Антагонистическое действие Jiawei Shengjiang San на крысиную модель диабетической нефропатии: связано с сигнальным путем EGFR/MAPK3/1

Резюме

Здесь мы представляем протокол, описывающий сетевую фармакологию и методы молекулярного докинга для изучения механизма действия Jiawei Shengjiang San (JWSJS) при лечении диабетической нефропатии.

Аннотация

Мы стремились углубиться в механизмы, лежащие в основе действия Jiawei Shengjiang San (JWSJS) в лечении диабетической нефропатии и развертывании сетевой фармакологии. Используя методы сетевой фармакологии и молекулярного докинга, мы предсказали активные компоненты и мишени JWSJS и построили тщательную сеть «лекарство-компонент-мишень». Анализ онтологии генов (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) был использован для определения терапевтических путей и мишеней JWSJS. Autodock Vina 1.2.0 был развернут для проверки молекулярного докинга, и было проведено моделирование молекулярной динамики за 100 нс для подтверждения результатов докинга, за которым последовала проверка in vivo на животных. Результаты показали, что JWSJS имеет 227 пересекающихся мишеней с диабетической нефропатией, создавая топологию сети белок-белковых взаимодействий. Анализ обогащения KEGG показал, что JWSJS смягчает диабетическую нефропатию за счет модуляции липидов и атеросклероза, сигнального пути PI3K-Akt, апоптоза и сигнального пути HIF-1, с митоген-активируемой протеинкиназой 1 (MAPK1), MAPK3, рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и серин/треонин-протеинкиназа 1 (AKT1), идентифицированными как коллективные мишени нескольких путей. Молекулярный докинг показал, что основные компоненты JWSJS (кверцетин, пальмитолеиновая кислота и лютеолин) могут стабилизировать конформацию с тремя основными мишенями (MAPK1, MAPK3 и EGFR) посредством водородных связей. Обследования in vivo показали заметное увеличение массы тела и снижение уровня гликированного сывороточного белка (GSP), холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C), уридинтрифосфата (UTP) и уровня глюкозы в крови натощак (FBG) из-за JWSJS. Электронная микроскопия в сочетании с гематоксилином и эозином (HE) и периодическим окрашиванием кислотой-Шиффа (PAS) выявила потенциал каждой группы лечения в облегчении повреждения почек в различной степени, демонстрируя различное снижение p-EGFR, p-MAPK3/1 и BAX, а также увеличение экспрессии BCL-2 в тканях почек крыс, получавших лечение. В конечном счете, эти выводы позволяют предположить, что защитная эффективность JWSJS при диабетической нефропатии может быть связана с подавлением активации сигнального пути EGFR/MAPK3/1 и облегчением апоптоза почечных клеток.

Введение

Сахарный диабет (СД) — это хроническое заболевание, которое поражает несколько систем и может вызывать различные осложнения из-за непрерывной гипергликемии, такие как диабетическая нефропатия (ДН), ретинопатия и нейропатия¹. ДН является серьезным осложнением СД, на долю которого приходится около 30-50% случаев терминальной стадии почечной недостаточности (ТХПН)². Его клиническим проявлением является микроальбуминурия, которая может прогрессировать до ТХПН, характеризующейся увеличением объема клубочков, мезангиальной стромальной гиперплазией и утолщением базальной мембраны клубочков³. Патогенез ДН сложен и до конца не выяснен. Клинические методы, такие как снижение уровня глюкозы в крови, регулирование артериального давления и уменьшение протеинурии, в основном используются для задержки ее прогрессирования, но эффект является общим.

В настоящее время не найдено специфического препарата для лечения DN⁴. Однако на протяжении веков китайские растительные препараты широко использовались для лечения СД и его осложнений5, что улучшало клинические симптомы у пациентов и замедляло прогрессирование заболевания. Благодаря преимуществам многокомпонентного, многоцелевого и многопутного эффектов, китайские растительные препараты, как ожидается, станут инновационным источником лекарств для лечения DN⁶.

«Шэнцзян сань» произошел от «Ваньбин Хуэйчунь» врача династии Мин Гун Тинсяня. В книге «Neifu Xianfang» описывается использование Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma и Radix Rhei et Rhizome. Исходя из этого, после добавления Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba и Smilacis Glabrae Rhixoma, он выполняет функцию shengjiang san для повышения ясности, уменьшения мутности, выделения застойного «тепла» и гармонизации «ци» и крови ^7,8. Он также усиливает эффект укрепления селезенки и тонизирования почек. Его эффективность согласуется с патогенезом «ци» ДН к подъему и выпадению из строя из-за дефицита «жизненной энергии», чрезмерной сухости и «жара», а также застоя «тепла», вызванного тройным энерджайзером ^7,8.

Предыдущие клинические исследования показали, что китайские растительные препараты используются для лечения СД и его осложнений, а цзявэй шэнцзян сань (JWSJS) регулирует уровень глюкозы и липидов в крови, снижает протеинурию и значительно улучшает клиническую эффективность пациентов с ранней ДН⁷. Способность JWSJS снижать уровень белка в моче и глюкозы в крови у DN-крыс была подтверждена предыдущими исследованиями. Вероятно, это происходит за счет ингибирования сигнальных путей TXNIP/NLRP3 и RIP1/RIP3/MLKL, уменьшения пироптоза подоцитов и предотвращения некротического апоптоза в почечных тканях DN-крыс, тем самым достигая^{почечной} защиты9. JWSJS может повышать экспрессию белков нефрина и подоцина и уменьшать повреждение подоцитов у DN-крыс, что позволяет предположить, что JWSJS оказывает ингибирующее действие на повреждение подоцитов. JWSJS обладает определенным анти-DN-эффектом с хорошими профилями безопасности, но исследований по нему мало, и эта работа в основном сосредоточена на пироптозе и некротическом апоптозе. Литература не является достаточно глубокой или систематической¹⁰. Наши предыдущие результаты подтвердили, что JWSJS может уменьшить протеинурию и облегчить повреждение почек у DN крыс⁷. Тем не менее, существует всего несколько исследований о механизме JWSJS для лечения ДНК, и им не хватает глубины и систематизации. Таким образом, данное исследование направлено на анализ молекулярных веществ и механизмов действия JWSJS для лечения ДНК с использованием сетевой фармакологии и обеспечение прочной основы для будущих исследований.

Сетевая фармакология является новым методом изучения механизма действия лекарств, включая химиформатику, сетевую биологию, биоинформатику и фармакологию^11,12. Дизайн исследований в области сетевой фармакологии очень похож на холистическую концепцию традиционной китайской медицины^13,14 и является важным методом изучения механизма действия китайских растительных лекарственных средств. Молекулярный докинг может изучать взаимодействия между молекулами и предсказывать их характер связывания и аффинность. Молекулярный докинг стал важнейшим методом в области компьютерных исследований лекарств¹⁵. Таким образом, в этом исследовании была построена сеть взаимодействия JWSJS-DN-мишень с помощью сетевой фармакологии и методов молекулярного докинга, которая предлагает надежную и теоретическую основу для дальнейшего изучения лечения ДНК с помощью JWSJS.

протокол

Все животные содержались и использовались в соответствии с Руководством Национального исследовательского совета США по уходу и использованию лабораторных животных,^8-е издание, и были представлены в соответствии с рекомендациями ARRIVE. Исследование проводилось в соответствии с Руководством Китайского национального исследовательского совета по уходу за лабораторными животными и их использованию и было одобрено Комитетом по этике животных Хэбэйского университета китайской медицины (DWLL2019030).

1. Активные ингредиенты JWSJS и целевая коллекция

1. Введите лекарственный состав JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome и Curcumaelongae Rhizoma) в базу данных¹⁸ фармакологической базы данных и аналитической платформы традиционной китайской медицины (TCMSP) для извлечения всех химических компонентов.  По данным абсорбции, распределения, метаболизма и выведения (ADME) скрининговая пероральная биодоступность (OB) ≥ 30% и лекарственные свойства (DL) ≥ 0,18 химических ингредиентов^19,20.
2. Используйте базу данных TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, версия 2.3) для получения соответствующих мишеней химических ингредиентов.
3. Получите активные ингредиенты Bombyx Batryticatus и Cicadae Periostracum с помощью поиска в базах данных традиционной китайской медицины и химического состава²¹.
4. Для обеспечения достоверности эксперимента выберите соединения с номерами службы химических рефератов (CAS) для этого исследования. Затем загрузите 2D-структурные схемы (формат .sdf) активных ингредиентов от PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, обновлено в 2021 году)²².
5. Используйте SwissADME (www.swissadme.ch, обновлено в 2021 г.)²³для скрининга компонентов с высокой абсорбцией в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) в качестве сходства с препаратами (Липински, Гхош, Вебер, Эган, Мюгге), ≥ 2 пунктов которых были «Да». Это привело к появлению активных компонентов Bombyx Batryticatus и Cicadae Periostracum.
6. Импортируйте их в базу данных TCMSP для прогнозирования целевых белков (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, версия 2.3)¹⁸.
7. Стандартизировать целевые показатели в базе данных UniProt (https://www.uniprot.org, обновлено в 2021 году) со статусом «Рассмотрено» и видом «Человек» ²⁴.

2. DN соответствующая целевая коллекция

1. Поиск по диабетической нефропатии через базы данных GeneCards (https://www.genecards.org/, версия 5.1)²⁵, OMIM (https://omim.org/, обновлено в 2021 году)²⁶, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, обновлено в 2021 году)²⁷, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, обновлено в 2021 году)²⁸ и базы данных DrugBank (https://www.drugbank.ca/, обновлено в 2021 году)²⁹. Получение мишеней DN после объединения и дедупликации.
2. Скрининг общих целей JWSJS и DN и построение сети
   1. Отсейте общие мишени JWSJS и DN с помощью программного обеспечения R 4.2.0 и нарисуйте диаграммы Венна. Импортируйте активные ингредиенты и потенциальные мишени JWSJS в программное обеспечение Cytoscape 3.8.0³⁰ для создания сетевой диаграммы «лекарство-ингредиент-мишень », которая визуализирует связь между лекарствами, ингредиентами, мишенями и болезнями.
   2. Пусть размер узла отражает размер значения градуса, где более высокое значение градуса указывает на то, что узел является более важным в сети.
3. Построение сети белок-белковых взаимодействий ИПП и скрининг основных мишеней
   1. Проанализируйте пересекающиеся гены с помощью онлайн-платформы STRING (Версия:11.5) для построения сети белок-белковых взаимодействий (ИПП)³¹. Постройте сеть с помощью режима анализа множественных белков , установите вид на Homo sapiens и установите минимально необходимую оценку взаимодействия на >0,9³⁰.
   2. Используйте Cytoscape 3.8.0 для топологического анализа сети, вычисления значений центральности между центральностью (BC), центральности близости (CC), центральности степени (DC), центральности собственного вектора (EC), метода на основе локальной средней связности (LAC) и центральности сети (NC) для каждого узла, а также отсейте шесть узлов со значениями, превышающими медиану³². Повторите этот процесс несколько раз, чтобы определить основные мишени JWSJS для ДНК-терапии.
4. Функциональный анализ GO и анализ обогащения путей KEGG
   1. Выполнение анализов обогащения GO и KEGG для идентификации биологических процессов, молекулярных функций, клеточных компонентов и путей, связанных с общими мишенями JWSJS и DN.
   2. Используйте org. Hs.eg.db пакет для получения идентификаторов целей пересечения и используйте clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot и ggplot2 для анализа обогащения³³.
   3. Скрининг для анализа функционального обогащения ГО по топ-10 биологических хитов с скорректированным P-значением < 0,05 и выбор топ-30 путей с наибольшим обогащением для анализа KEGG.

3. Молекулярный докинг

1. Используйте программное обеспечение AutoDock Vina для выполнения молекулярного докинга между основными компонентами JWSJS и основными мишенями для ДНК-терапии³⁴.
2. Выполните поиск в базе данных PubChem для получения файла sdf с 2D-структурой основных компонентов JWSJS. Используйте программное обеспечение ChemBio 3D Ultra14.0 для создания и оптимизации его 3D-структуры, сохранения его в формате mol2 и использования в качестве лигандного файла.
3. Найдите и загрузите 3D-структуру основных мишеней в формате pdb из базы данных Банка данных белков (PDB) Исследовательской совместной лаборатории структурной биоинформатики (RCSB). Используйте программное обеспечение Pymol 2.4.0 для удаления молекул воды и лигандов из структуры белка, сохранения его в формате pdb и использования в качестве рецепторного файла.
4. Импортируйте файл рецептора pdb в программу для гидрирования AutoDockTools 1.5.7, преобразуйте рецепторный белок и низкомолекулярный лиганд в формат pdbqt, установите активный карман для рецепторного белка с коэффициентом Spacing равным 1.
5. Используйте Autodock vina 1.2.0 для молекулярного докинга и рассчитайте энергию связывания; если Affinity < 0, считайте, что молекула спонтанно связывается с белком, большее абсолютное значение Affinity указывает на более стабильное связывание между ними. Наконец, визуализируйте результаты стыковки с помощью программного обеспечения Pymol 2.3.0 и LigPlot 2.2.5.

4. Молекулярно-динамическое моделирование

1. Чтобы выполнить моделирование МД с помощью программного обеспечения Desmond, выполните следующие действия:
   1. Используйте академическую версию программного обеспечения Desmond 2019-1 для оценки стабильности и гибкости белок-лигандных взаимодействий.
   2. Проведение молекулярно-динамических исследований (МД) на трех наиболее перспективных лигандных комплексах, полученных в результате исследований докинга. Проводите моделирование в водной среде SPC с 0,15 М NaCl, воспроизводя физиологические ионные условия. Бокс для моделирования спроектирован таким образом, чтобы растворенное вещество оставалось на расстоянии не менее 10 Å от своих границ. Для нейтрализации электрического заряда системы вводятся противоионы. Кроме того, применяются периодические граничные условия, управляемые параметрами силового поля OPLS 2005.
   3. Инициируйте фазу минимизации энергопотребления на 100 пс с использованием стандартных параметров Desmond.
   4. Обеспечьте стабилизацию температуры и давления на уровне 26,85 °C (300 K) и 1,01325 бар с помощью цепи Носе-Гувера и методологий Мартины-Тобиаса-Кляйна во всех производственных системах MD. Моделирование молекулярной динамики выполняется с временным шагом 2 фс общей продолжительностью 100 нс, с записью атомных координат каждые 100 пс.
   5. Откройте модуль Диаграмма взаимодействий моделирования (SID). Загрузите файлы с данными результатов моделирования в модуль.
   6. Выберите нужный тип анализа из доступных в модуле опций (например, среднеквадратичное отклонение [RMSD], среднеквадратичное колебание [RMSF], анализ водородных связей и т. д.). Укажите любые дополнительные параметры, необходимые для выбранного типа анализа.
   7. Запустите анализ, нажав на кнопку «Анализ» или «Начать».
   8. После завершения анализа просмотрите и интерпретируйте результаты в интерфейсе модуля SID. При необходимости экспортируйте результаты для дальнейшего использования или презентации.

5. Валидация экспериментов на животных

1. Животные и дизайн эксперимента
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании приняли участие 75 самцов крыс породы Спрэг-Доули, которые были получены на животноводческом предприятии класса SPF в возрасте 8 недель с массой тела 150 г ± 20 г (номер сертификата животноводства SCXK [Hebei] 2018-004).
   1. Поместите крыс в лабораторию для животных с SPF и случайным образом разделите их на нормальную и модельную группы после 1 недели адаптивного кормления. Обеспечьте нормальную группу нормальным питанием, а модельной группе — диету с высоким содержанием сахара и жиров. Через 4 недели постите крыс, но не лишайте их воды в течение 12 часов.
   2. В модельную группу вводят внутрибрюшинную инъекцию стрептозотоцина (СТЗ; 35 мг·^кг-1). Через 72 ч проверьте уровень сахара в крови с помощью забора крови из хвостовой вены. Если уровень глюкозы в крови натощак составляет ≥16,7 ммоль· ^L-1, подтвердите его как успешную диабетическую модель.
   3. Подтвердите успешность ДНК-модели, наблюдая за гистопатологическими изменениями в почках крысы.
   4. Случайным образом разделите успешно реплицированные модели на модельную группу, которая получала JWSJS в дозах 4,37 г/кг, 8,73 г/кг и 17,46 г/кг (что эквивалентно 3,2, 6,3 и 12,6 клинически эквивалентной дозе), а также на группу ирбесартана (0,014 г/кг). Каждая группа состояла из 10 крыс. Вводите все препараты через пероральный зонд один раз в день. Поддерживайте этот режим дозирования постоянно в течение 4 недель.
   5. Обезболивайте крыс с помощью внутрибрюшинной инъекции 1% пентобарбитала натрия (50 мг/кг) и подтвердите надлежащую анестезию потерей рефлекса отмены педали. Соберите образцы крови из брюшной аорты перед эвтаназией.
   6. Соберите почки после усыпления крыс с помощью внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия в дозе 150 мг/кг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животные были гуманно усыплены в соответствии с самыми последними рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) по эвтаназии.
2. Анализы на гистологию почек
   Примечание: Ткани почек фиксировались в 4% параформальдегиде и обезвоживались в этаноле через 48 ч; Срезы были погружены в парафин. Срезы разрезали на тонкие (4 мкм) срезы для окрашивания гематоксилином и эозином (ПЭ) и периодическим кислотным Шиффом (PAS), а морфологические изменения гистологии почек наблюдали под световым микроскопом.
   1. Окрашивание HE:
      1. Депарафинизация и гидратация: Обработайте участки тканей ксилолом I и II (по 10 минут), абсолютным спиртом I и II (по 3 минуты). Затем погрузите срезы ткани в 95%, 90%, 80% и 70% этанол (по 2 минуты каждый), а затем промойте дистиллированной водой на 5 минут.
      2. Поместите срезы тканей в краситель гематоксилином на 5 минут, а затем дифференцируйте срезы соляным спиртом в течение 5 секунд.
      3. Поместите секцию в раствор для окрашивания эозина на 3 минуты.
      4. Обезвоживание, очистка и монтаж: Обезвоживайте участки в разное время в различных этанолах (70%, 80%, 90%, 95% и абсолютных этанолах), затем очищайте их в ксилоле I и II, а затем монтируйте с нейтральной камедью.
   2. Окрашивание PAS:
      1. Следуйте шагам депарафинизации, описанным в шаге 5.2.1, и обрабатывайте участок периодическим раствором кислотного окрашивания в течение ~8 минут.
      2. Промойте срезы в дистиллированной воде в течение 2 минут, а затем окрасьте их реагентом Schiff в течение 15 минут в темноте.
      3. Срезы промыть в водопроводной воде в течение 10 минут после обработки реагентом Schiff.
      4. Срезы окрашивают гематоксилином в течение 1 мин, а затем дифференцируют их с помощью HCl-спирта в течение 30 с. Снова промойте срезы в водопроводной воде в течение 5 минут, чтобы ядро окрасилось в синий цвет.
   3. Электронная микроскопия:
      1. Зафиксируйте образцы в 2,5% глутаральдегиде на 3 ч, затем промойте их в PBS в течение 3 ч. Далее обрабатывают образцы в 1% осмиевой кислоте в течение 3 ч, а затем снова промывают в PBS в течение 3 ч.
      2. Обезвоживайте с помощью постепенной серии спиртовых ванн, заканчивающихся ацетоном (каждый этап длится в общей сложности около 2 часов).
      3. Инфильтрируйте образцы смесью эпоксидного пропана и эпоксидной смолы (1:1) при комнатной температуре (RT) в течение 2 часов, а затем чистой эпоксидной смолой при 37 °C в течение еще 2 часов.
      4. После этого образцы отверждаются и затвердевают при все более высоких температурах в течение 36 часов перед срезом. Этот процесс гарантирует, что ткань полностью инфильтрируется смолой, которая затем затвердевает, чтобы обеспечить тонкую нарезку для электронной микроскопии.
      5. Дважды окрашивайте 3% уранилацетата и свинцовой кислотой, а затем осмотрите и сфотографируйте образцы с помощью электронной микроскопии в течение 15 минут.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) следующие: увеличение 7000x в высококонтрастном режиме (Zoom-1 HC-1) с ускоряющим напряжением 80,0 кВ на системе ПЭМ.
3. Иммуногистохимия
   1. Депарафинизация: поместите срезы ткани в ксилол I и II на 10 минут каждый.
   2. Регидратация: Регидратируйте депарафинизированные участки тканей, последовательно помещая их в абсолютный этанол I и II на 3 минуты каждый, а затем 95%, 90%, 80% и 70% этанол на 2 минуты каждый.
   3. Извлечение антигена: Погрузите участки ткани в буферный раствор цитратно-лимонной кислоты 0,1 М под высоким давлением примерно на 5 минут, а затем охладите до состояния ОТ.
   4. Блокирование: Для предотвращения неспецифического связывания антител следует провести блокирование путем инкубации участков ткани с 5% нормальной сывороткой козы при температуре около 37 °C в течение 30 минут.
   5. Инкубация первичных антител: добавьте первичные антитела p-EGFR (разбавленные 1:200) и p-MAPK3/1 (разведенные 1:200) на срезы тканей и инкубируйте в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
   6. Инкубация вторичных антител: Трижды промойте срезы PBS, затем добавьте меченные биотином вторичные антитела (разведенные в PBS в соответствии с инструкциями производителя) на срезы и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
   7. Нанесите на участки ткани рабочий раствор стрептавидина, конъюгированный с пероксидазой хрена, при температуре 37 °С с последующим трижды промыванием фосфатно-солевым буфером (ПБС).
   8. Для проявления DAB срезы инкубируют с раствором для проявления DAB (3 мин в темноте при RT) с последующей промывкой дистиллированной водой. DAB действует как хромогенный субстрат для фермента пероксидазы хрена (HRP), который становится коричневым при окислении.
   9. Используйте гематоксилин для противостояния в течение примерно 2 мин, дифференцируйте срезы 1% соляным спиртом в течение 5 с, затем промойте под проточной водой до посинения.
   10. Обезвоживайте, последовательно помещая секции в ряд этанола от низкой до высокой концентрации, прозрачного с содержанием ксилола I и II, и устанавливайте секции с нейтральной камедью.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура занимает примерно 18-24 часа, включая ночную первичную инкубацию антител.
   11. Случайным образом выберите три поля зрения (200x) для каждого участка и проанализируйте результаты окрашивания участков с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Программное обеспечение Image Pro Plus 6.0 использовалось в соответствии с приведенными ниже инструкциями.
   12. Во-первых, импортируйте изображение раздела в программу.
   13. Коррекция плотности: Чтобы обеспечить точные результаты, выполните коррекцию плотности.
       1. Перейдите к разделу Измерение > калибровка > интенсивность > новый > стандартные параметры плотности > > изображение. Затем нажмите на пустую область изображения, чтобы записать значение фона, и подтвердите его, нажав OK.
   14. Настройка параметров измерения: настройка параметров измерения для вычисления площади и интегрированной оптической плотности (IOD).
       1. Нажмите «Измерить > количество/размер > «Измерить» > выбрать «Измерения». Выберите Area(100) и IOD, затем нажмите OK.
       2. Перейдите в Настройки, отметьте галочкой Темный фон на образце, 4-Connect Pre-Filter и нажмите OK.
   15. Выбор цвета: Чтобы точно определить положительный результат, выберите цвета, чтобы определить окрашенные участки по сравнению с неокрашенными.
       1. Нажмите на кнопку «Выбрать цвета» > гистограмме на основе > HSI. Отрегулируйте значение H в соответствии с изображением, сохраняя S неизменным, а I в диапазоне от нуля до значения фона. Затем подтвердите, нажав « Закрыть».
       2. Сбор и расчет данных: Выполните сбор и вычисление данных, нажав на «Измерить > сборщик данных > макете», где выбраны «Имя», «Площадь» и «IOD». Затем нажмите « Подсчитать > собрать сейчас» > списке данных , чтобы экспортировать данные для дальнейшего анализа или хранения.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Это привело к полуколичественному измерению экспрессии белка в каждом разделе с точки зрения IOD/Area, что показывает, сколько белка присутствует по отношению к общей анализируемой площади.
4. Вестерн-блоттинг
   1. Достаньте ткань почки и разрежьте ее на кусочки. Поместите эти кусочки в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте предварительно охлажденный раствор для лизиса белка (50 мМ Tris [pH 7,4], 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия [SDS]) и гомогенизируйте.
   2. Оставьте на льду на 30 минут, затем центрифугируйте при 13400 x g в течение 20 минут при 4 °C. Полученный образец храните в морозильной камере при температуре -80 °C.
   3. Используйте метод Брэдфорда для количественного определения белков.
      1. Приготовьте рабочий раствор Coomassie Brilliant Blue, смешав реагент и дистиллированную воду в соотношении 1:4.
      2. Установите три группы - пустую, стандартную группу белка и группу образцов белка. Добавьте 3 мл рабочего раствора Coomassie Brilliant Blue в каждую группу вместе с физиологическим раствором для пустой группы, стандартным белком для стандартной группы и экстрагированным надосадочным белком для группы образцов.
      3. Дав смесям постоять 5 минут, измерьте их показатели поглощения с помощью ультрафиолетового спектрофотометра.
      4. Рассчитайте концентрацию образца по следующей формуле: Концентрация белка (мг/мл) = (Значение поглощения образца/Стандартное значение поглощения в пробирке) x Стандартная концентрация белка x 5.
   4. Добавьте равный объем 6-кратного загрузочного буфера к каждому образцу белка. Варить при 100 °C в течение 5 минут перед апикированием и хранением в морозильной камере при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
   5. Выполните стандартный электрофорез, промокание и блокаду.
      1. Выполните стандартный электрофорез (PAGE) в полиакриламидном геле SDS с использованием геля с разрешением 12%. Подавайте постоянное напряжение 100 В для укладывающего геля и 120 В для разрешающего геля до тех пор, пока фронт красителя не достигнет дна геля.
      2. Перенос белков на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) при напряжении 100 В в течение 2 ч в холодном помещении при 4 °C с использованием системы влажного переноса.
      3. После переноса белка заблокируйте мембраны 5% обезжиренным молоком в TBST на 1 ч при RT.
   6. Разведите первичные антитела EGFR (1:2,000), p-EGFR (1:2,000), MAPK3/1 (1:2,000), p-MAPK3/1 (1:2,000), Bcl-2 (1:2,000), BAX (1:2,000) и CAPDH (1:5,000) в TBST с 5% BSA. Добавьте эти разведенные первичные антитела и инкубируйте мембраны в течение ночи при температуре 4 °C с легким перемешиванием.
   7. После трехкратной промывки мембраны TBST добавить разведенные вторичные антитела (1:5000) с последующей инкубацией в течение 1 ч. После обработки цвета выполните количественный анализ целевых полос с помощью программного обеспечения ImageJ.
5. Анализ количественной ПЦР
   1. Группировка: Распределите образцы по группам - Контрольная, DN, Ирбесартан, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
   2. Экстракция РНК: Выполните гомогенизацию тканей и экстракцию РНК с последующим добавлением хлороформа, центрифугированием и осаждением РНК в соответствии с инструкциями производителя.
   3. Осаждение и промывка РНК: Осаждение РНК изопропанолом и промывка этанолом.
   4. Солюбилизация РНК: Высушите гранулу РНК и растворите ее в воде, обработанной DEPC.
   5. Синтез кДНК: Выполните обратную транскрипцию с использованием определенных реакционных смесей в соответствии с инструкциями производителя.
   6. Амплификация количественной ПЦР: Используйте специальные праймеры для GAPDH, MAPK3, MAPK1 и EGFR для количественной ПЦР и выполняйте амплификацию в соответствии с инструкциями производителя.
      Последовательности праймеров были следующими:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTTTGATTGG-3'.

6. Статистические методы

1. Выполните анализ с помощью соответствующего программного обеспечения (например, SPSS) и представьте измеренные данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения. Если данные соответствовали критериям нормального распределения и дисперсионной однородности, провести сравнение между группами с помощью одностороннего ANOVA и провести многократные сравнения методом Бонферрони.
2. Используйте тест T2 для множественных сравнений, если дисперсия не является однородной. Рассмотрим P < 0,05 как статистически значимый.

Результаты

В соответствии с протоколом в результате анализа после скрининга и дедупликации были получены 90 активных ингредиентов JWSJS в соответствии с установленными стандартами OB и DL. Среди них 20 видов Hedysarum Multijugum Maxim, 23 вида Epimrdii Herba, 15 видов Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 видов ...

Обсуждение

В нашем исследовании использовалась комбинация сетевой фармакологии, молекулярного докинга и животных моделей in vivo . Важным шагом стало создание сети «лекарственный компонент-мишень», которая имела решающее значение для выявления потенциальных механизмов JWSJS ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F