Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол, описывающий сетевую фармакологию и методы молекулярного докинга для изучения механизма действия Jiawei Shengjiang San (JWSJS) при лечении диабетической нефропатии.

Аннотация

Мы стремились углубиться в механизмы, лежащие в основе действия Jiawei Shengjiang San (JWSJS) в лечении диабетической нефропатии и развертывании сетевой фармакологии. Используя методы сетевой фармакологии и молекулярного докинга, мы предсказали активные компоненты и мишени JWSJS и построили тщательную сеть «лекарство-компонент-мишень». Анализ онтологии генов (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) был использован для определения терапевтических путей и мишеней JWSJS. Autodock Vina 1.2.0 был развернут для проверки молекулярного докинга, и было проведено моделирование молекулярной динамики за 100 нс для подтверждения результатов докинга, за которым последовала проверка in vivo на животных. Результаты показали, что JWSJS имеет 227 пересекающихся мишеней с диабетической нефропатией, создавая топологию сети белок-белковых взаимодействий. Анализ обогащения KEGG показал, что JWSJS смягчает диабетическую нефропатию за счет модуляции липидов и атеросклероза, сигнального пути PI3K-Akt, апоптоза и сигнального пути HIF-1, с митоген-активируемой протеинкиназой 1 (MAPK1), MAPK3, рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и серин/треонин-протеинкиназа 1 (AKT1), идентифицированными как коллективные мишени нескольких путей. Молекулярный докинг показал, что основные компоненты JWSJS (кверцетин, пальмитолеиновая кислота и лютеолин) могут стабилизировать конформацию с тремя основными мишенями (MAPK1, MAPK3 и EGFR) посредством водородных связей. Обследования in vivo показали заметное увеличение массы тела и снижение уровня гликированного сывороточного белка (GSP), холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C), уридинтрифосфата (UTP) и уровня глюкозы в крови натощак (FBG) из-за JWSJS. Электронная микроскопия в сочетании с гематоксилином и эозином (HE) и периодическим окрашиванием кислотой-Шиффа (PAS) выявила потенциал каждой группы лечения в облегчении повреждения почек в различной степени, демонстрируя различное снижение p-EGFR, p-MAPK3/1 и BAX, а также увеличение экспрессии BCL-2 в тканях почек крыс, получавших лечение. В конечном счете, эти выводы позволяют предположить, что защитная эффективность JWSJS при диабетической нефропатии может быть связана с подавлением активации сигнального пути EGFR/MAPK3/1 и облегчением апоптоза почечных клеток.

Введение

Сахарный диабет (СД) — это хроническое заболевание, которое поражает несколько систем и может вызывать различные осложнения из-за непрерывной гипергликемии, такие как диабетическая нефропатия (ДН), ретинопатия и нейропатия1. ДН является серьезным осложнением СД, на долю которого приходится около 30-50% случаев терминальной стадии почечной недостаточности (ТХПН)2. Его клиническим проявлением является микроальбуминурия, которая может прогрессировать до ТХПН, характеризующейся увеличением объема клубочков, мезангиальной стромальной гиперплазией и утолщением базальной мембраны клубочков3. Патогенез ДН сложен и до конца не выяснен. Клинические методы, такие как снижение уровня глюкозы в крови, регулирование артериального давления и уменьшение протеинурии, в основном используются для задержки ее прогрессирования, но эффект является общим.

В настоящее время не найдено специфического препарата для лечения DN4. Однако на протяжении веков китайские растительные препараты широко использовались для лечения СД и его осложнений5, что улучшало клинические симптомы у пациентов и замедляло прогрессирование заболевания. Благодаря преимуществам многокомпонентного, многоцелевого и многопутного эффектов, китайские растительные препараты, как ожидается, станут инновационным источником лекарств для лечения DN6.

«Шэнцзян сань» произошел от «Ваньбин Хуэйчунь» врача династии Мин Гун Тинсяня. В книге «Neifu Xianfang» описывается использование Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma и Radix Rhei et Rhizome. Исходя из этого, после добавления Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba и Smilacis Glabrae Rhixoma, он выполняет функцию shengjiang san для повышения ясности, уменьшения мутности, выделения застойного «тепла» и гармонизации «ци» и крови 7,8. Он также усиливает эффект укрепления селезенки и тонизирования почек. Его эффективность согласуется с патогенезом «ци» ДН к подъему и выпадению из строя из-за дефицита «жизненной энергии», чрезмерной сухости и «жара», а также застоя «тепла», вызванного тройным энерджайзером 7,8.

Предыдущие клинические исследования показали, что китайские растительные препараты используются для лечения СД и его осложнений, а цзявэй шэнцзян сань (JWSJS) регулирует уровень глюкозы и липидов в крови, снижает протеинурию и значительно улучшает клиническую эффективность пациентов с ранней ДН7. Способность JWSJS снижать уровень белка в моче и глюкозы в крови у DN-крыс была подтверждена предыдущими исследованиями. Вероятно, это происходит за счет ингибирования сигнальных путей TXNIP/NLRP3 и RIP1/RIP3/MLKL, уменьшения пироптоза подоцитов и предотвращения некротического апоптоза в почечных тканях DN-крыс, тем самым достигаяпочечной защиты9. JWSJS может повышать экспрессию белков нефрина и подоцина и уменьшать повреждение подоцитов у DN-крыс, что позволяет предположить, что JWSJS оказывает ингибирующее действие на повреждение подоцитов. JWSJS обладает определенным анти-DN-эффектом с хорошими профилями безопасности, но исследований по нему мало, и эта работа в основном сосредоточена на пироптозе и некротическом апоптозе. Литература не является достаточно глубокой или систематической10. Наши предыдущие результаты подтвердили, что JWSJS может уменьшить протеинурию и облегчить повреждение почек у DN крыс7. Тем не менее, существует всего несколько исследований о механизме JWSJS для лечения ДНК, и им не хватает глубины и систематизации. Таким образом, данное исследование направлено на анализ молекулярных веществ и механизмов действия JWSJS для лечения ДНК с использованием сетевой фармакологии и обеспечение прочной основы для будущих исследований.

Сетевая фармакология является новым методом изучения механизма действия лекарств, включая химиформатику, сетевую биологию, биоинформатику и фармакологию11,12. Дизайн исследований в области сетевой фармакологии очень похож на холистическую концепцию традиционной китайской медицины13,14 и является важным методом изучения механизма действия китайских растительных лекарственных средств. Молекулярный докинг может изучать взаимодействия между молекулами и предсказывать их характер связывания и аффинность. Молекулярный докинг стал важнейшим методом в области компьютерных исследований лекарств15. Таким образом, в этом исследовании была построена сеть взаимодействия JWSJS-DN-мишень с помощью сетевой фармакологии и методов молекулярного докинга, которая предлагает надежную и теоретическую основу для дальнейшего изучения лечения ДНК с помощью JWSJS.

протокол

Все животные содержались и использовались в соответствии с Руководством Национального исследовательского совета США по уходу и использованию лабораторных животных,8-е издание, и были представлены в соответствии с рекомендациями ARRIVE. Исследование проводилось в соответствии с Руководством Китайского национального исследовательского совета по уходу за лабораторными животными и их использованию и было одобрено Комитетом по этике животных Хэбэйского университета китайской медицины (DWLL2019030).

1. Активные ингредиенты JWSJS и целевая коллекция

  1. Введите лекарственный состав JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome и Curcumaelongae Rhizoma) в базу данных18 фармакологической базы данных и аналитической платформы традиционной китайской медицины (TCMSP) для извлечения всех химических компонентов.  По данным абсорбции, распределения, метаболизма и выведения (ADME) скрининговая пероральная биодоступность (OB) ≥ 30% и лекарственные свойства (DL) ≥ 0,18 химических ингредиентов19,20.
  2. Используйте базу данных TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, версия 2.3) для получения соответствующих мишеней химических ингредиентов.
  3. Получите активные ингредиенты Bombyx Batryticatus и Cicadae Periostracum с помощью поиска в базах данных традиционной китайской медицины и химического состава21.
  4. Для обеспечения достоверности эксперимента выберите соединения с номерами службы химических рефератов (CAS) для этого исследования. Затем загрузите 2D-структурные схемы (формат .sdf) активных ингредиентов от PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, обновлено в 2021 году)22.
  5. Используйте SwissADME (www.swissadme.ch, обновлено в 2021 г.)23для скрининга компонентов с высокой абсорбцией в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) в качестве сходства с препаратами (Липински, Гхош, Вебер, Эган, Мюгге), ≥ 2 пунктов которых были «Да». Это привело к появлению активных компонентов Bombyx Batryticatus и Cicadae Periostracum.
  6. Импортируйте их в базу данных TCMSP для прогнозирования целевых белков (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, версия 2.3)18.
  7. Стандартизировать целевые показатели в базе данных UniProt (https://www.uniprot.org, обновлено в 2021 году) со статусом «Рассмотрено» и видом «Человек» 24.

2. DN соответствующая целевая коллекция

  1. Поиск по диабетической нефропатии через базы данных GeneCards (https://www.genecards.org/, версия 5.1)25, OMIM (https://omim.org/, обновлено в 2021 году)26, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, обновлено в 2021 году)27, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, обновлено в 2021 году)28 и базы данных DrugBank (https://www.drugbank.ca/, обновлено в 2021 году)29. Получение мишеней DN после объединения и дедупликации.
  2. Скрининг общих целей JWSJS и DN и построение сети
    1. Отсейте общие мишени JWSJS и DN с помощью программного обеспечения R 4.2.0 и нарисуйте диаграммы Венна. Импортируйте активные ингредиенты и потенциальные мишени JWSJS в программное обеспечение Cytoscape 3.8.030 для создания сетевой диаграммы «лекарство-ингредиент-мишень », которая визуализирует связь между лекарствами, ингредиентами, мишенями и болезнями.
    2. Пусть размер узла отражает размер значения градуса, где более высокое значение градуса указывает на то, что узел является более важным в сети.
  3. Построение сети белок-белковых взаимодействий ИПП и скрининг основных мишеней
    1. Проанализируйте пересекающиеся гены с помощью онлайн-платформы STRING (Версия:11.5) для построения сети белок-белковых взаимодействий (ИПП)31. Постройте сеть с помощью режима анализа множественных белков , установите вид на Homo sapiens и установите минимально необходимую оценку взаимодействия на >0,930.
    2. Используйте Cytoscape 3.8.0 для топологического анализа сети, вычисления значений центральности между центральностью (BC), центральности близости (CC), центральности степени (DC), центральности собственного вектора (EC), метода на основе локальной средней связности (LAC) и центральности сети (NC) для каждого узла, а также отсейте шесть узлов со значениями, превышающими медиану32. Повторите этот процесс несколько раз, чтобы определить основные мишени JWSJS для ДНК-терапии.
  4. Функциональный анализ GO и анализ обогащения путей KEGG
    1. Выполнение анализов обогащения GO и KEGG для идентификации биологических процессов, молекулярных функций, клеточных компонентов и путей, связанных с общими мишенями JWSJS и DN.
    2. Используйте org. Hs.eg.db пакет для получения идентификаторов целей пересечения и используйте clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot и ggplot2 для анализа обогащения33.
    3. Скрининг для анализа функционального обогащения ГО по топ-10 биологических хитов с скорректированным P-значением < 0,05 и выбор топ-30 путей с наибольшим обогащением для анализа KEGG.

3. Молекулярный докинг

  1. Используйте программное обеспечение AutoDock Vina для выполнения молекулярного докинга между основными компонентами JWSJS и основными мишенями для ДНК-терапии34.
  2. Выполните поиск в базе данных PubChem для получения файла sdf с 2D-структурой основных компонентов JWSJS. Используйте программное обеспечение ChemBio 3D Ultra14.0 для создания и оптимизации его 3D-структуры, сохранения его в формате mol2 и использования в качестве лигандного файла.
  3. Найдите и загрузите 3D-структуру основных мишеней в формате pdb из базы данных Банка данных белков (PDB) Исследовательской совместной лаборатории структурной биоинформатики (RCSB). Используйте программное обеспечение Pymol 2.4.0 для удаления молекул воды и лигандов из структуры белка, сохранения его в формате pdb и использования в качестве рецепторного файла.
  4. Импортируйте файл рецептора pdb в программу для гидрирования AutoDockTools 1.5.7, преобразуйте рецепторный белок и низкомолекулярный лиганд в формат pdbqt, установите активный карман для рецепторного белка с коэффициентом Spacing равным 1.
  5. Используйте Autodock vina 1.2.0 для молекулярного докинга и рассчитайте энергию связывания; если Affinity < 0, считайте, что молекула спонтанно связывается с белком, большее абсолютное значение Affinity указывает на более стабильное связывание между ними. Наконец, визуализируйте результаты стыковки с помощью программного обеспечения Pymol 2.3.0 и LigPlot 2.2.5.

4. Молекулярно-динамическое моделирование

  1. Чтобы выполнить моделирование МД с помощью программного обеспечения Desmond, выполните следующие действия:
    1. Используйте академическую версию программного обеспечения Desmond 2019-1 для оценки стабильности и гибкости белок-лигандных взаимодействий.
    2. Проведение молекулярно-динамических исследований (МД) на трех наиболее перспективных лигандных комплексах, полученных в результате исследований докинга. Проводите моделирование в водной среде SPC с 0,15 М NaCl, воспроизводя физиологические ионные условия. Бокс для моделирования спроектирован таким образом, чтобы растворенное вещество оставалось на расстоянии не менее 10 Å от своих границ. Для нейтрализации электрического заряда системы вводятся противоионы. Кроме того, применяются периодические граничные условия, управляемые параметрами силового поля OPLS 2005.
    3. Инициируйте фазу минимизации энергопотребления на 100 пс с использованием стандартных параметров Desmond.
    4. Обеспечьте стабилизацию температуры и давления на уровне 26,85 °C (300 K) и 1,01325 бар с помощью цепи Носе-Гувера и методологий Мартины-Тобиаса-Кляйна во всех производственных системах MD. Моделирование молекулярной динамики выполняется с временным шагом 2 фс общей продолжительностью 100 нс, с записью атомных координат каждые 100 пс.
    5. Откройте модуль Диаграмма взаимодействий моделирования (SID). Загрузите файлы с данными результатов моделирования в модуль.
    6. Выберите нужный тип анализа из доступных в модуле опций (например, среднеквадратичное отклонение [RMSD], среднеквадратичное колебание [RMSF], анализ водородных связей и т. д.). Укажите любые дополнительные параметры, необходимые для выбранного типа анализа.
    7. Запустите анализ, нажав на кнопку «Анализ» или «Начать».
    8. После завершения анализа просмотрите и интерпретируйте результаты в интерфейсе модуля SID. При необходимости экспортируйте результаты для дальнейшего использования или презентации.

5. Валидация экспериментов на животных

  1. Животные и дизайн эксперимента
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании приняли участие 75 самцов крыс породы Спрэг-Доули, которые были получены на животноводческом предприятии класса SPF в возрасте 8 недель с массой тела 150 г ± 20 г (номер сертификата животноводства SCXK [Hebei] 2018-004).
    1. Поместите крыс в лабораторию для животных с SPF и случайным образом разделите их на нормальную и модельную группы после 1 недели адаптивного кормления. Обеспечьте нормальную группу нормальным питанием, а модельной группе — диету с высоким содержанием сахара и жиров. Через 4 недели постите крыс, но не лишайте их воды в течение 12 часов.
    2. В модельную группу вводят внутрибрюшинную инъекцию стрептозотоцина (СТЗ; 35 мг·кг-1). Через 72 ч проверьте уровень сахара в крови с помощью забора крови из хвостовой вены. Если уровень глюкозы в крови натощак составляет ≥16,7 ммоль· L-1, подтвердите его как успешную диабетическую модель.
    3. Подтвердите успешность ДНК-модели, наблюдая за гистопатологическими изменениями в почках крысы.
    4. Случайным образом разделите успешно реплицированные модели на модельную группу, которая получала JWSJS в дозах 4,37 г/кг, 8,73 г/кг и 17,46 г/кг (что эквивалентно 3,2, 6,3 и 12,6 клинически эквивалентной дозе), а также на группу ирбесартана (0,014 г/кг). Каждая группа состояла из 10 крыс. Вводите все препараты через пероральный зонд один раз в день. Поддерживайте этот режим дозирования постоянно в течение 4 недель.
    5. Обезболивайте крыс с помощью внутрибрюшинной инъекции 1% пентобарбитала натрия (50 мг/кг) и подтвердите надлежащую анестезию потерей рефлекса отмены педали. Соберите образцы крови из брюшной аорты перед эвтаназией.
    6. Соберите почки после усыпления крыс с помощью внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия в дозе 150 мг/кг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животные были гуманно усыплены в соответствии с самыми последними рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) по эвтаназии.
  2. Анализы на гистологию почек
    Примечание: Ткани почек фиксировались в 4% параформальдегиде и обезвоживались в этаноле через 48 ч; Срезы были погружены в парафин. Срезы разрезали на тонкие (4 мкм) срезы для окрашивания гематоксилином и эозином (ПЭ) и периодическим кислотным Шиффом (PAS), а морфологические изменения гистологии почек наблюдали под световым микроскопом.
    1. Окрашивание HE:
      1. Депарафинизация и гидратация: Обработайте участки тканей ксилолом I и II (по 10 минут), абсолютным спиртом I и II (по 3 минуты). Затем погрузите срезы ткани в 95%, 90%, 80% и 70% этанол (по 2 минуты каждый), а затем промойте дистиллированной водой на 5 минут.
      2. Поместите срезы тканей в краситель гематоксилином на 5 минут, а затем дифференцируйте срезы соляным спиртом в течение 5 секунд.
      3. Поместите секцию в раствор для окрашивания эозина на 3 минуты.
      4. Обезвоживание, очистка и монтаж: Обезвоживайте участки в разное время в различных этанолах (70%, 80%, 90%, 95% и абсолютных этанолах), затем очищайте их в ксилоле I и II, а затем монтируйте с нейтральной камедью.
    2. Окрашивание PAS:
      1. Следуйте шагам депарафинизации, описанным в шаге 5.2.1, и обрабатывайте участок периодическим раствором кислотного окрашивания в течение ~8 минут.
      2. Промойте срезы в дистиллированной воде в течение 2 минут, а затем окрасьте их реагентом Schiff в течение 15 минут в темноте.
      3. Срезы промыть в водопроводной воде в течение 10 минут после обработки реагентом Schiff.
      4. Срезы окрашивают гематоксилином в течение 1 мин, а затем дифференцируют их с помощью HCl-спирта в течение 30 с. Снова промойте срезы в водопроводной воде в течение 5 минут, чтобы ядро окрасилось в синий цвет.
    3. Электронная микроскопия:
      1. Зафиксируйте образцы в 2,5% глутаральдегиде на 3 ч, затем промойте их в PBS в течение 3 ч. Далее обрабатывают образцы в 1% осмиевой кислоте в течение 3 ч, а затем снова промывают в PBS в течение 3 ч.
      2. Обезвоживайте с помощью постепенной серии спиртовых ванн, заканчивающихся ацетоном (каждый этап длится в общей сложности около 2 часов).
      3. Инфильтрируйте образцы смесью эпоксидного пропана и эпоксидной смолы (1:1) при комнатной температуре (RT) в течение 2 часов, а затем чистой эпоксидной смолой при 37 °C в течение еще 2 часов.
      4. После этого образцы отверждаются и затвердевают при все более высоких температурах в течение 36 часов перед срезом. Этот процесс гарантирует, что ткань полностью инфильтрируется смолой, которая затем затвердевает, чтобы обеспечить тонкую нарезку для электронной микроскопии.
      5. Дважды окрашивайте 3% уранилацетата и свинцовой кислотой, а затем осмотрите и сфотографируйте образцы с помощью электронной микроскопии в течение 15 минут.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) следующие: увеличение 7000x в высококонтрастном режиме (Zoom-1 HC-1) с ускоряющим напряжением 80,0 кВ на системе ПЭМ.
  3. Иммуногистохимия
    1. Депарафинизация: поместите срезы ткани в ксилол I и II на 10 минут каждый.
    2. Регидратация: Регидратируйте депарафинизированные участки тканей, последовательно помещая их в абсолютный этанол I и II на 3 минуты каждый, а затем 95%, 90%, 80% и 70% этанол на 2 минуты каждый.
    3. Извлечение антигена: Погрузите участки ткани в буферный раствор цитратно-лимонной кислоты 0,1 М под высоким давлением примерно на 5 минут, а затем охладите до состояния ОТ.
    4. Блокирование: Для предотвращения неспецифического связывания антител следует провести блокирование путем инкубации участков ткани с 5% нормальной сывороткой козы при температуре около 37 °C в течение 30 минут.
    5. Инкубация первичных антител: добавьте первичные антитела p-EGFR (разбавленные 1:200) и p-MAPK3/1 (разведенные 1:200) на срезы тканей и инкубируйте в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
    6. Инкубация вторичных антител: Трижды промойте срезы PBS, затем добавьте меченные биотином вторичные антитела (разведенные в PBS в соответствии с инструкциями производителя) на срезы и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
    7. Нанесите на участки ткани рабочий раствор стрептавидина, конъюгированный с пероксидазой хрена, при температуре 37 °С с последующим трижды промыванием фосфатно-солевым буфером (ПБС).
    8. Для проявления DAB срезы инкубируют с раствором для проявления DAB (3 мин в темноте при RT) с последующей промывкой дистиллированной водой. DAB действует как хромогенный субстрат для фермента пероксидазы хрена (HRP), который становится коричневым при окислении.
    9. Используйте гематоксилин для противостояния в течение примерно 2 мин, дифференцируйте срезы 1% соляным спиртом в течение 5 с, затем промойте под проточной водой до посинения.
    10. Обезвоживайте, последовательно помещая секции в ряд этанола от низкой до высокой концентрации, прозрачного с содержанием ксилола I и II, и устанавливайте секции с нейтральной камедью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура занимает примерно 18-24 часа, включая ночную первичную инкубацию антител.
    11. Случайным образом выберите три поля зрения (200x) для каждого участка и проанализируйте результаты окрашивания участков с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Программное обеспечение Image Pro Plus 6.0 использовалось в соответствии с приведенными ниже инструкциями.
    12. Во-первых, импортируйте изображение раздела в программу.
    13. Коррекция плотности: Чтобы обеспечить точные результаты, выполните коррекцию плотности.
      1. Перейдите к разделу Измерение > калибровка > интенсивность > новый > стандартные параметры плотности > > изображение. Затем нажмите на пустую область изображения, чтобы записать значение фона, и подтвердите его, нажав OK.
    14. Настройка параметров измерения: настройка параметров измерения для вычисления площади и интегрированной оптической плотности (IOD).
      1. Нажмите «Измерить > количество/размер > «Измерить» > выбрать «Измерения». Выберите Area(100) и IOD, затем нажмите OK.
      2. Перейдите в Настройки, отметьте галочкой Темный фон на образце, 4-Connect Pre-Filter и нажмите OK.
    15. Выбор цвета: Чтобы точно определить положительный результат, выберите цвета, чтобы определить окрашенные участки по сравнению с неокрашенными.
      1. Нажмите на кнопку «Выбрать цвета» > гистограмме на основе > HSI. Отрегулируйте значение H в соответствии с изображением, сохраняя S неизменным, а I в диапазоне от нуля до значения фона. Затем подтвердите, нажав « Закрыть».
      2. Сбор и расчет данных: Выполните сбор и вычисление данных, нажав на «Измерить > сборщик данных > макете», где выбраны «Имя», «Площадь» и «IOD». Затем нажмите « Подсчитать > собрать сейчас» > списке данных , чтобы экспортировать данные для дальнейшего анализа или хранения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это привело к полуколичественному измерению экспрессии белка в каждом разделе с точки зрения IOD/Area, что показывает, сколько белка присутствует по отношению к общей анализируемой площади.
  4. Вестерн-блоттинг
    1. Достаньте ткань почки и разрежьте ее на кусочки. Поместите эти кусочки в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте предварительно охлажденный раствор для лизиса белка (50 мМ Tris [pH 7,4], 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия [SDS]) и гомогенизируйте.
    2. Оставьте на льду на 30 минут, затем центрифугируйте при 13400 x g в течение 20 минут при 4 °C. Полученный образец храните в морозильной камере при температуре -80 °C.
    3. Используйте метод Брэдфорда для количественного определения белков.
      1. Приготовьте рабочий раствор Coomassie Brilliant Blue, смешав реагент и дистиллированную воду в соотношении 1:4.
      2. Установите три группы - пустую, стандартную группу белка и группу образцов белка. Добавьте 3 мл рабочего раствора Coomassie Brilliant Blue в каждую группу вместе с физиологическим раствором для пустой группы, стандартным белком для стандартной группы и экстрагированным надосадочным белком для группы образцов.
      3. Дав смесям постоять 5 минут, измерьте их показатели поглощения с помощью ультрафиолетового спектрофотометра.
      4. Рассчитайте концентрацию образца по следующей формуле: Концентрация белка (мг/мл) = (Значение поглощения образца/Стандартное значение поглощения в пробирке) x Стандартная концентрация белка x 5.
    4. Добавьте равный объем 6-кратного загрузочного буфера к каждому образцу белка. Варить при 100 °C в течение 5 минут перед апикированием и хранением в морозильной камере при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
    5. Выполните стандартный электрофорез, промокание и блокаду.
      1. Выполните стандартный электрофорез (PAGE) в полиакриламидном геле SDS с использованием геля с разрешением 12%. Подавайте постоянное напряжение 100 В для укладывающего геля и 120 В для разрешающего геля до тех пор, пока фронт красителя не достигнет дна геля.
      2. Перенос белков на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) при напряжении 100 В в течение 2 ч в холодном помещении при 4 °C с использованием системы влажного переноса.
      3. После переноса белка заблокируйте мембраны 5% обезжиренным молоком в TBST на 1 ч при RT.
    6. Разведите первичные антитела EGFR (1:2,000), p-EGFR (1:2,000), MAPK3/1 (1:2,000), p-MAPK3/1 (1:2,000), Bcl-2 (1:2,000), BAX (1:2,000) и CAPDH (1:5,000) в TBST с 5% BSA. Добавьте эти разведенные первичные антитела и инкубируйте мембраны в течение ночи при температуре 4 °C с легким перемешиванием.
    7. После трехкратной промывки мембраны TBST добавить разведенные вторичные антитела (1:5000) с последующей инкубацией в течение 1 ч. После обработки цвета выполните количественный анализ целевых полос с помощью программного обеспечения ImageJ.
  5. Анализ количественной ПЦР
    1. Группировка: Распределите образцы по группам - Контрольная, DN, Ирбесартан, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
    2. Экстракция РНК: Выполните гомогенизацию тканей и экстракцию РНК с последующим добавлением хлороформа, центрифугированием и осаждением РНК в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Осаждение и промывка РНК: Осаждение РНК изопропанолом и промывка этанолом.
    4. Солюбилизация РНК: Высушите гранулу РНК и растворите ее в воде, обработанной DEPC.
    5. Синтез кДНК: Выполните обратную транскрипцию с использованием определенных реакционных смесей в соответствии с инструкциями производителя.
    6. Амплификация количественной ПЦР: Используйте специальные праймеры для GAPDH, MAPK3, MAPK1 и EGFR для количественной ПЦР и выполняйте амплификацию в соответствии с инструкциями производителя.
      Последовательности праймеров были следующими:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTTTGATTGG-3'.

6. Статистические методы

  1. Выполните анализ с помощью соответствующего программного обеспечения (например, SPSS) и представьте измеренные данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения. Если данные соответствовали критериям нормального распределения и дисперсионной однородности, провести сравнение между группами с помощью одностороннего ANOVA и провести многократные сравнения методом Бонферрони.
  2. Используйте тест T2 для множественных сравнений, если дисперсия не является однородной. Рассмотрим P < 0,05 как статистически значимый.

Результаты

В соответствии с протоколом в результате анализа после скрининга и дедупликации были получены 90 активных ингредиентов JWSJS в соответствии с установленными стандартами OB и DL. Среди них 20 видов Hedysarum Multijugum Maxim, 23 вида Epimrdii Herba, 15 видов Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 видов ...

Обсуждение

В нашем исследовании использовалась комбинация сетевой фармакологии, молекулярного докинга и животных моделей in vivo . Важным шагом стало создание сети «лекарственный компонент-мишень», которая имела решающее значение для выявления потенциальных механизмов JWSJS ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано общим проектом Фонда естественных наук провинции Хэбэй, Китай (No H2019423037).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2×SYBR Green qPCR Master Mix Servicebio, Wuhan, ChinaG3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
3,3'-DiaminobenzidineShanghai Huzheng Biotech, China91-95-2
Automatic biochemical analysis instrumentHitachi, Japan7170A
Anhydrous EthanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
BAX Primary antibodies Affinity, USAAF0120Rat
BCL-2 Primary antibodies Affinity, USAAF6139Rat
BX53 microscopeOlympus, JapanBX53
Chloroform SubstituteECOTOP, Guangzhou, ChinaES-8522
Desmond software New York, NY, USARelease 2019-1
Digital Constant Temperature Water BathChangzhou Jintan Liangyou Instrument, ChinaDK-8D
EGFR Primary antibodies Affinity, USAAF6043Rat
Embed-812 RESINShell Chemical, USA14900
Fasting blood glucose (FBG)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyserMultiskan; Thermo, USAN/A
GAPDH  Primary antibodies Affinity, USAAF7021Rat
Glycated serum protein (GSP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
Transmission electron microscopeHitachi, JapanH-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solutionServicebio, USAG1003
Image-Pro PlusMEDIA CYBERNETICS, USAN/A
Real-Time PCR Amplification InstrumentApplied Biosystems, USAiQ5 
Irbesartan tabletsHangzhou Sanofi PharmaceuticalsN/A
IsopropanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
 JWSJS granulesGuangdong Yifang PharmaceuticalN/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging systemKodak, USAIS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
MAPK3/1Primary antibodies Affinity, USAAF0155Rat
Medical CentrifugeHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China TGL-16K
Mini trans-blot transfer systemBio-Rad, USAN/A
Mini-PROTEAN electrophoresis systemBio-Rad, USAN/A
NanoVue Plus SpectrophotometerHealthcare Bio-Sciences AB, Sweden111765
p-EGFR Primary antibodies Affinity, USAAF3044Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solutionServicebio, USAG1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies Affinity, USAAF1015Rat
Secondary antibodies Santa Cruz, USAsc-2357Rabbit
StreptozotocinSigma, USAS0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis KitGeneCopeia, USAQP056T
TriQuick ReagentSolarbio, Beijing, ChinaR1100
Ultra-Clean WorkbenchSuzhou Purification Equipment, ChinaSW-CJ-1F 

Ссылки

  1. Viigimaa, M., Sachinidis, A., Toumpourleka, M., Koutsampasopoulos, K., Alliksoo, S., Titma, T. Macrovascular complications of Type 2 diabetes mellitus. Curr Vasc Pharmacol. 18 (2), 110-116 (2020).
  2. Umanath, K., Lewis, J. B. Update on diabetic nephropathy: Core Curriculum 2018. Am J Kidney Dis. 71 (6), 884-895 (2018).
  3. Han, W., et al. Huangkui capsule alleviates renal tubular epithelial-mesenchymal transition in diabetic nephropathy via inhibiting NLRP3 inflammasome activation and TLR4/NF-kappaB signaling. Phytomedicine. 57, 203-214 (2019).
  4. Giralt-Lopez, A., et al. Revisiting experimental models of diabetic nephropathy. Int J Mol Sci. 21 (10), 3587 (2020).
  5. Lu, Z., Zhong, Y., Liu, W., Xiang, L., Deng, Y. the efficacy and mechanism of Chinese herbal medicine on diabetic kidney disease. J Diabetes Res. 2019, 2697672 (2019).
  6. Niu, H., et al. The therapeutic mechanism of PuRenDan for the treatment of diabetic nephropathy: Network pharmacology and experimental verification. J Ethnopharmacol. 293, 115283 (2022).
  7. Gao, F., Wang, Z., Yang, B., Tan, J. Mechanism of Jiawei Shengjiang San in the treatment of membranous nephropathy based on network pharmacology. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 37 (5), 132-138 (2021).
  8. Li, W., Xie, M. Analysis of composing and application rule in the evolution of Shengjiang San. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine. 44 (10), 894-898 (2021).
  9. Zhang, Y., et al. Mechanism of Jiawei Shengjiang powder in inhibiting renal inflammation and fibrosis in diabetic rats based on TLR4/NF-kappaB and Raf/MEK pathways. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (5), 20-27 (2022).
  10. Zhao, L., et al. Pharmacodynamic mechanism of Yishen Tongluo Formula in treatment of diabetic kidney disease based on network pharmacology and verification of key regulation pathway. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine. 45 (8), 824-834 (2022).
  11. Zhang, J., Liang, R., Wang, L., Yang, B. Effects and mechanisms of Danshen-Shanzha herb-pair for atherosclerosis treatment using network pharmacology and experimental pharmacology. J Ethnopharmacol. 229, 104-114 (2019).
  12. Chen, L., et al. Network pharmacology-based strategy for predicting active ingredients and potential targets of Yangxinshi tablet for treating heart failure. J Ethnopharmacol. 219, 359-368 (2018).
  13. Zhu, M., Qin, Y. C., Gao, C. Q., Yan, H. C., Wang, X. Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food Funct. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  14. Ding, Z., et al. Systems pharmacology reveals the mechanism of activity of Ge-Gen-Qin-Lian decoction against LPS-induced acute lung injury: A novel strategy for exploring active components and effective mechanism of TCM formulae. Pharmacol Res. 156, 104759 (2020).
  15. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
  16. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), e1000412 (2010).
  17. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. . Guides for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).
  18. Ru, J., et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13 (2014).
  19. Xu, X., et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability. Int J Mol Sci. 13 (6), 6964-6982 (2012).
  20. Tao, W., et al. Network pharmacology-based prediction of the active ingredients and potential targets of Chinese herbal Radix Curcumae formula for application to cardiovascular disease. J Ethnopharmacol. 145 (1), 1-10 (2013).
  21. Halladay, C. W., Trikalinos, T. A., Schmid, I. T., Schmid, C. H., Dahabreh, I. J. Using data sources beyond PubMed has a modest impact on the results of systematic reviews of therapeutic interventions. J Clin Epidemiol. 68 (9), 1076-1084 (2015).
  22. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 7, 42717 (2017).
  23. UniProt, C. Reorganizing the protein space at the Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 40 (D1), D71-D75 (2012).
  24. Stelzer, G., et al. The GeneCards Suite: From gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1-33 (2016).
  25. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Curr Protoc Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  26. Zhou, Y., et al. Therapeutic target database update 2022: facilitating drug discovery with enriched comparative data of targeted agents. Nucleic Acids Res. 50 (D1), D1398-D1407 (2022).
  27. Whirl-Carrillo, M., et al. Pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 92 (4), 414-417 (2012).
  28. Law, V., et al. DrugBank 4.0: shedding new light on drug metabolism. Nucleic Acids Res. 42 (D1), D1091-D1097 (2014).
  29. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  30. Xu, J., et al. Pharmacological mechanisms underlying the neuroprotective effects of Alpinia oxyphylla Miq. on Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 2071 (2020).
  31. Tang, Y., Li, M., Wang, J., Pan, Y., Wu, F. X. CytoNCA: a cytoscape plugin for centrality analysis and evaluation of protein interaction networks. Biosystems. 127, 67-72 (2015).
  32. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 16 (5), 284-287 (2012).
  33. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
  34. Yang, X., et al. Rational selection of the 3D structure of biomacromolecules for molecular docking studies on the mechanism of endocrine disruptor action. Chem Res Toxicol. 29 (9), 1565-1570 (2016).
  35. Diller, D. J., Merz, K. M. throughput docking for library design and library prioritization. Proteins. 43 (2), 113-124 (2001).
  36. Hsin, K. Y., Ghosh, S., Kitano, H. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology. PLoS One. 8 (12), e83922 (2013).
  37. Godse, N. R., et al. TMEM16A/ANO1 inhibits apoptosis via downregulation of Bim expression. Clin Cancer Res. 23 (23), 7324-7332 (2017).
  38. Ilhan, I., et al. Irbesartan decreased mitochondrial stress-related apoptosis in cisplatin-induced acute kidney injury via regulating BCL-2/BAX signaling. Mol Biol Rep. 49 (7), 6125-6133 (2022).
  39. Lee, M., et al. Protective effect of hydroxysafflor yellow a on nephropathy by attenuating oxidative stress and inhibiting apoptosis in induced Type 2 diabetes in rat. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7805393 (2020).
  40. Schlessinger, J. Ligand-induced, receptor-mediated dimerization and activation of EGF receptor. Cell. 110 (6), 669-672 (2002).
  41. Gu, X., Chu, L., Kang, Y. Angiogenic factor-based signature predicts prognosis and immunotherapy response in non-small-cell lung cancer. Front Genet. 13, 894024 (2022).
  42. Chu, L., et al. Age-related changes in endogenous glucocorticoids, gonadal steroids, endocannabinoids and their ratios in plasma and hair from the male C57BL/6 mice. Gen Comp Endocrinol. 301, 113651 (2021).
  43. Chen, J., Chen, J. K., Harris, R. C. EGF receptor deletion in podocytes attenuates diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 26 (5), 1115-1125 (2015).
  44. Skibba, M., et al. New EGFR inhibitor, 453, prevents renal fibrosis in angiotensin II-stimulated mice. Eur J Pharmacol. 789, 421-430 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

207EGFR MAPK3 1PI3K AktHIF 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены