Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Özet

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Özet

Bu ana doku uyumu kompleksine (pMHC) antijen sunan hücreler (APC) yüzeyinde ifade edilen proteinleri ile bağlı antijenik peptit parçaları tarafından angaje olduğunda sinyalleşme T hücre reseptör (TCR) ile başlatılır. TCR kompleksi ligand bağlama TCRαβ heterodimer oluşur ilişkilendiren CD3 dimerler (εδ ve heterodimerler εγ ve ζζ homodimer) ¹ ile kovalent olmayan. Reseptörünün angajman üzerine, CD3 ζ zincirleri LCK, Src kinaz ailesi tarafından fosforile edilir. Bu daha sonra lck tarafından fosforile ve aktive edilir Syk aile kinaz, Zap70, istihdamına yol açar. Bundan sonra, Zap70 farklı sinyal molekülleri ² büyük bir sayı içeren proksimal sinyalleşme kompleksinin oluşumunu başlatan, bağdaştırıcı proteinler LAT ve SLP76 fosforile.

Kalsiyum ve Ras-bağımlı tra bu kompleks sonunda sonuçların oluşumuoyma yazıyı faktörü aktivasyonu ve T hücre farklılaşması ² yol gen ifadesi programları karmaşık bir dizi sonuçta başlatılması. TCR sinyalleri (ve farklılaşma oluşan durum) antijen potens ve çapraz co-stimulatory/co-inhibitory ile kemokin ve ^3-4 sitokin reseptörleri gibi diğer birçok faktör tarafından modüle edilir. Çeşitli stimülasyon koşullar altında proksimal sinyalizasyon kompleksinin zamansal ve mekansal organizasyon incelenmesi, bu nedenle, TCR sinyal yolu gibi diğer sinyal yolları tarafından düzenlenmesi anlamanın anahtarıdır.

T hücrelerinde plazma membranında TCR tarafından başlatılan sinyalizasyon incelemek için bir çok faydalı modelin sistemi olarak daha önce anlatılan cam ^5-6 destekli lipid bilayers vardır. Onlar yapay APC'ler olarak T hücreleri-hizmet için antijenik pMHC kompleksleri, yapışma, ve eş-uyarıcı moleküller sunmak için kullanılabilir. Görüntüleme yöntemi ile T hücreleri ile etkileşentoplam iç yansıma florasan mikroskobu (TIRFM) kullanılarak çift katlı lipid, biz ^7-8 cam ve hücre yüzeyi arasındaki boşluğun içinde 100 nm için uyarma kısıtlayabilirsiniz. Bu bize resim öncelikle sinyal olaylar plazma membranı meydana gelen sağlar. Biz görüntüleme TCR kompleks proteinler sinyal alımı ilgilenen, biz iki kamera TIRF görüntüleme sistemi tanımlamak neyin H57 antikor floresan Fab etiketlenmiş TCR, (fragman antijen bağlama) parçaları (hibridoma H57-597 arınmış , ATCC, ATCC No: GFP ile etiketlenmiş TCRβ için spesifik olan HB-218), ve sinyal proteinleri, aynı anda ve gerçek zamanlı olarak görüntülenmiştir edilebilir. Bu strateji, T hücrelerinin hem de ve TCR gerçekleştiğini sinyalizasyon olaylar son derece dinamik doğası nedeniyle gereklidir. Bu görüntüleme yöntemi görüntü tek ligandlar ^9-11 yanı sıra aktif reseptörlerine sinyal moleküllerinin alımı ve araştırmacılar izin verdi^12-16 in-situ biyokimya eğitim için mükemmel bir sistemdir.

Protokol

Deney Prosedürü:

1. Amaxa Fare T Hücre Nucleofector kiti kullanılarak Transfeksiyon

Burada Amaxa fare T-Hücresi Nucleofector Kit kullanılarak, GFP ile etiketlenmiş sinyal molekülleri şifreleyen plazmitler ile birlikte saf ifadesi ya da in-vitro aktive T hücreleri primer ya transfeksiyon açıklanmaktadır. Peptit yüklü dalak ZPT kullanarak T hücrelerinin in-vitro olarak ⁷ aktivasyon önce açıklandığı olarak yapılır. Bizim çalışmalarda kullanılan tüm T hücreleri MHC molekülü IE ^k bağlı MM peptid (88-103) tanır ve TCR ifade. Transfeksiyon üretici tavsiyelerine göre temelde yürütülmektedir, ancak biz transfeksiyondan sonra T hücrelerinin canlılığı desteklemek bazı ipuçları sunuyoruz. Canlılığı ve transfeksiyon verim hem saf hücrelere nazaran in-vitro aktive T hücrelerinde çok daha yüksektir.

1. Başlamadan önce, 20 uL eklenmesi ile desteklenmiş T hücresi orta 2 mL hazırlanmasıHer bir transfeksiyon için hem de orta Bileşenler A ve B ve fetal bovin serumu ile 100 uL (% 5) yapılması. Nemlendirilmiş bir 37 içinde bir 12-kuyulu plakalı içinde orta dengeye ° C'de,% 5, en az bir saat için inkübatöre ₂ CO. Alternatif olarak, orta hacimde% 5 serum ve Komponent A hazırlanır ve dondurularak saklanabilir ile desteklenmiş. Bu durumda, alikotları gerekli sayıda çözülme B Bileşeni ekleyin ve dengeleme gerçekleştirin.

- Hücre ölümü ya soğuk veya 7,2 dışında bir pH değerine sahip bir ortamda transfeksiyon sonrasında hücreler yeniden süspansiyon ile sonuçlanacak şekilde ortamın Pre-edilmesiyle, çok önemlidir.

2. Daha sonra, transfeksiyon karışımı hazırlandı. Plazmid 18 Ek 2 uL ve 5μg (konsantrasyon herhangi bir alt 0.5 'den mg / ml) ile Fare T Hücre Nucleofector Çözüm 82 uL birleştirin. Tüp dokunarak ya da mikro pipetle kullanımı ile iyice karıştırılır.

-Bu transfeksiyon için kullanılan yapı, her bir hücre sayısı sabit için plazmit doz titrasyonu ile gerçekleştirmek için önemlidir. Bazı daha büyük yapılar için, daha fazla DNA gerekli olabilir. DNA endotoksinlerin arındırılmış olmalıdır.

3. Bir 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne 5-10.000.000 hücreleri transfer edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 rpm'de santrifüje. Bir aspiratör ile mümkün olduğu kadar çok süpernatan çıkarın.

- Üreticileri daha az 90x g hücreleri iplik tavsiye; bizim durumumuzda, bu hızı 75x g karşılık gelir. Seçilen göreceli merkezkaç kuvveti (RCF) hücre zarı hasar engeller düşük RCF santrifüj gibi pelet, belki de en önemli değişken bir hücre elde etmek.

4. Yavaşça tarafından transfeksiyon karışımı hücre pelletini tekrar askıya alma ve kalan hücreler hiçbir büyük kümeleri vardır kadar yavaşça hücre pelletini pipeting. Bu, genellikle tam hücreler t aspire gerçekleştirilebilirhrough pipet 3-4 kat daha fazla değildir.
5. Bir pipet kullanarak, mevcut hava kabarcığı olduğunu sağlanması, sertifikalı Amaxa küvet içinde süspansiyon, dikkatlice aktarın. Küvet kap.
6. Nucleofector cihazda Nucleofector program X-001 seçin. Nucleofector Küvet Tutucu ve küvet yerleştirin ve seçilen program uygulanır.

- Hücreleri electroporating sonra, hemen ön-kültür ortamına dengelenmiş aktarmak için iyi olur. Üreticileri hücreler 15 dakika daha uzun süre nucleofector ortamda tutulması öneririz.

7. Kaput için küvet ve ön dengelenmiş, tam desteklenen kültür ortamı getirin. Sağlanan plastik pipet kullanılarak, küvetine besiyeri yaklaşık 500 uL ekleyin ve damla damla plakası içinde orta hücre süspansiyonu transfer.
8. Görüntüleme önce 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. Naïve hücreleri incubat vardıred 30 ° C yerine 37 ° C. Bu antijen onların reaktivite korumaya yardımcı olur.

- Inkübasyon üç ila dört saat algılanabilir GFP etiketli proteinlerin ifade T hücreleri için genellikle yeterli olmaktadır. Ifade düzeyi düşük ve aşırı ifade eserler minimize edilmelidir, çünkü bu kez noktada görüntü hücreleri seçti. Belirli bir proteini aşırı ekspresyonu arzu edilirse, bununla birlikte, T hücreleri 4 saat sonra, orta Amaxa çıkarılmalıdır. Bu durum, yine, düşük RCF azından hücreleri pelletting ve 2.000.000 hücre / mL 'lik bir derişimde İnterlökin 2 ile 50 U / mL (IL-2) ile desteklenmiş önceden dengelenmiş T hücre kültürü ortamında resuspending gerçekleştirilir.

2. TIRF Mikroskopi

TIRF mikroskop açıklaması:

1. Genel yapılandırma: Optik bileşenler özgün bir Olympus TIRF modülü ile donatılmış bir Olympus IX71 floresan mikroskop çevresinde inşa edilmişti. Yakında discovered kromatik etkiler bu modül tek bir uyum eyalette farklı dalga boyundaki lazer çizgileri için çakışan kolimasyon ulaşamamasıydı zaman. Bu modül, bu nedenle, farklı uyarma dalga boyları kullanarak aynı anda TIRF görüntüleme için izin vermeyeceğini, ve biz aşağıdaki bölümlerde ayrıntılı olarak tartışacağımız gibi, sistem renklenme etkileri en aza indiren özel bir TIRF aparatı oluşturmak için yola çıktı. Burada anlatılan yöntem 150 X büyütme için geliştirilen, 1.45 Sayısal açıklık (NA) TIRFM objektif (Olympus) ama 60 X büyütme, 1.45 NA sürümleri için olduğu gibi iyi çalışır. Geniş alan aydınlatması için, mikroskop bir metal halide Lambda-XL ışık kaynağı ve uyarma filtresi ile donatılmış bir uyarım filtre çarkı (Sutter Instruments) bağlanır. Objektif ile ilgili örnek sahne otomatik konumlandırma için, mikroskop motorlu XY çeviri, piezo-kontrollü Z evre (ASI) ile donatılmıştır. Görüntüler iki özdeş Qu ile yakalanırAntem elektron çarparak (EM) CCD kameralar (fotometri). Bu kameralardan piksel boyutu piksel başına 0,1 mikron nihai bir çözüm vererek, 150 X TIRF objektif tarafından sunulan büyütme ile çok iyi maçlar. EMCCD kameralar aynı zamanda düşük ekspresyon seviyesi olan GFP transfektanlarının görselleştirmek için hassasiyet sunuyoruz.
2. Lazerler: TIRF aydınlatma, 6 lazer çizgileri (405, 440, 488, 514, 561 ve 640 nm) toplam teslim 5 lazerlerin bir sistem için bir single-mode fiber (Solamere Teknolojileri) olarak birleştirilmiştir. Argon lazer ve 561 nm diyot laser (hatlar 488, 514 ve 561) yoğunluğu kontrolü için bir akusto-optik ayarlanabilir fiber (AOTF) üzerinden yönlendirilir katı hal (DPSS) pompalanan ise diyot lazerlerin yoğunluğu (405, 440 ve 640 nm) kendi güç kaynakları oransal gerilimi tarafından kontrol edilir. AOTF ve diyot lazerlerin güç kaynakları voltaj bir veri toplama kartı (DAC) Metamorph yazılım (moleküler kullanarak kurulu (Ölçüm Computing) aracılığıyla kontrol edilirlar Cihazlar). Argon ve DPSS lazerlerin bu onların daha küçük kiriş çapları nedeniyle yaklaşık% 60 iken diyot lazerler için kaplin randımanı% 30 dur.
3. TIRF modülü: amacıyla, eşzamanlı görüntü TCR ve daha önce açıklandığı gibi ilişkili sinyal moleküllerini, bu chromatically giderilmiştir ve farklı dalga boylarında floresans emisyon satın alırken yeniden düzenlenmesi veya odaklanma gerek duymaksızın TIRF aydınlatma olması gerekliydi. TIRFM önce açıklandığı gibi ¹⁷ üzerinden--objektif aydınlatma kullanılarak elde edildi. Mikroskop için lazer ışık sağlayan fiber optik kablo Z ayarı (Thorlabs) için bir mikrometre odaklı optik raylı tepesine monte bir XY lif tutucu ile donatılmış bir fiber tanıtımına güvenlik altına alınmıştır. TIRF aydınlatma elde etmek için, lazer ışını, iki lens sistemi (L1 (collimating lens) ve Şekil 1'de L2 (odaklama lens)) kullanarak objektif arka odak düzlemi odaklanmıştır böylece bEAM amacı dışında kolime ortaya çıkmaktadır. Bu amaç çıkan ışık ışınları tüm numune düzleme göre aynı açıya sahip olmasını sağlar. Optik lif ucu collimating merceğin odak konumlandırılır. Collimating merceği (Z ekseni) ile ilgili optik ray boyunca hareket ettirerek mikrometre kirişin odak ayarlamak ve XY ayarlaması kolları ile X ve Y pozisyonda ışını hareket etmek mümkündür. Sayesinde 150 X amacı çok küçük arka diyafram, biz TIRF küçük olması gereken arka odak düzlemi üzerinde lazer spot büyüklüğüne ulaşmak için bulundu. Küçük nokta üretmek için gerekli odak ulaşmak için, kısa bir odak uzunluğu objektifler (Keir Neumann, kişisel iletişim) gerekli idi; dolayısıyla, doğrudan önceki dikroik küp yerleştirilmiştir yaklaşık 108 mm odak uzunluğuna sahip bir odaklama lens kullanılır objektif. Collimating objektif yakın TI getirilen demeti splitter yerleştirildiRF aydınlatma. Istenmeyen renk etkileri en aza indirmek için, collimating ve lens sistemi (JML Optik) odaklanarak hem de yansıma önleyici kaplama ile (farklı refraktif endeksleri malzemelerden yapılmış eritme iki lens elemanları tarafından yapılan chromatically düzeltilmiş lens) akromatik ikilileri kullanılır. Odak ışın geri diyafram ortasına konumlandırılmış zaman objektif dışarı kolime çıkar ve tavana sıkı bir nokta oluşturmak gerektiğini kontrol ederek kontrol edilebilir. Odaklanmış noktanın konumunu daha sonra ışın geniş açılarda görüntü düzlemi üzerinde birleşmemiz neden diyafram (Y yönünde) kenarına doğru taşınır ve sonunda, toplam iç yansıma için kritik açı elde edilir. Bu optik bileşenler kullanarak, aynı hizada az 442-640 nm tüm dalga boyları için eşzamanlı kolimasyon elde etti. Tek bir optik hizalama, bu nedenle, bize, çoklu dalga boyları üzerinden aynı anda TIRFM gerçekleştirmek için izin verdi.
4. Çift kamera apparatus: iki farklı florofor kaynaklanan farklı floresans emisyon eşzamanlı edinimi dikroik ayna kullanımı (Şekil-2) iki dalga boyu aralıkları içine emisyon böler çift kamera sistemi kurarak elde edildi. Yayılan ışık mikroskobunun sağ tarafında port dışarı amacı ile yansıtılır. En hedefleri sonsuz bir tüp objektif Görüntüyü odaklamak için gereklidir, (sonsuz oluşmuş görüntüleri ile) düzeltildi. Olduğundan Aynı anda iki emisyon dalga boylarında işlemek için, sağ tarafta port tüpü objektif kaldırıldı. C-montaj konuları (Sutter Instruments) içeren özelleştirilmiş adaptörü takılı ve dikroik ayna tutucu (Edmund Optik) bağlanmıştır. TCR (Alexa546, Alexa647, vs) etiketlemek için kullanılan organik boyaların olduğu gelen GFP emisyon ayırmak Dikroik aynalar bu tutucu monte edildi. Bu modül bir tüp lens kabı, bir emisyon tutucu filtre ve uzatma tüpleri ile ışık yolları hem de izledi.tüp lens (TL1 ve TL2 (Şekil 2)) 180 mm odak uzaklığına sahip. EM CCD kameralar giden uzatma tüpleri boşluklar kaçak ışık gelen kameralar korumak için siyah kağıt ile örtülmüştür. Iki kanal arasında uyum sağlamak için, kameraların iki özel XYZ çeviri standları (Holmarc Ürünler) monte edildi.

Bunun altında iki kanal aynı anda görüntüleme için mikroskop hizalamak nasıl açıklar. Ilgili adımlar, TIRF aydınlatma hizalayarak lazer gücünü ayarlayarak ve alt çözünürlük mikro kullanarak iki çıkış görüntüleri adeta birleşmiş durumda.

1. Başlamadan önce, mikroskobun bütün bileşenleri üzerinde güçlendiriliyor. Bilgisayar ve Yazılım sonra başlatılan ve tüm donanım bileşenlerinin yazılım tarafından tanınır sağlanır.
2. Bir ko-Lokalizasyon standart olarak kullanım için, 2 mL PBS içine alt-çözünürlük (0.2 um) Fluoresbrite Çok-flüoresan Mikrokürelerin 1 ul seyreltilmiş ve mikrosfer 0.25 ml ilaveBir Lab-Tek II 8-iyi odacıklı coverglass sistemi (Nunc) her kuyuya süspansiyon. Amaç yukarıda platforma kamara slayt sistemi yerleştirin. Cama emilirler Boncuk sonra odak haline getirilir.
3. XYZ lif lansman Y hizalama kullanarak, lazer ışınının konumu objektif arka diyafram merkezine taşınır. Amacı cam düzlemi odak olduğu konumda olduğunda bunu yapmak için önemlidir. Işını kolime değilse, Z mikrometre tam kolimasyon elde etmek için ayarlanır. Kolimasyon deneyinde kullanılacak her lazer hatları için tek tek test edilir. Bu aşamada, her bir hat için lazer güç bir lazer güç sayacı kullanılarak ölçülür ve her kanalda 20-30 μW 'e ayarlanır.

-T hücreleri lazer radyasyonu karşı aşırı duyarlıdır ve aydınlatma 50 μW toplam sınırlıdır.

4. Boncuk Görüntüleri TIRF illuminat kullanılarak elde edilencanlı modda iyon. Böylece ışın objektif optik eksen yaklaşımları 90 derece saygı ile açı kadar tavan uzaklaşmakta başladığı fiber başlatılması üzerine Y-hizalama mikrometre çevirin. Sonunda, TIR için kritik açı ulaşıldığında, lazer ışığı artık objektif çıkılacak. TIRF hizalama sonra coverglass düzlemi boyunca ve aşağı yukarı odaklanarak tarafından değerlendirilecektir. Çözelti içinde yüzen boncuklar görüntülenmiştir olabilir, bu durumda amacı, normal ihtiyaçlarına göre ışın açısı daha da arttığı. Doğru TIRF hizalama anda, sadece bir optik düzlem (yani, coverslip için adsorbe sadece boncuk) odak noktası olacaktır. Görüntüleme T-hücreleri, bir yüzey üzerine yayılmış bir yüzey boya ile boyanmış olduğunda TIRF bir uyum ince testi uygulanabilir. (Madde 3.4 bakınız).
5. TIRF aydınlatma elde edildikten sonra, iki kanal birbirine göre hizalanabilir. Boncuk odaklanın ve i konumu karşılaştırmakgörüntülerde dentifiable özellikler her iki kanal da üretti. Bir kamera stand X ve Y mikrometre vida kullanarak, mümkün olduğunca yakın olarak içine boncuk göreli konumunu getirmek. Her iki kanal görüntüleri kaydedin. Bu görüntüler iki kanal hizalamak için bir ko-Lokalizasyon standart olarak kullanılacaktır.
6. Makinesi ayrıca, diğeri ile ilgili olarak parfocal böylece hizalanmış gerekir. Bu, 100 nm ile Z yönde birbirlerinden ayrılırlar alt-çözünürlüğü boncuklar görüntüleri bir dizi elde elde edilir. Boncuklar için maksimum yoğunluğu piksel kameralar için aynı düzlemde yer alıyorsa, o zaman parfocal vardır.

3. Görüntüleme

Mikroskop kurulduktan sonra, bir sonraki görev daha önce ⁶ açıklanan ve sonra etkileşim transfekte T hücrelerinin TIRFM gerçekleştirmek olarak antijen ve adezyon molekülleri sunan cam desteklenen lipid bilayers içeren akış odalarına hazırlamaksubstrat. Yayımlanmış iki tabakalı protokolü ^5-6 akış odası monte edildikten sonra lipozomlar coverglass üzerinde 20 dakika süreyle inkübe edildi olmayan olması dışında yayınlanan izledi. Bunun yerine, HBS-BSA tampon hemen montaj sonrası akış hücresi aktı edildi.

1. Ni-NTA lipit içeren cam kapak slip üzerinde oluşan düzlemsel lipid bilayers bir akış odası birleştirin. Adezyon molekülü, ICAM-1 (100 moleküller / ² um) ve peptid-MHC kompleksleri, MM yüklenen IE ^k (5-10 moleküller / ² um), bunların histidin etiketler yoluyla çift-katlı dahil edilmiştir. Kostimülatör molekül CD80 bir GPI çapa (100 molekülleri / ² um) kullanılarak eklenir.
2. Mikroskobun sahnede akış hücresi yerleştirin ve stabilize. Sıcaklığı kontrol etmek için akış hücresi üzerinde eleman ısıtma verilen üretici takın. Bir çift-katlı üzerinde nesnel yerleştirin ve odaklanmak için çift katlı uçağı getiriyoruz. Amacın ısıtma ve akış etkinleştirin37, oda sıcaklığı stabilize etmek için hücre ° C.
3. Transfekte T hücreleri 80x g hızında inkübasyondan 4 saat sonra topak haline olan HBS-BSA tamponu içinde yeniden süspansiyon haline ve 10 ug / mL H57 Fab veya 20 mg / H57 tek zincirli değişken fragmanı (scFv) ile mL ile desteklenmiş TCR etiketleyin. Hücreleri daha sonra akım hücrelerinde enjekte edilir. Görüntüleme yüksek ayrılma sabitesinin nedeniyle Fab veya scFv sürekli varlığında gerçekleştirilir. TIRF alan çok ince olduğu ortamda varlıklarını önemli ölçüde arka artmaz.
4. Bu çift kanal canlı edinimi transfekte hücreler ararken yardımcı olur TCR ve GFP kanalları canlı önizleme gösterir şekilde Görüntüleme koşulları ayarlanır. TIRF aydınlatma herhangi bir yan membran boyanması algılamak için cam uçağı odaklanarak ile teyit edilir. Lateral membranlarda odak gelir yoksa o TIRF uyumu iyidir. Transfekte hücreler daha sonra vid üretmek için bir veya bir görüntü sırayla görüntülenmesi işlemidireos.

4. Görüntü İşleme ve Veri Analizi

Yazılım tek bir kare içinde iki kamera görüntüleri çıktı. Her kamera çıkışı 512 x 512 piksel; dolayısıyla, çıkış görüntü boyutu 1024 x 512 piksel. Görüntüler ilk iki kamera karşılık tek kare bölünebilir gerekir. Iki kanaldan alt çözünürlük boncuk imgeleri üst üste binmiş ve uyum parametreleri belirlenir. Sistemimizde özel bir özelliği, diğer ile ilgili olarak tek bir kanalın bir 1 derece dönüş olan (bakınız Şekil 3). Bu dönme en olası kaynağı kamera standları olduğunu. Bu döndürme sonra, X ve Y de nispi doğrusal dönüşümler mükemmel birbirlerine göre boncuklar hizalamak için yapılması gerekir. Boncuk Görüntüler iki kanal hizalamak için kesin parametrelerini belirlemek için her deneyde elde edilir. Bu doğrusal ve dönme dönüşümleri sonra tüm uygulanırdaha sonra görüntüleri ve onlar bölütleme algoritmaları ve co-yerelleştirme analizi tabidir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Burada açıklanan sistem plazma membranında herhangi bir reseptör alt-sinyalleşme incelemek için adapte edilebilir. Sinyalizasyon TCR microclusters adlandırılan optik çözülmesi kümeler halinde ya da son ¹⁸ tarif endozomlar oluşur çünkü TCR sinyalizasyon eğitim özellikle bilgilendirici. Sinyalizasyon reseptörlerinin alt çözünürlükte kümeler halinde veya un-kümelenmiş reseptörleri oluştuysa ek deney verileri yorumlamak için yapılması gerekir. Önce de belirtildiği gibi, TCR kompleksinin CD3 zincirleri peptid-MHC kompleksleriyle TCR angajman üzerine lck Src ailesi kinaz tarafından fosforile uğrarlar. Fosforile CD3ζ zinciri ardından Syk aile kinaz Zap70 acemi. Za istihdamı görselleştirmep70 ve böylece CD3ζ zincirinin fosforilasyon durumuna bildirir. TCR stimülasyon gücü TCR temas artıkları az mutasyona uğramış peptidler kullanılarak değiştirilebilir. Bu gibi peptitlerin değiştirilmiş peptid ligandları (APL) olarak adlandırılır. Temsili bir deney daha az güçlü fakat peptid T102L CD3ζ zinciri bu durumda fosforile olmadığını göstermek, TCR microclusters için Zap70 işe başarısız ederken agonist peptidler sağlam TCR microclusters üzere Zap70 acemi Şekil 4 'de gösterilmiştir. Biz sadece kolayca TIRFM tarafından tespit edildi TCR kümelere Zap70 istihdamına gözlemlemek zorunda çünkü bu sonuca çizebilirsiniz. Otomatik bir bölütleme algoritması hücre başına Zap70 microclusters sayısını saymak için kullanıldı. Ayrıca TCR ile ilişkili Zap70 floresans eş zamanlı görüntü olup ek film de gösterilmiştir. Lamelipodium dinamik yapısını unutmayın.

Şekil 1. Resim ve özel TIRF lansman şematik. Panel A mikroskop yüklü olarak TIRF lansman fotoğrafını gösterir ve Panel B ışık yolu gösteren TIRF lansmanı şematik olduğunu. Şematik ve toplayıcı mercek, ışın ayırıcı, dikroik küp ve TIRF objektif yüklü X, Y ve Z ayarlamaları, collimating objektif L1 ve L2 odaklı lens ile, fiber lansman konumunu gösteren resim. Inset dikroik küp yüklü odaklı lens gösterir.

Şekil 2. Görüntü ve iki kamera sisteminin şematik. Panel bir mikroskop bağlı olarak iki kamera sisteminin fotoğrafını göstermektedir, ve Panel B aynı şematik bir olup. Şematik ve görüntü nesnel konumu, ayna, çift, tüp lensler TL1 ve TL2, emisyon filtreler F1 ve F2, t üzerinde iki adet kamera, C1 ve C2 göstermekmirasçı kendi X, Y ve Z ayarlamaları ile duruyor.

Şekil 3. Iki kanal hizalamak için alt çözünürlüklü boncuk kullanın. Paneller A ve önce alt çözünürlüklü boncuk B gösterisi bindirmeleri (Panel A) ve sonrası (Panel B) uyum. Panel A kanalı biri diğerine göre döndürülür olduğunu gösterir. Paneller C ve D görüntülerin bir alt bölümü olan A ve B Panosu E işleme olmadan bir hücre iki kanal kaplama görüntü gösterir. Panel D kullanılan Hizalama parametreleri iki kanaldan lamelipodium mükemmel paneli F ve tüm paneller için panel E. Ölçek çubuğu 4 mikron hizalandığını nasıl paneli F. Bildirimi gösterilen görüntüyü uygulanmıştır.

Şekil 4. Farklı APL yanıt olarak Zap70 alım TCR microclusters üzere. In vitro aktive T hücreleri GFP ile kaynaşmış bir plazmid kodlama Zap70 transfekte edildi ve 6 moleküller / um peptid ² içeren cam destekli Ni-NTA bilayers üzerinde inkübe edildi His-etiketli-IE ^k, 100 molekülleri / Alexa647 konjuge His-etiketlenen mikron ² ICAM-yüklenir 1 ve 100 moleküller / GPI-CD80 ile bağlantılı um ^2. Yüklendiğinde peptidler ilave olarak gösterilir. ICAM-1 100 moleküller / um Alexa-647 konjuge His-etiketli ICAM-1 ve ² bilayers içeren bir hücre ifade eder. Çift kanal simultane satın TIRF mikroskopi TCR leke Alexa546 konjuge H57 Fab parçası (engellenmeyen) sürekli varlığında gerçekleştirildi. Hücreler iki tabaka ile ilk temastan sonra bir saat kadar görüntülendi. Hücre başına Zap70 kümelerin Numaraları otomatik bir küme sayma yazılımı kullanılarak analiz edildi. En az 40 hücreleri, her durumda analiz edildi. Tüm görüntüler için Ölçek çubuğu 2 mikron.

92/3892fig5.jpg "/>
Şekil 5. Kameraların iki farklı türleri kullanarak iki kamera sisteminin uyumlaştırılması. Bu panel, alt-çözünürlüklü boncuk hizalanmış bindirme iki kamera farklı piksel boyutları (: 2x2 binning ve Red at görüntülendi 6.45 mikron piksel boyutu: hayır binning at görüntülendi 16 mikron piksel boyutu Yeşil) sahip iki kamera sistemi görüntülendi gösterir. Inset alan merkezi kare kutusunun büyütülmüş görünümdür. Ölçek çubuğu 5 mm.

Ek Film. Agonist peptid yanıt olarak Zap70 alım TCR microclusters için. In-vitro aktive T hücreleri GFP ile kaynaşmış bir plazmid kodlama Zap70 ile transfekte edildi ve 6 moleküller / um peptid ² içeren cam destekli Ni-NTA bilayers üzerinde inkübe edildi His-etiketli-IE ^k, 100 moleküller / um Alexa647 ² yüklenen konjuge GPI-demirlemiş CD80 ve ICAM-1 ve 100 moleküller / um ² His-etiketli. Çift kanal eş zamanlı bircquisition TIRF mikroskopi TCR leke Alexa546 konjuge H57 Fab parçası (engellenmeyen) sürekli varlığında gerçekleştirilmiştir. Transfekte hücre alanında defalarca kare başına 10 saniyelik bir zaman çözünürlüğü ile 40 kez görüntülendi. Ölçek çubuğu 2 mikron. ek filmi görmek için buraya tıklayın .

Tartışmalar

Biz burada TIRFM ve yapay ZPT gibi cam desteklenen lipid bilayers kullanarak antijen spesifik primer fare T hücrelerinde sinyal okumak için bir sistem açıklar. Tekniği başarıyla bu hücrelerde GFP tagged proteinleri dayanır. T hücrelerine transferiyle her zaman zor bir iştir. Tipik olarak, retrovirüslerin ya Lentivirüs kullanılarak elektroporasyon ya da gen aktarımının kullanılır. Bir teknik diğerinden üstün değildir, her ikisi kendi sınırlamaları ve avantajları var. 1) Bu retrovirüslerin ancak Lentivirüs için gerekli olduğu hücrelerinin aktif bölünmesi edilmesi gerekmemektedir, ve 2) ifade seviyesini hücreleri görüntüleme önce inkübe edilir zamanda değişen kontrol edilebilir: bu elektroporasyon aşağıdaki avantajlara sahiptir bulmak. Büyük dezavantajı biz çok zor primer hücrelerde boyutu büyük olan proteinlerin ifade bulmak olmasıdır. Biz elektroporasyon sonra bize çok iyi bir hücre canlılığı veren bir yöntem sundu. Sonuç olarak, bu applicab olduğusiRNA aracılı gen susturulması elde etmek için bunu kullanmaya le.

Biz de burada chromatically düzeltilir ve farklı dalga boylarında için ayrı hizalama gerektirmez özelleştirilmiş bir iki kanal aynı anda satın TIRF mikroskop açıklar. Bu yetenekleri, ancak, ticari olarak temin edilebilir. Sistemimiz TIRF mikroskopi alanında uzmanlar tarafından yayınlanan ve ticari alternatiflerine göre çok daha ucuzdur ilkelerine dayanmaktadır. Bizim tasarım Olası eleştirilerden biri, biz farklı uyarma dalga boyları için geliş aynı açı ile olmasıdır. Bu farklı uyarma dalga boyları için farklı bir TIRF penetrasyon derinliği neden olacaktır. Biz fani bir dalga katlanarak çürüyen alan ve TIRF alan derinliğini dalga doğrusal bir fonksiyonu olduğu için bu etkiler küçük olduğunu düşünüyorum. Cam yüzeye yakın florofor iki dalga boyları arasında laser yoğunluklarındaki fark yaşayacaksınız. Pe yakın florofor içinyonunun derinliği, yoğunluğu farkı iki dalga boyu 488 ve 561 nm için iki dalga boyu 488 ve 640 nm ve 1.15 kat için 1,3 misli olacaktır. Aynı sistemi TIRF aydınlatma kullanan süper çözünürlük teknikleri ile bağlantılı olarak da kullanılabilir.

Ayrıca özel dahili bir iki kamera sistemi tarif var. TIRF sistemi gibi benzer aparatları, aynı zamanda, ticari olarak mevcuttur. Sistemimiz dalga boylarında farklı kombinasyonları ile kullanımına izin veren, filtre ve dichroics değiştirmek için esneklik sunar. Bizim sistemin dezavantajı iki görüntü uyum için yapılması gereken dönme bir derecesidir. Bu sorun piezo tahrik ve uyum dönme dereceleri sunarlar kamera standlar ile çözülebilir. Biz de başarıyla kameralar farklı olduğunu ve değişik piksel boyutlarında sahip olduğu, bu mikroskop iki kamera sistemi hayata geçirdik. Tek tek kanalda duyarlılık ve büyük bir dy gerekirse, bu tür bir sistem yararlı olacaktırBaşka bir aralık içinde pi ile, her ikisi de aynı kamera nadiren mevcuttur. Biz bize 16 mikron piksel boyutu vardır fotometri Quant-EM kamera ile 12.9 mikron bir etkin piksel boyutu veren 2x2 binning de fotometri HQ-2 kamera kullanıldı. A 180 mm odak uzunluğu tüp lens Quant-EM için kullanılan ve 145 mm odak uzaklığı tüp lens HQ-2 kamera kullanıldı. HQ-2 Metamorph yazılım ve Quant-EM dış tetik modu ayrı bir bilgisayarda mikro yöneticisi yazılımı ile kontrol edildi kullanılarak kontrol edildi. Dış tetik Metamorph ve configure aydınlatma ayarlarında ek bir deklanşör olarak uygulanmıştır ölçüm hesaplama DAC kurulu, bir dijital çıkış kullanarak Quant-EM kamera sağlanmıştır. Tüp mercek uzunluklan oranı etkili bir piksel boyutu oranı ile eşleşir. Bir temsili hizalama Şekil 5 de gösterilmiştir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fare T hücreleri için Amaxa Nucleofector Kit	Lonza A.Ş.	VPA-1006
PureLink HiPure Plazmid Midiprep Kiti	Yaşam Teknolojileri	K2100-05	Endotoksin serbest DNA preparatlarıyla için
Amaxa Nucleofector Aygıt	Lonza A.Ş.	AAD-1001
Rekombinant Mürin IL-2	Peprotech A.Ş.	212-12
Fluoresbrite Multifluorescent Mikroküreler 0.20μm	Polysciences, Inc	24050-5
Lab-Tek II 8-iyi odacıklı coverglass	Thermo Scientific, Nunc	155409