Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

Özet

MRNA üzerindeki translasyonel duraklama siteleri tanımlamak için bir teknik tarif edilmiştir. Bu prosedür bir denatüre jel elektroforez ile olgunlaşmamış zincirlerinin boyutu analizi ve ardından bir hedef mRNA in vitro için, içerisinde sırasında ribozom üzerinde biriken olgunlaşmamış polipeptidlerin izolasyonu dayanmaktadır.

Özet

Translasyonel uzama oranı non-üniform. ikincil yapı, kodon kullanım mRNA ve ^{1 görmek} ilişkili proteinlerin ^{inceleme için} mesaj üzerinde ribozom hareketini değiştirebilir mRNA'ya. Ancak, günümüzde yaygın eşanlamlı kodon kullanımı düzgün olmayan translasyonal uzama oranları ¹ birincil nedeni olduğu kabul edilmektedir. Eşanlamlıdır kodonlar aynı frekansı ile kullanılmaz. Bir önyargı diğerleri ² daha sık kullanılan bazı kodonlar ile eşanlamlı kodon kullanımı var. Kodon önyargı organizma gibi ^2,3 spesifik bir dokudur. Dahası, kodon kullanımına sıklığı soydaş tRNAs ⁴ konsantrasyonları ile doğrudan orantılıdır. Böylece, sık kullanılan bir kodon daha sık bir kodon hızlı bir seyrek bir daha tercüme edilecektir ima ilgili tRNAs yüksek sayıda sahip olacak. Böylece, nadir kodonlar (potansiyel duraklama siteleri) zenginleştirilmiş mRNA üzerindeki bölgelerde kural olarak Messa üzerinde ribozom hareketi yavaşlatacakilgili boyutları ^5-8 doğmakta peptidlerin ge ve neden birikimi. Bu duraklama siteler protein ekspresyonu fonksiyonel etkisi olabilir, mRNA stabilitesi ve ^{inceleme için} protein katlanması ^{9'a bakın.} Gerçekten de, bu tür duraklama siteleri hafifletilmesi mRNA üzerinde ribozom hareketi değiştirebilir ve daha sonra co-translasyon (in vivo) protein katlama ^1,7,10,11 etkinliğini etkileyebilir olduğu gösterilmiştir. Sonuçta o translasyonel uzama sırasında mRNA boyunca ribozomların hareketine kodon kullanım / tRNA içerik etkisi içine kapsamlı bilgiler edinmek için gerekli olan protein sentezinin sürecine birleşen hücre, in vivo protein katlanması süreci anlamak için .

Burada çeşitli hücre içermeyen sistemlerde ^6-8 tercüme belirli bir mRNA için büyük çevirisi duraklama yerleri bulmak için kullanılabilecek basit bir teknik açıklar. Bu prosedür, olgunlaşmamış polipeptidlerin accumulati izolasyonu dayanmaktadırbir hedef mRNA in vitro çeviri sırasında ribozomlar üzerinde ng. Mantığı düşük frekanslı kodonlar az, karşılık gelen boyutlarda olgunlaşmamış peptid artan miktarlarda ribozom sonuçların kalma süresi de artar. In vitro transkripsiyonu mRNA olarak radyoaktif olarak etiketlenmiş amino asitlerin varlığında in vitro translasyon reaksiyonlar için kullanılan olmasıdır doğmakta olan zincirlerinin algılanmasına izin vermek için. Ribozom bağlı olgunlaşmamış bir polipeptid kompleksleri izole etmek için, reaksiyon için santrifüjleme ardından% 30 gliserol çözeltisi üstüne katmanlı edilir. Polysomal pelet yılında Doğan polipeptidlerin daha ribonükleaz A ile tedavi edilen ve SDS PAGE ile çözümlenir. Bu teknik potansiyel olarak herhangi bir protein için kullanılan ve ribozom mRNA boyunca hareket ve büyük duraklama sitelerin tespiti analizi sağlar edilebilir. Ayrıca, bu protokol ribozom hareketi değiştirebilir ve böylece potansiyel olarak da inci değiştirebilir faktörleri ve koşulları incelemek için adapte edilebilire fonksiyon / proteinin konformasyon.

Protokol

1. Şablon DNA hazırlanması ve in vitro transkripsiyonu sonucunda

1. Ilgi genindeki T7 ve / veya örneğin SP6 transkripsiyonel promotörü altında klonlanmış edilir.
2. In vitro transkripsiyonu sonucunda için DNA ORF durdur kodonu ve / veya mRNA 3 'end of aşağı kesme uygun sınırlama enzimi ile lineerleştirilebilir edilir. Bir agaroz jel elektroforez ile ilgili sınırlama sindirim ürünü çalıştırarak plazmid DNA tam doğrusallaştırma doğrulamak için gereklidir.
3. Lineerize plazmid vitro transkripsiyon reaksiyonunda kullanılmıştır. Şablon DNA, farklı konsantrasyonda in vitro transkripsiyonu sonucunda için gereken optimal DNA konsantrasyonu tespit etmek test edilebilir. Genellikle, Ambion Kullanıcı MEGAscript Yüksek verim Transkripsiyon Seti (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) ile, 1 mikrogram lineerleştirilebilir DNA mRNA 40-60 mikrogram verir. In vitro transkripsiyon olarak üreticinin talimat (Ambion / Life Technologies, Grand Islan takip yapılırd, NY).
4. In vitro transkripsiyonu sonucunda takiben mRNA üreticinin talimat (Ambion en MEGAscript yüksek verim Transkripsiyon Kit) uygun olarak lityum klorürle çökeltme ile arıtılır.
5. mRNA bütünlüğünü daha da akrilamid veya agaroz jel elektroforez tarafından doğrulanır.

2. In vitro Hücre Bedava Çeviri

Aşağıdaki adımları izleyin R abbit R eticulocyte Lysate, RRL (Promega, Madison, WI) kullanılarak in vitro çeviri için:

1. In vitro çeviri reaksiyon aşağıdaki üreticinin talimat 100 ul hazırlayın. Kısaca, nükleaz serbest su içinde 2 ul amino asit karışımı eksi metiyonin (1 mM), RNaz önleyici (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), radyoaktif 20 μCi ^{[35S]-Metionin} (MP Biomedicals 10 birim, ekleme ) OH, Solon, tavşan Retikülosit Lizat (Promega, Madison, WI) ve 70 ul.
2. Th inkübeSıcak için önceden reaksiyon için 5 dakika süreyle 30 ° C'de e reaksiyon. 5 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe çevirisi ve reaksiyon için mRNA 2 ug ekleyin.
3. Buz üzerinde çeviri tepki koyarak reaksiyonu durdurun.

3. In vitro Çeviri Reaksiyonunda gelen Doğan Polipeptitler İzolasyonu

1. Ribozom (polysome) bağlı olgunlaşmamış bir polipeptid izole etmek için, reaksiyon için 100 mM KCI, 10 mM ₂ MgCI içeren 10 mM Tris-HCl tamponu, pH 7.6 içinde% 30 gliserol 4.5 ml üst katmanlar, 100,000 ve X g'de santrifüje tabi tutulur 4 ° C de 1 saat süre ile, bir TLA-110 rotor (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA) içinde
2. Süpernatant daha dikkatli bir şekilde çıkarılır.
3. Olgunlaşmamış polipeptidlerin içeren polysomal pelet, 0.5 mg / ml bir ribonükleaz (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), ve daha inkübe içeren, 1 mM Tris-HCl tampon pH 7.6 küçük bir hacim (10-15 ul) içinde tekrar süspanse edilir 37, 30 dakika ° C. Sıraylapeptidil-tRNA ester bağı hidroliz geliştirmek için, NaOH 10 mM nihai bir konsantrasyona ilave edildi ve inkübasyon 30 dakika daha devam edilir.

In vitro çeviri reaksiyon mRNA olmadan monte edilmiş ve aynı koşullarda (tarif edildiği gibi doğmakta olan peptidler izolasyonu takiben) altında yapılan büyük bir kontrol olarak hizmet verecek. Yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile ekstre tabi önce puromycin ile için reaksiyon (lar) tedavisinde ek bir kontrol olarak hizmet edebilir.

4. Tris-trişin SDS PAGE üzerine Doğan ekleşimlerin çözümleniyor

1. Izole doğmakta olan polipeptidler giderilmiş ve Tris-trişin SDS-PAGE analiz edilir. Materyalin miktarı protein etiketleme, protein çevirisi ve diğerleri parametreleri üzerindeki etkinliğini verimi üzerinde olacak bağımlı jel üzerinde, yüklenen dikkat ediniz. Yüklenen materyalin miktarı bes izin verecek şekilde ampirik olarak ayarlanması gerekmektedirt görselleştirme ve bireysel doğmakta olan polipeptid zincirlerinin ayrılması.
2. Elektroforez jeller sabitlenir sonra, vakum jel kullanılarak Dyer ve otoradyografi tabi kurutuldu. Doğmakta olan polipeptidlerin dağılımı phosphoimaging kullanarak gözlenmiştir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Sığır Gamma-B kristalen yanı E. olduğu gibi Tavşan Retikülosit Lysate tercüme edildi coli S30 Ekstrakt Sistemi (Promega, Madison, WI) olgunlaşmamış bir polipeptid zincirleri izole edilmesi, ardından. Şekil 1 ribozom bağlı olgunlaşmamış zincirlerinin izolasyonu dahil adımları tasvir etmektedir. TRNAs (dolayı organizmalar arasında kodon yanlılığı farklılıklar önemli ölçüde memeli farklı (RRL) ve prokaryotik (E. coli) sistemleri olarak da bilinir) çevirisi yani repertuarı çevre değişiyor eğer Bu çalışmada amaç, test oldu mRNA üzerinde ribozom hareketi değiştirmek ve çeviri duraklama sitelerin dağılımı etkileyebilir.Altered ribozom hareketi çeviri yanı sıra onların göreceli yoğunlukları sırasında toplanan olgunlaşmamış polipeptidlerin boyutlarda dağılımında değişikliklere yol açacaktır. Bantların Bağıl yoğunluğu duraklama süresini yansıtmaktadır. Doğmakta olan polipeptidlerin izole edilmiş ve% 16.5 T,% 6 C Tris-trişin SDS PAGE (Şekil 2) çözüldü. Gamma-B kristalen bir 20 kDa bir proteindir. RRL ve E. içinde, özdeş olmayan uzunlukları ve yoğunlukları doğmakta polipeptidlerin gözlem coli sistemleri, bu iki sistemlerinde mRNA boyunca ribozom hareketi için farklı kinetik aşağıdaki olduğunu gösterir. Örneğin, E. 17.7 kDa arasında belirgin bir bant gözlenen Bu E'de çevrildiğinde mRNA 3'-ucu bölgesi (gama B kristalen bir kodlama C-ucu bölgesi), ek bir duraklama translasyon sitesi olduğunu düşündürmektedir RRL sisteminde coli lizat değil, coli sistemi. Biz unutmayın Gamma-B kristalen limanlar tandem Arg kodonlar (AGG ₁Memeli sistemlerinde sık sık, fakat E'de çok nadir ve yavaşça çevrilmelidir bilinmektedir ve 53 AGA ₁₅₄₎ coli. E. biriken bir roman doğmakta olan peptid coli sistemi (~ 17.7 kDa Şekil 2.2) muhtemelen bu tandem nadir kodonlar az duraklatarak Ribozom neden olur. Hiçbir bantları mRNA yokluğunda (Şekil 2.3) gözlendi ve bu puromycin tedavi polysomes (Şekil 2.3) den doğmakta zincirlerinin en kaldırır olabilir unutmayın. Puromycin (> 15 dk) ile uzun süreli tedavi tüm doğmakta olan zincirleri (veriler gösterilmemiştir) kaldırır. Bu gözlenen polipeptid ürünler yerine polysomes ile cosedimenting mRNPs daha ribozom ilgili doğmakta olan zincirleri, olduğunu onaylar.

Yukarıda bahsedildiği gibi, kodon önyargı organizmanın gibi doku özgüdür. Temsili örnek, burada açıklandığı şekilde tRNAs / kodon çeviri yani repertuarı ortamı değiştirerek gösterirönyargı mRNA boyunca ribozomunun değiştirilmiş bir harekete neden olabilir. Besbelli, bu basit tekniği sadece mRNA boyunca öteleme duraklama sitelerinin kimlik izin veremeyiz, ama aynı zamanda farklı sistemler arasında çeviri duraklama sitelerin hızlı karşılaştırma izin verir.

Şekil 1.. Şematik ribozom bağlı olgunlaşmamış polipeptidlerin yalıtılmasının yer adımları açıklayan. Sığır Gamma-B kristalen ORF sırası (528 baz çifti) pBSKS içinde aşağı T7 promotörünün klonlandı +. In vitro transkripsiyonu sonucunda için DNA EcoRI ile işleme tabi tutulmasıyla lineerleştirilebilir edildi. Lineerize şablon in vitro transkripsiyonu sonucunda için kullanılmıştır. DNA şablonu T7 promotor aşağı Gamma-B kristalen gen transkripsiyonun T7 RNA polimeraz tarafından tanınır. mRNA lityum klorür çöktürme yöntemi kullanılarak saflaştırıldı. MRNA arıtılmış vitro çeviri için kullanılır. Ardındanİnkübasyondan sonra, reaksiyon için% 30 gliserol çözeltisi üstüne katmanlı ve 4, 1 saat boyunca santrifüje tabi tutulur ribozom bağlı olgunlaşmamış polipeptidlerin izole etmek için 100,000 x g ° C'de.

Şekil 2. Tavşan Retikülosit Lysate (RRL) ve E. tercüme Sığır Gamma-B kristalen doğmakta polipeptidlerin İzolasyonu Lizat coli. 2 ug mRNA RRL veya E. içeren 100 ul reaksiyon içinde karıştırılmıştır 5 dakika süreyle 20 μCi ^{[35S]-metionin} ve 30 ° C'de olan üreticinin talimatlarına uygun olarak coli S30 Ekstrakt Sistemi (Promega, Madison, WI). Aşağıdaki reaksiyon için inkübasyon 100 mM KCI, 10 mM ₂ MgCI içeren, 10 mM Tris-HCl tamponu, pH 7.6 içinde% 30 gliserol 4.5 ml üstüne katmanlı ve 4 ° C'de 100,000 ve X g'de 1 saat boyunca santrifüj edildi Bir TLA-110 rotor (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA). Izole polyribosome pelet resu olduA (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) NaOH (olarak protokolü bölümünde açıklandığı) içinde gerçekleştirilmiş ve ardından 0.5 mg / ml ribonükleaz içeren, 1 mM Tris-HCl, pH 7.6 ile 20 ul içerisinde harcanan. Doğan polipeptidlerin% 16.5 T,% 6 C Tris-trişin SDS PAGE jel çözüldü. Jel, kurutulur ve otoradyografi için maruz bırakıldı. Maruziyet sonrasında jel GE Healthcare'in Typhoon Görüntüleme Tarayıcı ile taranmıştır. Şekil 2.1 çeviri reaksiyonları iki farklı sistem (RRL ve E. coli) yapılır sonra izole ve çözülmesi doğmakta polipeptidlerin ile jel gösterir. Şekil 2.2 jel Görüntü Quant TL ile analiz edildi . çeviri sonrasında SDS PAGE izole ve çözülmesi doğmakta polipeptidlerin: V2005 yazılım ve iki sistem biriken doğmakta polipeptidlerin molekül ağırlığı ve yoğunluğu kolayca analiz ve mukayese edilebilir olduğunu göstermek için burada örnek olarak kullanılan Şekil 2.3 kontroller iki set gösterir reaksiyonlar monte edilmiştirReaksiyon santrifüjleme tabi tutuldu ve daha önce mRNA ve / veya sonra olmadan için reaksiyonlara puromycin (5 dakika, nihai kons. 1 mM) ile muamele edildi.

Tartışmalar

In vitro transkripsiyonu ve translasyon reaksiyonlarda kullanılan bileşenlerin tekrarlanabilir sonuçlar, kalite ve konsantrasyonu için kritiktir. Mevcut çalışmada dikkatli kullanılırsa, yüksek oranda tekrarlanabilir veri sağlamak ticari kitler ve özleri kullanmışlardır. Gerekirse Bununla birlikte, çeviri-yetkin özler, birinin tercih edilen hücre ile hazırlanabilir. MRNA Kalite çeviri etkileyebilir, bu nedenle in vitro çeviri sırasında kullanmadan önce mRNA'ların b?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Kit Adı	Şirket	Katalog numarası
MEGAscript T7 Yüksek verim Transkripsiyon Kiti	Ambion	AM1333
Ribonükleaz İnhibitör	Invitrogen	15518012
Trans [35 S]-Etiket	MP Biomedicals	0151006
Ribonükleaz-A	Invitrogen	12091
Tavşan Retikülosit Lysate Sistemi, Nükleaz Tedavi	Promega	L4960
Doğrusal Şablonlar için E.coli S30 Özü Sistemi	Promega	L1030
Santrifüj	Beckman Coulter	Optima TLX ultrasantrifüjdeki
Depolama fosfor autoradiography	GE Healthcare	Typhoon 9410 değişken modunu görüntüleme
Doğmakta olan polipeptid analizi için yazılım	GE Healthcare	Görüntü Quant TL, V2005