末梢レンズの構造、細胞形態、組織を可視化・定量化するためのホールマウントイメージング

現在のプロトコルはイメージの定量化のための方法の眼球レンズの末梢構造の視覚化のための新しい全台紙のイメージ投射を記述する。これらのプロトコルは、レンズのマイクロスケール構造とレンズの発達/機能との関係をよりよく理解するための研究に使用できます。

眼球レンズは透明で柔軟な組織で、その形状を変化させてさまざまな距離からの光を網膜に集束させます。水晶体は、被膜と呼ばれる器官を取り囲む基底膜を除けば、前半球の上皮細胞の単層と水晶体線維細胞の塊からなる完全な細胞である。上皮細胞は生涯を通じて水晶体赤道の発芽帯で増殖し、赤道上皮細胞は遊走、伸長、分化して新たに形成された線維細胞になります。赤道上皮細胞は、ランダムに詰め込まれた丸石型の細胞から、子午線列を形成する整列した六角形の細胞に形態を実質的に変化させます。新たに形成されたレンズ線維細胞は、六角形の細胞形状を保持し、前極および後極に向かって伸び、前世代の線維に重ねられた細胞の新しいシェルを形成します。水晶体上皮細胞から線維細胞への顕著な形態形成を促進するメカニズムについてはほとんど知られていません。レンズの構造、発達、機能をよりよく理解するために、接眼レンズのマウント全体を使用して末梢構造を画像化する新しいイメージングプロトコルが開発されました。ここでは、カプセルの厚さ、上皮細胞面積、細胞核面積と形状、子午線列細胞の順序と充填、および繊維細胞幅を定量する方法を示します。これらの測定は、生涯にわたる水晶体の成長中に発生する細胞の変化を解明し、加齢や病態によって発生する変化を理解するために不可欠です。

眼水晶体は、眼の前部に位置する柔軟で透明な組織で、網膜に光を細かく合わせる役割を果たします。レンズが機能する能力は、部分的には、その複雑なアーキテクチャと構成に起因する可能性があります1,2,3,4,5,6。水晶体組織を取り囲むのは、水晶体構造と生体力学的特性を維持するために不可欠な基底膜であるカプセルです^7,8,9。水晶体自体は完全に細胞状で、上皮細胞と繊維細胞の2種類の細胞で構成されています。上皮層は、レンズ¹⁰の前半球を覆う直方体細胞の単層からなる。生涯を通じて、上皮細胞は増殖し、水晶体嚢に沿って水晶体赤道に向かって移動します。前上皮細胞は断面が静止し、丸石であり、水晶体赤道付近では上皮細胞が増殖し、新しい線維細胞への分化過程を経始める^11,12....

マウスはデラウェア大学の動物施設に収容され、病原体のない環境で維持されています。CO2吸入による安楽死を含むすべての動物処置は、デラウェア大学動物実験委員会(IACUC)によって承認された動物プロトコルに従って実施されました。

1.レンズマウント全体の準備とイメージング

1. ホールマウントイメージング用レンズの固定
   1. 安楽死後.......

前水晶体嚢、上皮細胞領域、および核領域
水晶体カプセルの厚さを分析するために、ライブレンズまたは固定レンズのいずれかで水晶体カプセルをWGAで染色しました。水晶体上皮細胞は、ライブレンズでtdTomatoで膜を標識するか(図2A)、または固定レンズの細胞膜でF-アクチンをローダミン-ファロイジン染色(図2B)することで同定しま.......

記載されているプロトコルは、水晶体の前方および赤道領域における周辺レンズ構造および細胞の高空間分解能の視覚化を可能にします。本研究では、3次元レンズ全体の構造が保たれたインタクトレンズ(ライブレンズまたは固定レンズ)を用いて、レンズ周辺構造を可視化する手法を示した。さらに、一般に公開されているFIJI ImageJソフトウェアを使用した形態測定定量分析の簡単な方法も?.......

この研究は、CCにEY032056された国立眼科研究所の助成金R01とVMFにEY017724されたR01、および助成金番号P20GM139760の国立総合医学研究所の支援を受けました。S.T.Iは、化学-生物学インターフェース博士課程前研修プログラムの一環として、NIH-NIGMS T32-GM133395、およびデラウェア大学大学院奨学生賞の支援を受けました。