Entrega de agentes terapêuticos Através intracerebroventricular (ICV) e injecção intravenosa (IV) em ratos

Resumo

Este artigo demonstra dois métodos muito diferentes de injecção: 1) para o cérebro (intracerebroventricular) e 2) sistêmica (intravenosa) para introduzir a agentes terapêuticos para o sistema nervoso central de camundongos recém-nascidos.

Resumo

Apesar do papel protetor que barreira hematoencefálica desempenha na proteção do cérebro, que limita o acesso ao sistema nervoso central (SNC), que na maioria das vezes resulta em falha da terapêutica potencial projetado para ^1,2 doenças neurodegenerativas. Doenças neurodegenerativas como a Atrofia Muscular Espinhal (SMA), em que os neurônios motores inferiores são afetados, pode beneficiar muito com a introdução de agentes terapêuticos para o CNS. O objetivo deste vídeo é demonstrar dois paradigmas de injecção diferentes para entregar materiais terapêuticos em ratos neonatal logo após o nascimento. Um desses métodos é injetar diretamente cerebral ventrículos laterais (intracerebroventricular) que resulta na entrega de materiais para o sistema nervoso central através do fluido cerebrospinal ^3,4. O segundo método é uma injeção de veia temporal (intravenosa) que podem introduzir terapêutica diferente para o sistema circulatório, levando a administração sistêmica incluindo os ⁵ CNS. Transdução generalizada do SNC é possível se um vetor viral adequada e sorotipo viral é utilizado. Visualização e utilização da veia temporal para injeção é viável até dia pós-natal 6. No entanto, se o material entregue é objetivo de atingir o sistema nervoso central, essas injeções deve ocorrer enquanto a barreira hematoencefálica é mais permeável devido a seu status imaturos, de preferência antes do dia pós-natal 2. A barreira cérebro-sangue totalmente desenvolvido limita bastante a eficácia da administração intravenosa. Ambos os sistemas de entrega são simples e eficaz uma vez que a aptidão cirúrgica seja alcançado. Eles não requerem qualquer dispositivo cirúrgica extensa e pode ser realizada por uma única pessoa. No entanto, estas técnicas não são sem desafios. A pequena dimensão do pós-parto dia 2 filhotes e os subseqüentes áreas-alvo pequenas podem fazer as injeções de difícil execução e, inicialmente, um desafio para replicar.

Protocolo

1. Injeção intracerebroventricular

1. O primeiro passo é a preparação das soluções estoque de injeção; estas soluções são vetor viral, o DNA do plasmídeo, drogas, e deve ser injetado sob condições estéreis.
2. Misture um título desejado do vetor viral (total mL 5-7) com 0,05% w / v azul de tripano em PBS para a visualização do local da injeção.
3. Solução de DNA plasmidial (5 total de l mL) contém D-(+)-glicose a 20% (w / v) (1 mL), azul de tripano (0,05%) PBS (1 mL), plasmídeo (~ 5 ~ g / L ~ ) (2 ~ L), e 2,5 kDa linear PEI homopolímero (150 mm) (1 ~ L).
4. Imobilizar o PND dois recém-nascidos através de crio-anestesia por 1-2 minutos.
5. A agulha usada para esta injeção é uma micro-litros micropipeta de vidro calibrado esterilizados que é anexado a uma seringa de 3 mL 3ml Hamilton através de um tubo longo.
6. Quebre a ponta da agulha (com espátula) para ajustar para 2 milímetros de penetração no crânio. Coloque a agulha na diagonal no tubo de microcentrífuga contendo a solução de injeção. Carregue a solução de injeção na agulha puxando cuidadosamente o êmbolo da seringa.
7. Após a absorção da solução, desassociar a seringa do tubo; puxar o êmbolo até mais longe e, em seguida, anexar a agulha novamente.
8. Segure a agulha na mão direita entre o polegar eo dedo indicador e coloque a seringa entre os dedos médio e anelar com o êmbolo tocar a palma da mão direita.
9. Segure o rato imobilizado firmemente pela pele atrás da cabeça usando a mão esquerda e coloque em uma luz de fibra ótica para iluminar estruturas anatômicas relevantes que podem ser usados ​​como um guia.
10. Inserir a agulha 2 mm de profundidade, perpendicular à superfície do crânio, em um local de aproximadamente 0,25 mm lateral à sutura sagital e 0,50-0,75 milímetros rostral à sutura coronária neonatal (Figura 1A). Em seguida, empurre o êmbolo usando a palma da mão direita de forma muito lenta e cuidadosamente. Monitor para vasos rompidos ou inchaço facial.
11. Remova a agulha de 15 segundos após a interrupção do movimento de êmbolo para evitar o refluxo.
12. Para recuperar, manter os ratos por 5-10 minutos em um recipiente aquecido até que o movimento ea capacidade de resposta geral é restaurado.

2. Injeção intravenosa através da veia temporal / facial

1. A solução a ser injetada deve ser preparado e suplementadas com corante verde em filtrada diluição 1:100 e injetado em condições estéreis.
2. Anexar um plástico pequeno luer para o fim de uma seringa de vidro de 100 mL Hamilton. Ao luer, anexar a 33 gauge agulha hipodérmica 0,25 polegadas. Assegurar que todas as partes estão bem conectados.
3. Carregar a seringa com o volume a ser injetado, garantindo que não há ar na seringa como a injeção de ar para dentro do navio é letal. Muitas vezes, é útil para pipeta o volume a ser injetado até um pedaço de parafilme. Isto permite a visualização clara de absorção da solução para a seringa.
4. A Visão Transilluminator Wee é usado para visualizar facilmente a veia temporal superficial, ou veia facial, no recém-nascido (Figura 2A). Antes da injecção, segura o recém-nascido para o transiluminador com fita cirúrgica. Gaze deve ser colocado entre o recém-nascido e da fita para evitar que a fita de danificar a pele do animal. Seguro do animal para o transiluminador de lado, garantindo que a fita não impede a respiração. Pescoço do neonato deve ser suavemente girado de modo que a veia facial é facilmente visível eo nariz deve ser gravado para estabilizar a cabeça.
5. Usando uma lupa headband 2.25X, para facilitar a visualização, insira lentamente a agulha na veia. A veia é muito superficial para que a agulha deve permanecer visível sob a pele.
6. Infundir lentamente o volume de solução na veia. O corante verde permite a fácil visualização da injeção.
7. Aguarde 15 segundos antes de remover a agulha como há uma defasagem entre o deprimente totalmente êmbolo da seringa e da expulsão da solução restante devido ao furo de agulha extremamente estreito.
8. Depois de remover a agulha, use uma gaze para aplicar pressão no local da injeção até que a hemorragia cessa.
9. Monitorar o recém-nascido para os sinais de aflição. Após uma injecção adequada, sem angústia manifesta devem ser observadas. O recém-nascido deve ser dado a cerca de 5 minutos para se recuperar antes de ser devolvido para a jaula.
10. Lave a unidade de agulha / seringa com PBS entre injeções de sangue na agulha rapidamente entupi-lo devido a furo pequeno.

3. Resultados representativos:

ICV injecção: O cérebro pode ser colhida em diferentes pontos do tempo pós-injeção e visualizados para demonstrar técnica de injeção de sucesso. Se o corante não é adicionado à solução injectável, será difícil para verificar a precisão do emprojecção. Injeção adequada de um dos ventrículos vai permitir a distribuição do azul tripan no lado do cérebro injetados cerca de 10-15 minutos após a injecção (Figura 1B). A distribuição uniforme de azul de tripano em ambos os hemisférios direito e esquerdo cerebral e os bulbos olfativos serão visíveis cerca de 60 minutos após a injeção (Figura 1C). Isto é devido à conectividade dos ventrículos cerebrais que irá permitir a difusão do corante azul para o ventrículo adjacente. Injeções precisas também pode ser visualizado pela dispersão do corante azul no canal central da coluna rostral aproximadamente dentro de 12 horas pós-injeção (Figura 1D). Injeções imprecisos podem ser distinguidos pela ausência de cor azul em hemisférios cerebrais. Neste caso, a profundidade da agulha não foi suficiente ea solução de injeção, provavelmente, distribuído sob a pele. Uma possibilidade alternativa é que a agulha penetrou muito profundamente no cérebro, assim, passando para além do ventrículo ea solução é esvaziado sob os ventrículos cerebrais.

IV injeção: injeção veia precisa e eficiente temporal / facial podem ser visualizados imediatamente após a injeção. Como a solução é injetada, o corante verde permite a visualização da solução que entram e que flui através da veia facial (Figura 2A). Além disso, a cor da pele alterada do mouse será observado após a injecção. Cor normal do neonato rosa é convertido em verde, devido à presença de corante alimentar verde na solução de injeção (Figura 2B). A extensão da mudança de cor verde observado no recém-nascido é dependente da concentração de corante utilizado. Para visualização simples de injeção e durante um período de prática, uma diluição de 1:50 é recomendado. No entanto, o tom de pele dramaticamente alterada muitas vezes resulta em que o filhote ser rejeitado pela mãe e, portanto, a remoção do corante ou uma concentração significativamente reduzidos deve ser considerada durante os procedimentos experimentais. Uma injeção imprecisas irá resultar no acúmulo de corante verde sob a pele no local da injeção. Injeção incompleta, que ocorre quando a abertura da agulha não está totalmente inserido dentro da veia, é visto quando alguma solução fluxos na veia e alguns se acumula sob a pele. Se isso for constatado, a agulha deve ser inserida mais para o navio.

Figura 1. Demonstração de injeções ICV sucesso em PDN2 camundongos. A esquemática) de locais de injecção utilizado em injeções ICV para os ventrículos. B) Cérebro de ICV Pup injetado com azul de tripano em PBS em ventrículo esquerdo, foto tirada 15 minutos após a injeção. C ) Cérebro do ICV Pup injetado com azul de tripano em PBS no ventrículo esquerdo, foto tirada 60 minutos após a injeção. D) Rostral centrais canal espinhal é mostrado na ICV filhote injetado com azul de tripano em PBS no ventrículo esquerdo, foto tirada 12 horas após a injeção.

Figura 2. Demonstração de injeções de sucesso na IV PDN2 camundongos. A esquemática) da veia facial utilizado para injeções IV. B) IV injetado Pup com corante verde em PBS em comparação com não-injetada ninhada, Foto tirada imediatamente após a injeção.

Discussão

Pesquisa utilizando modelos de ratos da doença muitas vezes exige a administração de medicamentos ou outras substâncias para recém-nascidos. Neste vídeo, demonstramos o passo-a-passo os procedimentos que envolvem dois tipos de estratégias de injeção que pode ser usado para atingir o SNC: 1) injeção direta no sistema nervoso central utilizando injeção intracerebroventricular (ICV), ou 2) injeção IV visando a / temporal veia facial. O timing destas injeções é de grande importância. Desde que as injeçõ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Verde Alimentos Dye	McCormick	n / a	Deve ser filtrado
Hamilton Seringa de vidro (100 mL)	Sigma Aldrick	20702
Tópico LuerMxF Estilo Nylon Branco	Peças pequenas, Inc.	VPLF-LC78-1-25
Agulhas hipodérmicas calibre fino	Popper	7111	Tamanho: 33 (SWG) x ¼ "(6,35 MM)
Transilluminator Visão Wee	Respironics	1017920
2.25X Headband Lupa	MagEyes	Modelo No. 5	Selecione a ampliação para atender as preferências individuais