Metabolomica arterovenosa per misurare lo scambio di metaboliti in vivo nel tessuto adiposo bruno

Riepilogo

In questo protocollo, vengono descritti i metodi rilevanti per la metabolomica arterovenosa ottimizzata per BAT utilizzando GC-MS in un modello murino. Questi metodi consentono l'acquisizione di preziose informazioni sullo scambio di metaboliti mediati da BAT a livello di organismo.

Abstract

Il tessuto adiposo bruno (BAT) svolge un ruolo cruciale nella regolazione dell'omeostasi metabolica attraverso un processo di dispendio energetico unico noto come termogenesi senza brividi. Per raggiungere questo obiettivo, BAT utilizza un menu diversificato di nutrienti circolanti per supportare la sua elevata domanda metabolica. Inoltre, BAT secerne fattori bioattivi derivati da metaboliti che possono fungere da combustibili metabolici o molecole di segnalazione, facilitando la comunicazione intratissutale e/o intertissutale mediata da BAT. Ciò suggerisce che BAT partecipi attivamente allo scambio sistemico di metaboliti, una caratteristica interessante che sta iniziando ad essere esplorata. Qui, introduciamo un protocollo per la metabolomica arterovenosa BAT ottimizzata a livello di topo in vivo . Il protocollo si concentra su metodi rilevanti per le stimolazioni termogeniche e su una tecnica di prelievo di sangue arterovenoso utilizzando la vena di Sulzer, che drena selettivamente il sangue venoso interscapolare derivato da BAT e il sangue arterioso sistemico. Successivamente, viene dimostrato un protocollo metabolomico basato sulla gascromatografia che utilizza quei campioni di sangue. L'uso di questa tecnica dovrebbe ampliare la comprensione dello scambio di metaboliti regolati dalle BAT a livello interorgano, misurando l'assorbimento netto e il rilascio di metaboliti da parte delle BAT.

Introduzione

Il tessuto adiposo bruno (BAT) possiede una proprietà unica di dispendio energetico nota come termogenesi non tremante (NST), che coinvolge sia i meccanismi dipendenti dalla proteina di disaccoppiamento mitocondriale 1 (UCP1) che quelli indipendenti da UCP1 1,2,3,4,5. Queste caratteristiche distintive implicano BAT nella regolazione del metabolismo sistemico e nella patogenesi delle malattie metaboliche, tra cui l'obesità, il diabete di tipo 2, le malattie cardiovascolari e la cachessia tumorale ^6,7,8. Recenti studi retrospettivi hanno mostrato un'associazione inversa tra la massa di BAT e/o la sua attività metabolica con l'obesità, l'iperglicemia e la salute cardiometabolica nell'uomo ^9,10,11.

Recentemente, il BAT è stato proposto come un pozzo metabolico responsabile del mantenimento della NST, in quanto richiede notevoli quantità di nutrienti circolanti come combustibile termogenico ^6,7. Inoltre, BAT può generare e rilasciare fattori bioattivi, denominati adipochine brune o BATokines, che agiscono come segnali endocrini e/o paracrini, indicando il suo coinvolgimento attivo nell'omeostasi metabolica a livello di sistema 12,13,14,15. Pertanto, la comprensione del metabolismo dei nutrienti del BAT dovrebbe migliorare la nostra comprensione del suo significato fisiopatologico negli esseri umani, al di là del suo ruolo convenzionale come organo termoregolatore.

Gli studi metabolomici che impiegano traccianti isotopici stabili, in combinazione con i classici studi sull'assorbimento dei nutrienti utilizzando radiotraccianti non metabolizzabili, hanno migliorato significativamente la nostra comprensione di quali nutrienti sono assorbiti preferenzialmente da BAT e di come vengono utilizzati 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^,26,27. Ad esempio, studi sui traccianti radioattivi hanno dimostrato che il BAT attivato a freddo assorbe glucosio, acidi grassi legati alle lipoproteine e aminoacidi a catena ramificata 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Recenti tracciamenti isotopici combinati con studi metabolomici ci hanno permesso di misurare il destino metabolico e il flusso di questi nutrienti all'interno dei tessuti e delle cellule in coltura 24,25,26,28,29,30. Tuttavia, queste analisi si concentrano principalmente sull'utilizzo individuale dei nutrienti, lasciandoci con una conoscenza limitata dei ruoli a livello di sistema di BAT nello scambio di metaboliti d'organo. Le domande riguardanti la serie specifica di nutrienti circolanti consumati dalle BAT e i loro contributi quantitativi in termini di carbonio e azoto rimangono elusive. Inoltre, l'esplorazione della possibilità che BAT possa generare e rilasciare BATokine derivate da metaboliti (ad esempio, lipocine) utilizzando sostanze nutritive è solo all'inizio 12,13,14,15,31,32.

L'analisi del sangue arterovenoso è un approccio fisiologico classico utilizzato per valutare l'assorbimento o il rilascio specifico di molecole circolanti in organi/tessuti. Questa tecnica è stata precedentemente applicata al BAT interscapolare dei ratti per misurare l'ossigeno e diversi metaboliti, stabilendo così il BAT come il principale sito di termogenesi adattativa con il suo potenziale catabolico 33,34,35,36,37. Recentemente, uno studio arterovenoso che utilizza BAT interscapolare di ratto è stato accoppiato con un approccio trans-omico, che ha portato all'identificazione di BATokines non ancora scoperte rilasciate da BAT³⁸ stimolate termogenicamente.

I recenti progressi nella metabolomica basata sulla gascromatografia e sulla cromatografia liquida ad alta sensibilità (GC-MS e LC-MS) hanno riacceso l'interesse per gli studi arterovenosi per l'analisi quantitativa dello scambio di metaboliti organo-specifici 39,40,41. Queste tecniche, con il loro elevato potere risolutivo e l'accuratezza della massa, consentono l'analisi completa di un'ampia gamma di metaboliti utilizzando piccole quantità di campione.

In linea con questi progressi, un recente studio ha adattato con successo la metabolomica arterovenosa per lo studio di BAT a livello di topo, consentendo l'analisi quantitativa delle attività di scambio di metaboliti in BAT in diverse condizioni⁴². Questo articolo presenta un protocollo di metabolomica arterovenosa mirata a BAT che utilizza GC-MS in un modello murino C57BL/6J.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Sungkyunkwan (IACUC). I topi sono stati alloggiati in una struttura per animali approvata dalla IACUC situata in una camera bianca impostata a 22 °C e 45% di umidità, seguendo un ciclo giornaliero di luce/buio di 12 ore. Erano tenuti in rastrelliere ventilate e avevano accesso a una dieta standard ad libitum (comprendente il 60% di carboidrati, il 16% di proteine e il 3% di grassi). La lettiera e i materiali per la nidificazione sono stati cambiati su base settimanale. Per questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di età compresa tra 12 settimane e di peso compreso tra 25 g e 30 g. Questi animali provenivano da un fornitore commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Modulazione dell'attività metabolica del tessuto adiposo bruno attraverso l'acclimatazione termica e la stimolazione farmacologica

NOTA: L'acclimatazione della temperatura per diversi giorni o settimane o la stimolazione farmacologica utilizzando agonisti del recettore β-adrenergico sono metodi comunemente impiegati per modulare l'attività del BAT¹. Pertanto, di seguito viene fornita una breve panoramica del metodo per consentire ai lettori di scegliere l'approccio appropriato in base alle esigenze. Per ottenere BAT metabolicamente inattivi (meno termogenici), viene selezionata una temperatura calda di base, denominata termoneutralità (28-30 °C), per i topi C57BL/6J. Questo intervallo garantisce che i topi non abbiano bisogno di spendere energia extra per mantenere una temperatura corporea costante. Per ottenere BAT metabolicamente modestamente o altamente attive (termogeniche), è possibile scegliere rispettivamente temperature fredde miti (20-22 °C) o fredde severe (6 °C). Ai fini di questo esperimento, i topi sono stati allevati in condizioni di stabulazione standard a 22 °C, che, sebbene leggermente freddi per i topi, non hanno comportato alcuna stimolazione farmacologica.

1. Acclimatazione alla temperatura
   1. Separare i topi per ospitare 1 o 2 topi per gabbia almeno 1 settimana prima di iniziare l'acclimatazione della temperatura. Preparare incubatrici per roditori dotate di ventilazione dell'aria, controllo della temperatura e dell'umidità con le condizioni desiderate.
   2. Spostare le gabbie nelle rispettive incubatrici per roditori nei giorni appropriati per il tipo di acclimatazione alla temperatura scelto.
   3. Assicurarsi che la distribuzione del numero di topi sia uniforme in tutti i gruppi, con 1 o 2 topi per gabbia. L'alloggio singolo è preferito in quanto è più sensibile ai cambiamenti fisiologici indotti dalla temperatura rispetto all'alloggio di gruppo⁴³. Ecco le condizioni abitative specifiche per ogni gruppo:
      1. Gruppo di termoneutralità (30 °C): mantenere i topi di questo gruppo continuamente a una temperatura di 30 °C per un massimo di quattro settimane.
      2. Gruppo a freddo intenso: Inizialmente, alloggiare i topi in questo gruppo a 18 °C senza alcun materiale di nidificazione. Sperimenteranno una graduale diminuzione settimanale della temperatura, raggiungendo i 6 °C entro la quarta settimana. La progressione della temperatura è la seguente: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
      3. Gruppo freddo mite (20-22 °C): Alloggiare i topi di questo gruppo in incubatrici per roditori nelle stesse condizioni delle condizioni di stabulazione standard menzionate in precedenza.
      4. Sfide da freddo acuto: per le sfide da freddo acuto, posizionare 1-2 topi per gabbia senza materiali di nidificazione ed esporli a un'incubatrice per roditori impostata a 6 °C per un massimo di 8 ore.
         NOTA: Queste condizioni di stabulazione e variazioni di temperatura sono essenziali per studiare gli effetti di ambienti a temperatura diversa sull'attività e sul metabolismo delle BAT.
   4. Cambia le gabbie e rifornisci cibo e acqua ogni settimana. Preacclimatare le gabbie almeno 24 ore prima dell'integrazione, alla rispettiva temperatura (incubatrice per roditori).
      NOTA: Per evitare il disturbo dello stimolo termico appropriato, è importante non fornire arricchimenti di topi che potrebbero portare alla costruzione del nido. In risposta al freddo intenso, i topi consumano più energia per mantenere la temperatura corporea, con conseguente aumento dell'assunzione di cibo e tassi di escrezione più elevati. Pertanto, è fondamentale controllare le gabbie almeno due o tre volte a settimana (seguendo le linee guida istituzionali locali) per assicurarsi che i topi abbiano un'adeguata scorta di cibo e acqua e che le gabbie non siano eccessivamente bagnate. Questo monitoraggio è essenziale per mantenere il benessere e la salute dei topi durante lo studio.
2. Stimolazione farmacologica¹ con l'agonista del recettore β3-adrenergico CL316,243
   1. Per massimizzare l'effetto stimolante, pre-alloggiare i topi a termoneutralità (30 °C) per 2-4 settimane prima delle iniezioni.
   2. Dopo il periodo di acclimatazione, iniettare per via intraperitoneale 1 mg/kg CL316,243.
      NOTA: Per la stimolazione cronica con l'agonista del recettore β3-adrenergico (ad es. da 3 giorni fino alle settimane ^1,44,45), sono necessarie iniezioni giornaliere a causa della stabilità del farmaco. CL316,243 diluito deve essere preparato il giorno dell'iniezione a causa della stabilità.

2. Prelievo di sangue arterovenoso

NOTA: I topi di età superiore a 12-14 settimane sono meglio raccomandati per il prelievo di sangue arterovenoso. I topi più giovani potrebbero non avere vene di Sulzer di dimensioni sufficienti, un vaso sanguigno distinto che drena specificamente il sangue venoso dal BAT⁴⁶ interscapolare.

1. Anestetizzare delicatamente utilizzando il vaporizzatore calibrato con isoflurano al 3% per induzione (in una camera di dimensioni 205 x 265 x 200 mm) e isoflurano al 2% per il mantenimento (con una maschera per anestesia gassosa).
   NOTA: L'intera procedura di prelievo di sangue arterovenoso deve essere eseguita tempestivamente dopo l'anestesia. Un cuscinetto riscaldante riscaldato ad acqua può essere utilizzato durante l'anestesia per mantenere la temperatura corporea interna.
   ATTENZIONE: L'isoflurano è altamente volatile e tossico se inalato. Pertanto, l'anestesia primaria deve essere eseguita sotto una cappa aspirante.
2. Verificare i riflessi dell'animale, come la retrazione delle zampe, per confermare che l'anestesia abbia raggiunto una profondità adeguata.
3. Raccolta di sangue venoso dalla vena del Sulzer
   1. Posizionare il mouse in modo da esporre la pelle dorsale, confermare la profondità dell'anestesia con un pizzicotto del dito del piede prima di eseguire l'incisione. Inumidire la pelle dorsale con abbondante etanolo al 70% per evitare il distacco dei peli e praticare un'incisione lungo la schiena dalla parte inferiore del torace fino al collo.
      NOTA: Il BAT interscapolare si trova proprio sotto la pelle, costituito da due cuscinetti adiposi ricoperti da sottili tessuti adiposi bianchi. È importante assicurarsi che il topo rimanga sotto anestesia attraverso la maschera per anestesia gassosa.
   2. Sollevare delicatamente il BAT interscapolare con una pinza a punta piegata e tagliare con cura i tessuti attaccati, la maggior parte dei quali sono muscoli. Sollevare il cuscinetto adiposo verso la testa, continuare a tagliare i tessuti attaccati e aprire con cautela la regione fino a quando la vena di Sulzer (un grande vaso rosso scuro a forma di "Y" collegato a entrambi i cuscinetti adiposi della BAT interscapolare) è esposta.
      NOTA: Fare attenzione a non tagliare i vasi capillari dei tessuti muscolari che sono collegati con la regione anteriore e laterale del BAT interscapolare, poiché ciò ridurrà significativamente la quantità e la qualità del sangue che drena dalla vena di Sulzer.
   3. Tagliare con cura la vena di Sulzer e raccogliere circa 40 μL di sangue utilizzando puntali per pipette da 200 μL tagliati dal basso e una pipetta P100. Conservare il sangue in una provetta per la raccolta del sangue e tenere la provetta su ghiaccio fino al processo di raccolta del siero.
      NOTA: È importante raccogliere il sangue appena sotto il punto di divisione a forma di Y della vena di Sulzer, per evitare la contaminazione del sangue dalla vena cava superiore⁴⁷. Raccogliere troppo sangue diminuirà le caratteristiche della vena di Sulzer. Pertanto, assicurati di raccogliere la quantità minima di sangue necessaria dalla vena di Sulzer per l'analisi. Prestare attenzione quando si selezionano le provette per la raccolta del sangue, poiché il siero e il plasma producono diversi profili di metaboliti 48,49,50. Per la raccolta del plasma, è necessario utilizzare provette rivestite di eparina. In questo esperimento, sono stati scelti tubi rivestiti di attivatori della coagulazione per ottenere il siero. In nessun caso devono essere utilizzate provette rivestite di EDTA, poiché l'EDTA ha un impatto significativo sui segnali di spettrometria di massa^51,52.
4. Prelievo di sangue arterioso dal ventricolo sinistro
   1. Capovolgere il mouse senza perdere il contatto con l'ogiva nasale, per esporre la pelle ventrale. Confermare la profondità dell'anestesia pizzicando un dito del piede prima di eseguire l'incisione. Inumidire la pelle ventrale con un'ampia quantità di etanolo al 70% per prevenire il distacco dei capelli e aprire con cautela la cavità toracica con le forbici per esporre il cuore senza danneggiare alcuna struttura interna.
   2. Perforare accuratamente l'area apicale del ventricolo sinistro utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 29 G (1/2"). Inserire due terzi di un ago da 1/2'' a 3-5 mm all'orizzontale destra dell'apice del cuore (Figura 1B) e tirare indietro la siringa per raccogliere il sangue dal ventricolo sinistro (50-100 μL). Il sangue proveniente dal ventricolo sinistro è sangue arterioso ossigenato di colore rosso vivo. Conservare il sangue in una provetta per la raccolta del sangue e tenere la provetta su ghiaccio fino al processo di raccolta del siero.
      NOTA: È necessario praticare un'incisione minima nella cavità toracica per l'accesso al cuore. Un'incisione eccessiva potrebbe portare a sanguinamento locale, che può successivamente provocare un abbassamento della pressione sanguigna. Ciò potrebbe influire sulla qualità del sangue arterioso raccolto dal ventricolo sinistro. Evita di ruotare o capovolgere il cuore, poiché renderà difficile determinare la posizione precisa del ventricolo sinistro.
   3. Eseguire l'eutanasia e assicurarla con un metodo appropriato seguendo le linee guida delle istituzioni locali. Ad esempio, l'eutanasia può essere eseguita attraverso la lussazione cervicale e confermata dalla cessazione del battito cardiaco.
5. Centrifugare i campioni di sangue a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Raccogliere con cura il surnatante utilizzando una pipetta. Il surnatante deve contenere siero o plasma a seconda del tipo di provetta per la raccolta del sangue utilizzata. Ci si può fermare qui e conservare i campioni a -20 °C fino all'elaborazione del siero per l'analisi GC-MS.
   NOTA: L'emolisi può potenzialmente essersi verificata se si osserva un surnatante di colore rosso. Per evitare l'emolisi, ruotare il campione prima che la coagulazione sia completata. Alcuni metaboliti arricchiti di globuli rossi, tra cui la glutammina e il lattato, potrebbero portare a un'interpretazione errata dei dati, sebbene la maggior parte dei metaboliti non sia significativamente influenzata dall'emolisi. Si raccomanda di analizzare il siero/plasma entro una settimana.

3. Estrazione di metaboliti dal siero e derivatizzazione chimica

1. Preparazione per l'estrazione
   NOTA: Tutti i metodi, tra cui l'estrazione dei metaboliti, la derivatizzazione e l'analisi dei dati, sono versioni leggermente modificate dei metodi descritti in precedenza^53,54.
   1. Preparare il tampone di estrazione aggiungendo una soluzione di 100 μM di DL-norvalina, standard interno (vedere la tabella dei materiali), al metanolo di grado MS.
   2. Assicurarsi che tutte le procedure sperimentali siano condotte su ghiaccio.
2. Trasferire 10 μL di siero di topo estratto dalla vena di Sulzer o dal ventricolo sinistro in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL contenente 40 μL di tampone di estrazione.
3. Per rimuovere i detriti cellulari e le proteine, far vorticare brevemente i campioni di siero, quindi centrifugare alla massima velocità (18.000 x g) per 30 minuti a 4 °C.
4. Dopo la centrifugazione, trasferire con cautela 40 μL di surnatante in un flaconcino di vetro, seguiti da 3 ore di essiccazione in una centrifuga sottovuoto a 4 °C.
   NOTA: Si consiglia un inserto in vetro (vedere la tabella dei materiali) al posto dei tubi di plastica a causa delle sostanze chimiche reattive alla plastica utilizzate durante la successiva fase di derivatizzazione.
5. Sottoporre i campioni essiccati a due fasi di derivatizzazione consecutive per l'analisi GC-MS dei metaboliti sierici.
   NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti sotto una cappa aspirante a causa dei rischi di irritazione dei solventi.
   1. Risospendere gli estratti di siero essiccato in 30 μL di 10 mg/mL di metossiamina cloridrato (vedere Tabella dei materiali) disciolti in piridina e incubare a 37 °C per 30 min.
   2. Derivatizzare i campioni per la sililazione dei metaboliti con 70 μL di N-metil-N-terz-butildimetilsilrifluoroacetammide (MTBSTFA, vedere la tabella dei materiali) a 70 °C per 1 ora.
      NOTA: Si consiglia l'uso di una siringa di vetro piuttosto che di una punta di plastica nei passaggi seguenti a causa dei solventi di derivatizzazione che reagiscono con la plastica.

4. Analisi metabolomica mediante GC-MS

NOTA: La GC-MS quadrupla singola (vedi Tabella dei materiali) è stata impiegata per misurare i vari metaboliti sierici tra cui carboidrati, amminoacidi e intermedi del ciclo TCA in campioni derivatizzati dalla vena di Sulzer e dal ventricolo sinistro. In alternativa, è possibile utilizzare altre colonne, anche se le impostazioni sperimentali, incluso il programma di temperatura, possono variare a seconda dei tipi di colonne utilizzate.

1. Iniettare 1 μL del campione derivatizzato nel GC in modalità splitless a 280 °C (temperatura di ingresso), utilizzando l'elio come gas di trasporto con una portata di 1.500 mL/min (set point).
2. Impostare il quadrupolo a 200 °C con interfaccia GC-MS a 300 °C.
   NOTA: Il programma del forno per tutte le analisi dei metaboliti inizia a 60 °C, viene mantenuto per 1 min, quindi viene aumentato a una velocità di 10 °C/min fino a quando la temperatura raggiunge i 320 °C.
3. Raccogliere i dati mediante ionizzazione elettronica (EI) impostata a 70 eV e acquisire i dati del campione in modalità di scansione (50-550 m/z)⁵³. Tutti i metaboliti utilizzati in questo studio sono stati precedentemente convalidati con standard per confermare gli spettri di massa e i tempi di ritenzione.
4. Eseguire l'integrazione dell'area di picco utilizzando un software di analisi disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).
5. Abbinare i composti con lo ione prodotto di ciascun derivato TBMDS. Quindi, ottenere il cromatogramma ionico di estrazione (EIC) integrando il valore m/z dello ione frammento nell'area del picco corrispondente, quindi esportarlo. Gli ioni frammento sono mostrati nella Tabella 1.
   NOTA: L'EIC di ciascun composto è stato normalizzato da quello della DL-norvalina in ciascun campione. I dati sono rappresentati dalla vena di Sulzer al ventricolo sinistro (Log₂(SV/LV)) utilizzando ciascun valore EIC normalizzato.

Risultati

La Figura 1 illustra lo schema sperimentale della metabolomica AV ottimizzata per BAT. Come accennato nella sezione Protocollo, per ottenere tessuti adiposi bruni stimolati in modo differenziale, i topi vengono sottoposti ad acclimatazione termica utilizzando incubatrici per roditori o ricevono somministrazione farmacologica come agonisti del recettore β-adrenergico. Successivamente, i topi vengono anestetizzati e vengono raccolti campioni di sangue per l'analisi metabolomica (

Discussione

Un passo fondamentale per comprendere il potenziale metabolico del BAT nell'equilibrio energetico di tutto il corpo è definire quali nutrienti consuma, come vengono metabolicamente elaborati e quali metaboliti vengono rilasciati nella circolazione. Questo protocollo introduce una tecnica specializzata di campionamento arterovenoso che consente l'accesso alla vascolarizzazione venosa del BAT interscapolare e alla vascolarizzazione arteriosa sistemica nei topi C57BL/6J, che è stata recentemente sviluppata e convalidata d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-20 µL Filter Tips	Axygen	AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"	BD Biosciences	309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)	Agilent	G7077B
Agilent 7693A Autosampler	Agilent	G4513A
Agilent 8890 GC System	Agilent	G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI	Agilent	19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)	Agilent	G3335-90240
C57BL/6J mouse	DBL	C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)	LABCONCO	7811041
DL-Norvaline	Sigma-Aldrich	N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Glass insert 250 μL	Agilent	5181-1270
Methanol (LC-MS grade)	Sigma-Aldrich	Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base	Sarstedt	20.1290.100
MTBSTFA	Sigma-Aldrich	394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)	Sigma-Aldrich	270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators	LABCONCO	7310041
Rodent diet	SAFE	SAFE R+40-10
Rodent incubator	Power scientific	RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"	BD Biosciences	328203
Vial Cap 9 mm	Agilent	5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL	Agilent	5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40	Axygen	PCR-02-C