Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي نظام تحريض شبكية العين العصبي 3D الأمثل الذي يقلل من التصاق وانصهار عضويات الشبكية مع قابلية عالية للتكرار والكفاءة.

Abstract

اعتلال الشبكية هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى في جميع أنحاء العالم. التحقيق في التسبب في المرض أمر ضروري للتشخيص المبكر والعلاج في الوقت المناسب لاعتلال الشبكية. لسوء الحظ ، تعيق الحواجز الأخلاقية جمع الأدلة من البشر. في الآونة الأخيرة ، أظهرت العديد من الدراسات أنه يمكن تمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) إلى عضويات شبكية العين (ROs) باستخدام بروتوكولات تحريض مختلفة ، والتي لديها إمكانات هائلة في اعتلال الشبكية لنمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية. تصف هذه الدراسة بروتوكول الحث الأمثل لتوليد شبكية العين العصبية (NR) التي تقلل بشكل كبير من احتمال الحويصلة والانصهار ، مما يزيد من معدل نجاح الإنتاج حتى اليوم 60. استنادا إلى قدرة PSCs على إعادة التنظيم الذاتي بعد الانفصال ، جنبا إلى جنب مع بعض العوامل التكميلية ، يمكن لهذه الطريقة الجديدة أن تدفع على وجه التحديد تمايز NR. علاوة على ذلك ، فإن النهج غير معقد وفعال من حيث التكلفة ، ويظهر قابلية تكرار وكفاءة ملحوظة ، ويقدم آفاقا مشجعة لنماذج شخصية لأمراض الشبكية ، ويوفر خزانا وفيرا للخلايا لتطبيقات مثل العلاج بالخلايا ، وفحص الأدوية ، واختبار العلاج الجيني.

Introduction

تعمل العين كمصدر أساسي للمعلومات بين الأعضاء الحسية البشرية ، حيث تكون شبكية العين هي النسيج الحسي البصري الرئيسي في عيون الثدييات1. يعتبر اعتلال الشبكية أحد الأسباب العالمية الرئيسية لأمراض العيون ، مما يؤدي إلى العمى2. يعاني ما يقرب من 2.85 مليون شخص في جميع أنحاء العالم من درجات متفاوتة من ضعف البصر بسبب اعتلال الشبكية3. وبالتالي ، فإن التحقيق في التسبب في المرض أمر بالغ الأهمية للتشخيص المبكر والعلاج في الوقت المناسب. ركزت معظم الدراسات حول اعتلال الشبكية البشري بشكل أساسي على النماذج الحيوانية4،5،6. ومع ذلك ، فإن شبكية العين البشرية هي نسيج معقد متعدد الطبقات يضم أنواعا مختلفة من الخلايا. عادة ما تفشل زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) وأنظمة النماذج الحيوانية في تلخيص التطور الزماني المكاني الطبيعي واستقلاب الدواء لشبكية العين البشرية الأصلية 7,8.

في الآونة الأخيرة ، تطورت تقنيات زراعة 3D لتوليد أعضاء تشبه الأنسجة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) 9,10. لا تحتوي عضويات الشبكية (ROs) المتولدة من PSCs البشرية في نظام ثقافة تعليق ثلاثي الأبعاد على سبعة أنواع من خلايا الشبكية فحسب ، بل تظهر أيضا بنية طبقية مميزة مماثلة لشبكية العين البشرية في الجسم الحي11،12،13. اكتسبت ROs المشتقة من PSC البشرية شعبية وتوافر واسع النطاق وهي حاليا أفضل النماذج في المختبر لدراسة تطور ومرض شبكية العين البشرية14,15. على مدى العقود القليلة الماضية ، أثبت العديد من الباحثين أن PSCs البشرية ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، يمكن أن تتمايز إلى ROs باستخدام بروتوكولات تحريض مختلفة. تحمل هذه التطورات إمكانات هائلة في اعتلال الشبكية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية16،17،18.

ومع ذلك ، فإن توليد شبكية العين العصبية (NR) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) هو عملية معقدة ومرهقة وتستغرق وقتا طويلا. علاوة على ذلك ، قد تؤدي الاختلافات من دفعة إلى أخرى في عضويات الأنسجة إلى انخفاض قابلية استنساخ النتائج19،20. يمكن أن تؤثر العديد من العوامل الجوهرية والخارجية على إنتاجية عضويات الشبكية (ROs) ، مثل عدد أو أنواع الخلايا الأولية واستخدام عوامل النسخ ومركبات الجزيئات الصغيرة21،22،23. منذ أن تم إنشاء أول RO بشري بواسطة مختبر Sasai11 ، تم اقتراح تعديلات متعددة على مر السنين لتعزيز سهولة وفعالية عملية الحث13،21،24،25. لسوء الحظ ، حتى الآن ، لم يتم إنشاء بروتوكول قياسي ذهبي لتوليد ROs في جميع المختبرات. في الواقع ، هناك درجة معينة من التناقض في ROs الناتجة عن طرق الحث المختلفة ، وكذلك التباين الواسع في التعبير عن علامات الشبكية وقوة هيكلها22,26. قد تعقد هذه القضايا بشدة جمع العينات وتفسير نتائج الدراسة. لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكول تمايز أكثر توحيدا وقوة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة مع الحد الأدنى من عدم تجانس توليد RO.

تصف هذه الدراسة بروتوكول الحث الأمثل بناء على مزيج من Kuwahara et al.12 و Döpper et al.27 مع تعليمات مفصلة. تقلل الطريقة الجديدة بشكل كبير من احتمال الحويصلة العضوية والانصهار ، مما يزيد من معدل نجاح توليد NR. يحمل هذا التطور وعدا كبيرا لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية وتطبيقات العلاج بالخلايا لاضطرابات الشبكية.

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات المؤسسية في مستشفى جيش التحرير الشعبي الصيني العام. تم الحصول على خط ESC WA09 (H9) من معهد أبحاث WiCell.

1. الإعلام الثقافي وإعداد الكاشف

  1. وسيط ثقافة ESC البشرية وحل المرور
    1. وسط الصيانة (مم): قم بإعداد 500 مل من MM الكامل (الوسط الأساسي + ملحق 5x ؛ انظر جدول المواد) بشكل معقم. قم بإذابة 5x مكمل في درجة حرارة الغرفة (RT) أو طوال الليل عند 2-8 درجة مئوية. يقلب جيدا قبل الاستخدام حتى يصبح المكمل خاليا من الغيوم.
    2. 1٪ مصفوفة خارج الخلية (ECM): استخدم طرف ماصة مبرد مسبقا وأنابيب معقمة لتوزيع 200 ميكرولتر من ECM (انظر جدول المواد) لكل أنبوب على الجليد. قم بتخزين الأنابيب في فريزر -20 درجة مئوية. قم بإذابة ECM على الجليد وخففه باستخدام DMEM / F12 المبرد مسبقا عند 1: 100.
    3. 0.5 mM pH = 8.0 EDTA: لتحضير 500 مل من 0.5 mM EDTA ، أضف 500 ميكرولتر من 0.5 M EDTA و 0.9 جم من NaCl إلى 500 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتخزن على حرارة 2-8 درجة مئوية.
  2. وسط تمايز الشبكية
    1. وسط محدد كيميائيا خال من عوامل النمو (gfCDM): قم بإعداد gfCDM من خلال الجمع بين 45٪ من متوسط Dulbecco's GlutaMAX المعدل من Iscove (IMDM-GlutaMAX) ، و 45٪ من Ham's F12-GlutaMAX (F12-Glutamax) ، واستبدال مصل الضربة القاضية بنسبة 10٪ (KSR) ، وتركيز دهون الكوليسترول بنسبة 1٪ ، و 450 ميكرومتر ثيوجلسرين (انظر جدول المواد).
  3. مركبات الجزيئات الصغيرة
    1. Y-27632 2HCl: أضف 50 مجم من مسحوق Y-27632 إلى 3.122 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). الاستغناء عن وتخزين Y-27632 (انظر جدول المواد) بتركيز 50 mM عند -80 °C لمدة 2 سنوات ، مع الابتعاد عن الضوء. قم بتخفيف المخزون 2500 مرة (20 ميكرومتر) للاستخدام ، أي ما يعادل 0.4 ميكرولتر من Y-27632 لكل مل من gfCDM.
    2. IWR1-endo: أضف 2.4424 مل من DMSO لإذابة 10 ملغ من IWR1-endo (انظر جدول المواد) للحصول على محلول مخزون 10 mM. الاستغناء عن القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 سنوات. أضف 0.3 ميكرولتر من 10 mM IWR1-endo لكل مل من gfCDM لتركيز 3 ميكرومتر للتحريض.
    3. SB431542: لتحضير 50 مللي مول SB431542 ، أضف 10 مجم من SB431542 (انظر جدول المواد) إلى 0.5203 مل من DMSO واخلطها جيدا. يحفظ في -80 درجة مئوية في مذيب لمدة أقصاها 2 سنة. لإعداد SB431542 بتركيز عمل 10 ميكرومتر ، أضف 2 ميكرولتر من محلول المخزون 50 مللي متر إلى 10 مل من gfCDM.
    4. LDN-193189 2HCl: قم بإذابة 5 مجم من LDN-193189 2HCl (انظر جدول المواد) في 10.4297 مل من DMSO للحصول على 1 mM من محلول المخزون. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية (على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة). أضف 0.1 ميكرولتر من المخزون إلى كل 10 مل من gfCDM ، مما ينتج عنه 100 نانومتر من LDN-193189 للتحريض.
    5. البروتين المورفولوجي العظمي البشري المؤتلف 4 (BMP4): يعاد تكوينه عند 50-200 ميكروغرام / مل في 4 ملليمتر حمض الهيدروكلوريك (انظر جدول المواد). يخزن في درجة حرارة 2 إلى 8 درجات مئوية لمدة شهر واحد أو -20 درجة مئوية لمدة عام واحد بعد إعادة التكوين. إجراء تحريض NR باستخدام 1.5 نانومتر BMP4.
  4. وسط ثقافة NR طويل الأجل
    1. حمض الريتينويك (RA): قم بقياس 6 مجم من مسحوق RA (انظر جدول المواد) وأضفه إلى 3.9941 مل من DMSO. يخزن في قسومة 5 مللي مول عند -80 درجة مئوية ويستخدم في غضون 3 أشهر. لتحقيق تركيز عمل يبلغ 0.5 ميكرومتر ، أضف 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى 100 مل من وسط تمايز الشبكية العصبية (NRDM). أضف قبل الاستخدام مباشرة.
      ملاحظة: يحفظ بعيدا عن الضوء أثناء التحضير والتخزين.
    2. التورين: أضف مسحوق التورين (انظر جدول المواد) الذي يزن 200 مجم إلى 7.9904 مل من DMSO للحصول على محلول مخزون 200 مللي متر. يوزع ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. يتم تحقيق تركيز عمل قدره 0.1 mM taurine بإضافة 50 ميكرولتر من محلول المخزون لكل 100 مل من NRDM.
    3. NRDM: قم بتكوين NRDM مع وسط DMEM / F12-GlutaMAX ، ومكمل N2 1٪ ، ومصل بقري جنيني 10٪ ، و 0.5 mM RA و 0.1 mM taurine (انظر جدول المواد). يخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين أو 6 أشهر عند -20 درجة مئوية لضمان نشاط المكونات.
  5. حظر المخزن المؤقت: قم بتخفيف 1: 9 باستخدام DPBS للحصول على حل عملي بنسبة 10٪ للاستخدام (انظر جدول المواد). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 سنوات.
    ملاحظة: نفذ جميع الإجراءات الأخرى في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية لضمان العقم ، باستثناء الوزن. إذا كان من الضروري إضافة الكواشف الموزونة أثناء عملية التحضير ، فاستخدم مرشحات 0.22 ميكرومتر للترشيح.

2. زراعة H9-ESCs

  1. ذوبان H9-ESCs
    1. أضف 1 مل من 1٪ ECM إلى كل بئر من لوحة 6 آبار. احتضان لمدة 1 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية في جو CO2 5٪.
      ملاحظة: تجنب إضافة ECM على طول جدران البئر ، لأنها قد تلتصق بالسطح.
    2. خذ مخزون التبريد H9-ESC من خزان النيتروجين السائل ورجه بسرعة في ماء 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
      ملاحظة: لا تدع القارورة تذوب تماما.
    3. قم بإزالة القارورة وتعقيمها بعناية باستخدام رذاذ الكحول المطهر بنسبة 75٪. أضف H9-ESC المذاب من cryovial إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 9 مل مم مع 10 ميكرومتر Y-27632.
    4. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 190 × جم لمدة 5 دقائق في RT. قم بإزالة معظم المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة سعة 1 مل ، تاركا حوالي 50 ميكرولتر من المادة الطافية لتجنب فقدان الخلايا.
    5. أضف 1 مل من MM يحتوي على 10 ميكرومتر من Y27632 إلى رواسب الخلية وأعد تعليق رواسب الخلية برفق باستخدام ماصة 1 مل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5-10 مرات.
    6. إزالة طلاء ECM بعد 1 ساعة من الحضانة. أضف 2 مل من MM المسخن مسبقا الذي يحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 إلى كل بئر.
    7. الاستغناء عن 0.5 مل من تعليق الخلية لكل بئر. هز اللوحة برفق بشكل جانبي لضمان التوزيع المتساوي للخلايا.
    8. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة على الأقل دون لمسها.
    9. تغيير الوسيلة يوميا. عندما تصل كثافة الاستنساخ إلى 70٪ وما فوق ، يلزم المرور.
  2. تمرير H9-ESCs
    1. قم بإعداد اللوحة المطلية ب ECM كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.1.1) وأضف 2 مل من مم لكل بئر.
    2. قم بإزالة الوسط المستهلك من ألواح 6 آبار. اغسل كل بئر مرتين باستخدام 1 مل من DPBS.
    3. اغسل كل بئر مرتين عن طريق إضافة 1 مل من EDTA ببطء ، واحتضان 1 مل من EDTA لمدة 4-7 دقائق في RT.
      ملاحظة: أثناء الحضانة ، افحص اللوحة المكونة من 6 آبار لمدة 3 دقائق تحت المجهر. انتقل فورا إلى الخطوة التالية إذا كانت معظم الخلايا على وشك الانفصال عن الطبق. تجنب الحضانة لفترة طويلة للحد من التأثير السلبي على الخلايا.
    4. تخلص من EDTA وأضف 1 مل من MM لإجهاض الهضم.
    5. اضغط برفق على لوحة البئر حتى يتم فصل غالبية الخلايا.
    6. انقل تعليق الخلية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مع ماصة سعة 5 مل. أعد تعليق مستعمرات H9-ESC برفق لأعلى ولأسفل 3-5 مرات لخلطها مع حفرة باستور. انقل 20-100 ميكرولتر من تعليق الخلية في طبق استزراع جديد مكون من 6 آبار مطلي ب ECM ورجه ذهابا وإيابا.
    7. عندما يلاحظ أن كثافة الخلية كافية تحت المجهر ، احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة على الأقل دون لمسها.
    8. قم بتغيير الوسائط يوميا. عند كثافة استنساخ 70٪ وما فوق ، يلزم المرور.

3. توليد NRs البشرية

ملاحظة: بمجرد أن تحقق المستعمرات التقاء بنسبة 70٪ تقريبا ، يمكن توجيهها نحو التمايز إلى عضويات شبكية العين (ROs) باستخدام الخطوات الإجرائية الموضحة في الشكل 1.

  1. اليوم 0 - تكوين الجسم الجنيني (EB)
    1. بعد غسل الخلايا ب 2 مل من DPBS ، أضف 0.5 مل من CDS (انظر جدول المواد) تحتوي على 20 ميكرومتر Y27632 إلى البئر. احتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 مرطبة 5٪.
      ملاحظة: تحقق تحت المجهر. تقليل وقت الحضانة قدر الإمكان لتجنب الآثار الضارة على الخلايا.
    2. إجهاض الهضم بإضافة 3 مل من مم تحتوي على 20 ميكرومتر Y27632. أجهزة الطرد المركزي في 190 × غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من gfCDM تحتوي على 20 ميكرومتر Y27632 ، وعد الخلايا. أضف الحجم المقابل ل 1.2 × 106 خلايا (1.2 × 104 خلايا لكل بئر) إلى 10 مل من gfCDM ، والتي تم دمجها مسبقا مع 20 ميكرومتر Y-27632 و 3 ميكرومتر IWR1-endo و 10 ميكرومتر SB431542 و 100 نانومتر LDN-193189 (انظر جدول المواد).
    4. أضف 100 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل بئر من 96 بئرا مخروطية القاع على شكل حرف V. ضع الطبق في حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪ حتى اليوم السادس.
      ملاحظة: لا تحرك الأطباق لمدة 24 ساعة على الأقل لتعزيز التصاق EBs.
  2. اليوم 6 - تحريض الشبكية
    1. في اليوم السادس، أضف 10 مل من gfCDM تحتوي على 55 نانوغرام/مل BMP4 للسماح بتغيير كامل لوسط الاستزراع في EBs. أعد اللوحة إلى الحاضنة.
      ملاحظة: ماصة باتجاه جدران البئر المخروطي ذو القاع V 96 لتجنب فقاعات الهواء. تجنب تناول أي مواد عضوية عند تغيير الوسط.
    2. قم بإجراء تغيير نصف متوسط في اليوم 9 واليوم 12 واليوم 15. استبدل نصف الوسط ب gfCDM الطازج لتخفيف BMP4 تدريجيا.
  3. اليوم 18 - ثقافة NR طويلة الأجل
    1. في اليوم 18 ، انقل EBs المشكلة بعناية إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام ماصات باستور سعة 5 مل وشطفها برفق مرة أخرى باستخدام NRDM. انقل EBs إلى ألواح منخفضة الامتزاز ذات 6 آبار أو 24 بئرا (انظر جدول المواد). أعد اللوحة إلى الحاضنة.
    2. استبدل الوسط ب NRDM طازج كل 3 أيام.
      ملاحظة: أطفئ الضوء أثناء تغيير الوسط لأن RA حساس للضوء. إزالة المواد العضوية المتمايزة بشكل سيئ ، وفصل المواد العضوية الملتصقة تحت المجهر.

4. تحليل NRs البشرية

  1. تركيب مكاتب تسلم الطلبات
    1. حدد أجيالا مختلفة من H9-ESCs للحث على ثلاث دفعات من ROs.
      ملاحظة: تم حساب ثلاث لوحات من عدد NRs للتشكيل لكل طريقة من الطرق الثلاث التي تم تقييمها (Kuwahara et al.12 ، Döpper et al.27 ، والطريقة المعدلة في الدراسة الحالية) لتقييم معدل نجاح الحث. يعتبر الحث ناجحا إذا كشف الفحص المجهري الضوئي عن تكوين هياكل شبيهة بالظهارة العصبية في اليوم 30.
  2. تلطيخ المناعي من ROs
    1. نقل 3-5 ROs إلى أنابيب 1.5 مل. ماصة قبالة الوسط الزائد وغسل ROs مرة واحدة مع 1 مل من DPBS في RT. السماح ل ROs بالغرق وإزالة DPBS بعناية. أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (انظر جدول المواد) لكل أنبوب 1.5 مل وثبته عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: ROs في اليوم 6 واليوم 18 ، إصلاح 2 ساعة. إصلاح لمدة 12 ساعة في اليوم 30 و 14 ساعة في اليوم 60.
    2. بعد التثبيت ، جفف باستخدام الكحول المتدرج. اترك ROs للوقوف لمدة 15 دقيقة لكل منها في 50٪ و 60٪ و 70٪ كحول ، وبعد ذلك لمدة 10 دقائق لكل منها في 80٪ و 90٪ و 95٪ و 100٪ كحول. ثم أضيفي مزيجا 1: 1 من الكحول 100٪ والزيلين لمدة 10 دقائق ، متبوعا بالزيلين مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما.
    3. ضع ROs في قوالب معدنية مملوءة ب paraplast المذاب (انظر جدول المواد) لمدة 40 دقيقة ، ثم قم بإخماد القوالب على الجليد لإصلاح ROs. ضع صناديق التضمين في القوالب وقم بتجميدها عند -20 درجة مئوية طوال الليل. بعد ذلك ، افصل صناديق التضمين بعناية. أخيرا ، قم بتخزينها في RT.
    4. قم بإنشاء أقسام مستمرة (سمك 5 ميكرومتر) باستخدام قطاعة البارافين. إصلاح الشرائح على شرائح مجهر الالتصاق ، وتجفيفها ، وتخزينها في RT.
    5. إجراء إزالة الشمع والإماهة قبل إصلاح المستضد12,27.
    6. أضف 10 مل من محلول استرجاع مستضد سيترات 20x pH 6.0 (انظر جدول المواد) إلى 190 مل من ddH2O (H2O المقطر المزدوج). يسخن في الميكروويف على وضع عال لمدة 4 دقائق حتى الغليان. بعد إضافة أقسام البارافين ، قم بتسخين الأقسام في الوضع المنخفض لمدة 20 دقيقة لإكمال إصلاح المستضد.
    7. اترك أقسام البارافين لتبرد بشكل طبيعي في منطقة جيدة التهوية ثم ضعها في غرفة رطبة.
    8. استخدم قلم عنق الرحم (انظر جدول المواد) لتحديد الأقسام. احتضان 0.2٪ Triton X-100 في RT لمدة 30 دقيقة لكسر الأغشية ، متبوعا بغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام TPBS ، لمدة 5 دقائق لكل منها.
    9. كتلة مع مصل حمار 10 ٪ مخفف في DPBS في RT لمدة 1 ساعة في غرفة رطبة مع 10 ميكرولتر لكل منطقة تلطيخ.
    10. أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة في مصل الحمير بنسبة 10٪. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في غرفة الرطوبة. اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام TPBS لمدة 10 دقائق لكل منها لإزالة الجسم المضاد غير المقيد.
      ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية هي كما يلي: مضاد PAX6 (1: 250) ، مضاد SOX2 (1: 200) ، مضاد KI67 (1: 200) ، مضاد CHX10 (1: 200) ، مضاد β توبولين III (1: 250) ومضاد نستين (1: 200) (انظر جدول المواد).
    11. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في DPBS لمدة 1 ساعة في RT في غرفة مرطبة. كرر خطوة الغسيل مع TPBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
      ملاحظة: ابق في الظلام لمنع إخماد الجسم المضاد الثانوي الفلوري. الأجسام المضادة الثانوية هي Alexa Fluor 488 مترافقة مع IgG المضاد للحمار و Alexa Fluor 568 مترافقة مع IgG المضاد للأرانب عند تخفيف 1: 400 (انظر جدول المواد).
    12. احتضان مع DPBS التي تحتوي على DAPI (1: 500 ؛ انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق في RT في الظلام. اغسل ثلاث مرات باستخدام TPBS لمدة 10 دقائق لكل منها.
    13. قم بإسقاط كمية مناسبة من مانع التسرب المضاد للفلورسنت (انظر جدول المواد) على الشريحة وقم بتغطيتها بزلات الغطاء.
    14. تصور باستخدام محلل كمي لخلايا الأنسجة يشبه التدفق (انظر جدول المواد) ، أو ما شابه ذلك.
    15. قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية في الظلام بعد التحليل المجهري.

النتائج

يظهر الشكل 1 نظرة عامة رسومية على البروتوكول المعدل . تم استخدام H9-ESCs لتوليد ROs عندما نمت الخلايا بكثافة 70٪ -80٪. تم تجميع معلقات أحادية الخلية ل H9-ESCs في 96 بئرا مخروطية القاع على شكل V في اليوم 1 وشكلت EBs مستديرة محدودة جيدا بحلول اليوم 6. مع زيادة وقت الثقافة ، زاد حجم EBs تدريجيا. ف...

Discussion

يمكن ل ROs البشرية أن تلخص مكانيا وزمانيا تطور شبكية العين الجنينية ، وتظهر ROs المبكرة درجة عالية من التشابه مع شبكية العين الجنينية في مراحل مماثلة من التطور15. من حيث مورفولوجيا الأنسجة والتعبير الجزيئي ، يعكس RO البشري عن كثب حالة النمو الفعلية لأنسجة الشبكية ، مما يوفر فرصا ه?...

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

اي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.01 M TPBSServicebioG0002Washing slices
4% ParaformaldehydeServicebioG1101-500MLFix retinal organoids
5 mL Pasteur pipetteNEST Biotechnology318516Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wellsSumitomo BakelitMS-9096VZ
Adhesion Microscope SlidesCITOTEST188105Fix slices
AggreWell mediumSTEMCELL Technologies5893Medium
Anhydrous ethanolSINOPHARM10009218Dehydrate 
Anti-CHX10Santa Cruzsc-365519Primary antibody
Antifade SolutionZSGB-BIOZLI-9556
Anti-KI67Abcamab16667Primary antibody
Anti-NESTINSigmaN5413Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)BeyotimeAT809Primary antibody
Anti-PAX6Abcamab195045Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)STEMCELL Technologies7922Cell dissociation
CHIR99021SelleckchemS2924GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid ConcentrateGibco12531018250×
Citrate Antigen Retrieval SolutionServicebioG1202-250ML20×, pH 6.0
CS10STEMCELL Technologies1001061Cell Freezing Medium
DAPIRoche10236276001Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)SigmaD2650
DMEM/F12Gibco11330032Medium
DMEM/F12-GlutaMAXGibco10565018Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32766Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568InvitrogenA10042Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)BiosharpBL518A0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)Corning354277Coating plates
F12-GlutamaxGibco31765035Medium
Fetal Bovine SerumGibcoA5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzerTissueGnosticsTissueFAXS PlusScan sections
IMDM-GlutaMAXGibco31980030Medium
IWR1-endoSelleckchemS7086Wnt-inhibitor
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028
LDN-193189 2HClSelleckchemS7507BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well PlatesCorning3473
Low-adhesion 6-well PlatesCorning3471
Maintenance medium (MM)STEMCELL Technologies85850Medium
N2 supplementGibco17502048
Normal Donkey SerumSolarbioSL050Blocking buffer
ParaplastLeica39601006Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)GibcoC10010500BTWithout Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)R&D314-BPKey protein factor
Retinoic acidSigmaR2625Powder, keep out of light
SB431542SelleckchemS1067ALK5-inhibitor
SU5402SelleckchemS7667Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP PenZSGB-BIOZLI-9305
TaurineSigmaT0625-10G
ThioglycerolSigmaM1753
Triton X-100SigmaX100Permeabilization
WA09 embryonic stem cell lineWiCell Research InstituteCell line
XyleneSINOPHARM10023418Dewaxing
Y-27632 2HCLSelleckchemS1049ROCK-inhibitor

References

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved