Fare intraserebroventriküler sayesinde Terapötik Ajanlar teslimi (ICV) ve intravenöz (IV) Enjeksiyon

Özet

Merkezi sinir sistemi içine yenidoğan farelerin beyin (intraserebroventriküler) ve (intravenöz) 2) sistemik tedavi ajanları tanıtmak içine 1): Bu makale, enjeksiyon iki çok farklı yöntemler göstermektedir.

Özet

Kan-beyin bariyeri beyni koruyucu oynadığı koruyucu bir role rağmen, santral sinir sistemi (MSS) erişimi sınırlar, nörodejeneratif hastalıklar için ^{tasarlanmış} 1,2 potansiyel terapötikler çoğu kez sonuç başarısızlık . Spinal Müsküler Atrofi (SMA) gibi nörodejeneratif hastalıklar, alt motor nöronlar etkilendiği, merkezi sinir sistemi içine terapötik ajanlar tanıtan büyük fayda edebilir. Bu videonun amacı, yenidoğan farelerin doğumdan kısa süre sonra tedavi malzemeleri teslim etmek için iki farklı enjeksiyon paradigmalar göstermektir. Bu yöntemlerden biri, beyin omurilik ^sıvısı 3,4 yoluyla CNS içine malzeme teslim sonuçlar serebral lateral ventriküller (intraserebroventriküler) içine doğrudan enjekte İkinci yöntem, merkezi sinir sistemi de dahil olmak ^üzere 5 sistemik teslim giden, dolaşım sistemi içine farklı terapötikler tanıtmak temporal ven enjeksiyonu (intravenöz) . Uygun bir viral vektör ve viral serotip kullanılmaktadır MSS yaygın transdüksiyon ulaşılabilir. Görselleştirme ve enjeksiyon için temporal ven kullanımı, doğum sonrası gün 6 uygulanabilir. Ancak, teslim edilen malzeme, MSS ulaşmak için amaçlanan ise kan-beyin bariyeri nedeniyle olgunlaşmamış durumu daha geçirgen ise, bu enjeksiyonları, tercihen önce doğum sonrası gün 2 yer almalıdır. Tam gelişmiş kan-beyin bariyeri intravenöz teslim etkinliğini büyük ölçüde sınırlar. Her iki dağıtım sistemleri, cerrahi yetenek sağlandıktan sonra, basit ve etkili. Herhangi bir geniş cerrahi cihazlar gerek yoktur ve tek bir kişi tarafından yapılabilir. Ancak, bu teknikler zorlukları olmadan değildir. Postnatal 2. günde yavrular ve küçük bir sonraki hedef alanları küçük boyutlu enjeksiyonları gerçekleştirmek için çoğaltmak için başlangıçta zor ve zorlu yapabilirsiniz.

Protokol

1. Intraserebroventriküler enjeksiyon

1. İlk adım enjeksiyon stok çözümler hazırlanması; bu çözümler viral vektör, plazmid DNA, uyuşturucu ve steril koşullar altında enjekte edilmelidir.
2. Istenen bir viral vektör (5-7 mcL toplam) titresi 0.05% w / v tripan mavi enjeksiyon görünüm için PBS ile karıştırın.
3. Plazmid DNA solüsyonu (5 l mcL toplam) D-(+)-glikoz oranı% 20 (w / v) (1 mcL), tripan mavisi (% 0.05), PBS (1 mcL), plazmid (~ 5 ~ g / ~ L içerir. ) (2 ~ L) ve 2.5 kDa doğrusal PEI homopolimer (150 mM) (1 ~ L).
4. PND 2 yenidoğanlarda cryo anestezi ile 1-2 dakika boyunca hareketsiz.
5. Bu enjeksiyon için kullanılan iğne, uzun bir tüp aracılığıyla 3ml 3 mL Hamilton şırınga takılı bir mikro-litre kalibre steril cam mikropipet.
6. Kafatasının içine 2 mm penetrasyon için ayarlamak için (spatula ile) iğne ucu kırın. Enjeksiyon çözeltisi içeren mikrosantrifüj tüp çapraz iğne yerleştirin. Şırınganın pistonu dikkatlice çekerek iğne içine enjeksiyon çözüm yükleyin.
7. Çözüm alındıktan sonra, tüpten şırınga ilişkisini; piston daha yukarı çekin ve sonra tekrar iğne eklemek.
8. Sağ el başparmak ve işaret parmakları arasında Hold iğne ve şırınga pistonu dokunmadan sağ elin avuç içi ile orta ve yüzük parmakları arasında yerleştirin.
9. Immobilize fare ilgili anatomik yapıların bir kılavuz olarak kullanılabilir aydınlatmak için sol eliyle yer ve bir fiber-optik ışık kullanarak deri başın arkasında sıkıca kavrayın.
10. Bir konuma yaklaşık 0,25 mm lateral sagital sütür ve yenidoğan koroner dikiş (Şekil 1A) 0,50-0,75 mm rostral, kafatası yüzeye dik, derin iğne 2 mm yerleştirin. Sonra avuç kullanarak piston itme sağ eli çok yavaş ve dikkatli bir şekilde. Rüptüre damarlar ya da yüzde şişme izleyin.
11. Geri akışı önlemek için piston hareketi kesildikten sonra iğne 15 saniye kaldırın.
12. Kurtarma hareketi ve genel tepki restore kadar ısıtılmış bir kapta 5-10 dakika süreyle fareler tutmak için.

2. Intravenöz enjeksiyon yoluyla temporal / facialis'ten

1. Enjekte edilebilir bir çözüm hazırlanmış ve süzülmüş yeşil gıda boyası ile desteklenmiş 1:100 dilüsyon ve steril koşullar altında enjekte edilmelidir.
2. 100 mcL cam Hamilton şırınga sonuna kadar döner küçük bir plastik takın. Döner, 33 gauge 0,25 inç derialtı iğne takın. Bütün parçaları sıkıca bağlı olduğundan emin sigortalayın.
3. Sağlanması, hava, damar içine hava enjeksiyon şeklinde şırınga olduğunu şırınga enjekte edilecek hacim yükleyin ölümcül. Genellikle pipetlemeyin parafilm bir parça şöyle enjekte edilecek hacim yardımcı olur. Bu açık bir görünüm için şırıngaya çözüm alımını sağlar.
4. Wee Sight transilluminator'de kolayca yenidoğanda temporal ven veya yüz damar, (Şekil 2A) görselleştirmek için kullanılır. Enjeksiyondan önce, cerrahi bant kullanarak transilluminator'de yenidoğan güvenli. Tül hayvan derisine zarar bandı önlemek için yenidoğan ve teyp arasında yer almalıdır. Bant solunum engellemez sağlanması, hayvan yan transilluminator'de sabitleyin. Yenidoğan boyun hafifçe facialis'ten kolayca görünür olduğunu açık olmalı ve burun baş stabilize etmek için bantlanmış olmalıdır.
5. Kolay görünüm için izin 2.25X bir kafa bandı büyüteç kullanarak, yavaş yavaş damar içine iğne takın. Iğne deri altında görünür kalmalıdır, böylece damar çok yüzeysel.
6. Çözelti hacmi, damar içine yavaşça demleyiniz. Yeşil boya enjeksiyon kolay görüntülenmesini sağlar.
7. Iğne, şırınga ve son derece dar bir iğne deliği nedeniyle kalan çözüm sürülmesi tamamen Medyumu arasında bir gecikme var gibi çıkarmadan önce 15 saniye bekleyin.
8. Iğneyi çıkardıktan sonra, enjeksiyon yerinde kanama geçene kadar baskı uygulamak için gazlı bez kullanın.
9. Sıkıntı belirtileri yenidoğan izleyin. Uygun bir enjeksiyondan sonra, hiçbir belirgin sıkıntı dikkat edilmelidir. Yenidoğan kafesine döndü önce kurtarmak için yaklaşık 5 dakika verilmelidir.
10. Iğne kan hızlı bir şekilde küçük bir delik nedeniyle bu yapışmasına neden olarak, PBS ile enjeksiyonlar arasında iğne / şırınga birimi yıkayın.

3. Temsilcisi sonuçları:

ICV enjeksiyon: beynin farklı zaman noktalarında enjeksiyon sonrası hasat edilen ve başarılı bir enjeksiyon tekniği göstermek için görüntülenebilmekte. Boya enjeksiyon çözüm değilse, o, doğruluğunu kontrol etmek için zor olacakEnjeksiyon. Ventriküller biri doğru enjeksiyon beyin enjekte edilen tarafta tripan mavi dağılımını sağlayacaktır yaklaşık 10-15 dakika sonrası enjeksiyon (Şekil 1B). Sağ ve sol serebral hemisferlerin ve koku ampuller tripan mavi tekdüze dağılım yaklaşık 60 dakika enjeksiyon (Şekil 1C) görülebilir. Bu mavi boya komşu ventrikül yayılmasına izin verecek serebral ventriküllerin bağlantısı nedeniyle. Doğru enjeksiyonları da yaklaşık 12 saat sonrası enjeksiyon (Şekil 1D) içinde rostral santral spinal kanal mavi boya dağılma tarafından görüntülenmiştir olabilir. Yanlış enjeksiyonları hemisferlerin eksikliği mavi renk ile ayırt edilebilir. Bu durumda, iğne derinliği yeterli değildi ve enjeksiyon çözüm muhtemelen deri altında dağıttı. Alternatif bir olasılık iğne böylece ventrikül ve çözüm serebral ventriküllerin altında boşaltılır ötesine geçen, beynin çok derin nüfuz ettiğini.

IV enjeksiyon: Doğru ve verimli temporal / facialis'ten enjeksiyon enjeksiyonu takiben hemen görüntülendi olabilir. Çözüm enjekte edilir, yeşil boya görselleştirme giren ve yüz ven (Şekil 2A) akan bir çözüm sağlar. Ayrıca, fare değişmiş ten rengi aşağıdaki enjeksiyon görülecektir. Yenidoğan normal pembe renk enjeksiyon çözüm yeşil gıda boyası (Şekil 2B) varlığı nedeniyle, yeşil dönüştürülür. Yenidoğan döneminde gözlenen yeşil renk değişimi ölçüde kullanılan boya konsantrasyonu bağlıdır. Enjeksiyon ve basit bir uygulama döneminde görselleştirme, 1:50 seyreltme tavsiye edilir. Bununla birlikte, dramatik bir şekilde değişmiş cilt tonu genellikle yavru annesi tarafından reddedilen ve bu nedenle deneysel işlemleri sırasında, boya veya önemli ölçüde azaltılmış bir konsantrasyon kaldırılması düşünülmelidir. Bir yanlış enjeksiyon, enjeksiyon yerinde deri altında yeşil boya birikimine neden olur. Iğne açılış tam damar içinde takılı değilken oluşur Eksik enjeksiyon, bazı çözüm damar akar ve bazı cilt altında birikir. Bu görülürse damar içine iğne daha takılı olmalıdır.

Şekil 1 PDN2 farelerde başarılı ICV enjeksiyonları gösterilmesi A) ventriküller içine ICV enjeksiyonları kullanılan enjeksiyon siteleri şematik B) PBS tripan mavisi ile sol ventrikül Pup enjekte ICV Beyin, fotoğraf 15 dakika enjeksiyon alınan C ICV gelen) Beyin PBS içinde tripan mavisi ile sol ventrikül Pup enjekte, alınan fotoğraf 60 dakika enjeksiyon. D) Rostral merkezi spinal kanal ICV gösterilir sol ventrikül PBS tripan mavisi ile yavru enjekte, 12 saat sonrası enjeksiyon alınan fotoğraf.

Şekil 2 PDN2 farelerde başarılı IV enjeksiyonlar gösterilmesi A) IV enjeksiyon için kullanılan facialis'ten şematik B) PBS içinde yeşil boya ile Pup enjekte IV un enjekte littermate göre, Foto hemen sonrası enjeksiyon alınır.

Tartışmalar

Araştırma hastalık fare modelleri kullanarak sık sık yenidoğanlarda ilaçlar ya da diğer maddelerin uygulanmasını gerektirir. Bu video gösteren adım adım MSS hedef için kullanılabilir iki tür enjeksiyon stratejileri içeren prosedürler: direkt enjeksiyon, intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyonu kullanan MSS 1) veya temporal / hedef 2) IV enjeksiyon facialis'ten. Bu enjeksiyonların zamanlaması büyük önem taşıyor. ICV enjeksiyonları freehand olduğundan, kafatası nispeten uysal olmalıdır....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Yeşil Gıda Boyası	McCormick	n / a	Filtre edilmesi gerekir
Hamilton Cam Şırınga (100 mcL)	Sigma Aldrick	20702
LuerMxF Konu Stil Beyaz Naylon	Küçük Parçalar, Inc.	VPLF-LC78-1-25
Güzel göstergesi Hipodermik İğneler	Çıtçıt	7111	Boyut: 33 (SWG) x ¼ "(6,35 MM)
Wee Sight transilluminator'de	Respironics	1017920
2.25X Headband Büyütücü	MagEyes	Model No: 5	Bireysel tercihlerinize uygun büyütme