. 細胞を37°Cでインキュベートし、ステップ1.1.3.5-1.3.10の説明に従ってDAPI処理に進みます。
  2. フローサイトメトリー
    1. 測定器を起動します。適切なフィルターを備えたフローサイトメーターであれば、どれでも機能します。
      注:この研究では、次のフィルターを使用しました:(1)DAPIのVL1:励起/発光-405 nm/440 nm(50 nm);(2)フルオジン-3-AMのBL1:励起/発光-488 nm/530 nm(30 nm);(3) VL3 for mt-Keima neutral: 励起/発光 - 405 nm/603 nm (48 nm);(4) mt-Keima 酸の YL2: 励起/発光 - 561 nm/620 nm (15 nm)。
    2. FSCおよびSSC電圧を調整し、手順1.2.2-1.2.3の説明に従って非単一セルを除外します(図3A-C)。
    3. DAPI、フルオジン-3-AM、mt-Keimaの電圧と補正を、無染色および単一陽性コントロール(条件1〜4)を使用して調整し、蛍光陽性細胞集団が未染色細胞と区別できるようにします。各チャンネルに適切な補償を適用したら、DAPI負ゲートとフルオジン-3-AM正ゲートを設定して、生βセルをフィルタリングします(図3D-E)。
    4. mt-Keima陽性サンプル(条件4)を用いてトライアングルゲーティングスキームを設定し、酸性細胞集団と中性細胞集団を同定します(図3F)。
      注:電圧は通常各チャネルに使用されます:(1)VL1:320-340 V;(2)BL2:260-280 V;(3)VL3:280-300 V;(4)YL2:280-300 V。
    5. ゲートが確立されたら、サンプルごとに 10,000 個のイベントを収集します。条件5と6のゲーティングスキームを図3A-Gに示します。
    6. 分析のためにデータをFCSファイルとして保存します。

結果

色素ベースのMtPhagyアプローチによるマイトファジーの評価
この色素ベースのアプローチは、Fluozin-3-AM、TMRE、MtPhagy、およびDAPIを使用して死細胞を除外し、遺伝子レポーターを必要とせずに初代マウスβ細胞内のマイトファジーフラックスを分析するように最適化されました。マイトファジーを誘導するためにこれらの染料をバリノマイシンと組み合わせることにより、このプ?...

ディスカッション

このプロトコルは、分離された一次マウス膵島のマイトファジーフラックスを定量化する2つの補完的な方法を説明しました。mt-Keima法では、マイトファジーの増加は酸性(561 nm)/中性(405 nm)細胞の比率の増加として定量化され、MtPhagy法では、マイトファジーフラックスの増加は、フルオジン高MtPhagy高TMRE低細胞集団の増加として定量化されました。これらの方法により?...

開示事項

SASは、小野薬品工業株式会社から助成金を受けており、ノボノルディスクのコンサルタントを務めています。

謝辞

E.L-D.さんNIH(T32-AI007413およびT32-AG000114)からの支援を認める。SASは、JDRF(COE-2019-861)、NIH(R01 DK135268、R01 DK108921、R01 DK135032、R01 DK136547、U01 DK127747)、退役軍人省(I01 BX004444)、Brehmファミリー、Anthonyファミリーからの支援に感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibiotic-AntimycoticLife Technologies15240-062
Attune NxT Flow CytometerThermofisher ScientificA24858
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powderEquitechBAH66
Fetal bovine serumGemini Bio900-108
Fluozin-3AM Thermofisher Scientific F24195100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. 
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
MtPhagy dyeDojindoMT02-105 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
MtPhagy dyeDojindoMT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)Life Technologies15140-1221x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10xFisher ScientificBP399-201x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)Life Technologies11360-0705 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. 
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]AnaspecAS-88061TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermofisher Scientific25300054
ValinomycinSigmaV0627Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.

参考文献

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Mt Keima PH Mt Keima MtPhagy 3 AM Zn2 TMRE

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