Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды<em&gt; В пробирке</em&gt;, Чтобы определить Поступательное сайтов Пауза Наряду мРНК

Резюме

Техника для определения поступательного сайтов паузу на мРНК описано. Эта процедура основана на выделении зарождающейся полипептидов накопления на рибосомы в процессе искусственного перевода целевой мРНК, а затем размер анализ зарождающейся цепи использованием денатурирующих гель-электрофореза.

Аннотация

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the message^{for review see 1}. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates¹. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others². Codon bias is organism as well as tissue specific^2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs⁴. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes^5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein folding^{for review see 9}. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding^1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.

Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems^6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

протокол

1. Подготовка шаблона ДНК и транскрипции в пробирке

1. Гена, клонируют в Т7 и / или, например, SP6 транскрипционный промотор.
2. Ибо в пробирке транскрипции ДНК-матрицы линеаризуется с соответствующим ферментом ограничение резки ниже по течению от кодона ORF остановки и / или мРНК 3 'конца. Надо проверить полную линеаризации плазмиды ДНК, запустив продукт рестрикцией на геле агарозы.
3. Линеаризованной плазмиды используются для реакции в пробирке транскрипции. Различные концентрации ДНК-матрицы могут быть проверены, чтобы определить оптимальную концентрацию ДНК, необходимые для транскрипции в пробирке. Как правило, с высокой MEGAscript Ambion в транскрипции выход Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 мкг линеаризованной ДНК дает 40-60 мкг мРНК. В пробирке транскрипции осуществляется после инструкции производителя (Ambion / Life Technologies, Grand Islanг, Нью-Йорк).
4. После транскрипции в пробирке мРНК очищают осаждения лития хлорид в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (MEGAscript высокой Ambion в транскрипции выход Kit).
5. мРНК целостность далее проверена с помощью электрофореза на агарозном акриламида или гели.

2. В пробирке Сотовые Переводчик

Для перевода в пробирке с помощью R abbit R eticulocyte лизата, РРЛ (Promega, Madison, WI) выполните следующие действия:

1. Подготовить 100 мкл в инструкции пробирке перевод реакции следующих производителей. Короче говоря, в нуклеазы свободной воды добавить 2 мкл смеси аминокислот минус метионин (1 мм), 10 единиц ингибитора РНКазы (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 мкКи радиоактивных ^[35 S]-метионина (MP Biomedicals, Солон, Огайо), 70 мкл лизата ретикулоцитов кролика (Promega, Madison, WI).
2. Инкубируйте йэлектронная реакции при 30 ° С в течение 5 минут предварительно теплой перевод реакции. Добавить 2 мкг мРНК реакции переводе и инкубировать при температуре 30 ° С в течение 5 мин.
3. Остановить реакцию путем размещения перевод реакции на льду.

3. Выделение стадии становления полипептидов из реакции в пробирке перевода

1. Чтобы изолировать рождающегося полипептида связан с рибосомами (polysome), перевод реакции на верхнем уровне 4,5 мл 30% глицерина в 10 мМ Трис-HCl буфере рН 7,6, содержащего 100 мМ KCl, 10 мМ MgCI _2, и центрифугировали при 100000 X г в TLA-110 ротора (Beckman Coulter, Inc, Brea, Калифорния) в течение 1 часа при температуре 4 ° C.
2. Супернатант далее тщательно удалены.
3. Polysomal гранул содержащих зарождающейся полипептидов ресуспендируют в небольшом объеме (10-15 мкл) 1 мМ Трис-HCl буфере рН 7,6, содержащий 0,5 мг / мл рибонуклеазы (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° C. В порядкедля повышения гидролиза пептидил-тРНК эфирную связь, NaOH добавляют до конечной концентрации 10 мМ и инкубацию продолжали еще 30 мин.

В пробирке перевод реакцию собравшихся без мРНК и осуществляется на тех же условиях (с последующим выделением зарождающейся пептидов, как было описано) будет выступать в качестве основного контроля. Лечение перевод реакции (ы) с пуромицином до подвергая экстракт центрифугирования в градиенте плотности может служить в качестве дополнительного контроля.

4. Решение рождающегося полипептида на Трис-tricine SDS PAGE

1. Изолированной зарождающейся полипептиды решены и проанализированы на Трис-tricine SDS-PAGE. Пожалуйста, обратите внимание, что количество материала загружается на гель будет зависеть от эффективности белка маркировки, эффективность перевода на белки и многие другие параметры. Количество загруженного материала должна быть скорректирована эмпирически, чтобы бест визуализации и разделения отдельных зарождающейся полипептидной цепи.
2. После электрофореза гель фиксированы, сушат вакуум гель красильщика и подвергали авторадиографии. Распределение зарождающейся полипептиды, наблюдаемые с помощью phosphoimaging.

5. Представитель Результаты

Говядина Гамма-B кристаллина был переведен в лизата ретикулоцитов кролика, а также в E. палочки S30 экстракт системы (Promega, Madison, WI) с последующим выделением зарождающейся полипептидной цепи. На рисунке 1 показаны этапы выделения рибосом связанных зарождающейся цепи. В настоящем исследовании цель состояла в том, чтобы проверить, при изменении окружающей среды, т.е. перевод репертуар тРНК (как известно, существенно отличается у млекопитающих (РРЛ) и прокариотических (E.coli), системы связи с различиями в кодон смещения между организмами) может изменить рибосомы движение вдоль мРНК и влиять на распределение участков перевод паузы.Измененные рибосомы движение должно привести к изменениям в распределении размеров зарождающихся полипептидов накапливается в процессе перевода, а также их относительные интенсивности. Относительные интенсивности полос отражает длительность паузы. Зарождающегося полипептиды были выделены и решены на 16,5%, T, C 6% Трис-tricine SDS (Рис. 2). Гамма-B кристаллина в 20 кДа белок. Наблюдение зарождающейся полипептидов неодинаковой длины и интенсивности в РРЛ и Е. кишечной системы показывает, что движение рибосомы вдоль мРНК в этих двух системах следует различных кинетики перевода. Например, мы наблюдали видные группы 17,7 кДа в E. палочки лизат, а не в РРЛ системы, что свидетельствует о наличии дополнительного поступательного сайт паузу в 3'-концевой области мРНК (кодирование C-концевой области гамма-B кристаллина), когда он переводится в E. кишечной системы. Отметим, что гамма-B кристаллина гавани тандем Arg кодона (AGG ₁53 и AGA _154), которые часто встречаются в млекопитающих, но, как известно, крайне редко и медленно переводится в E. палочка. зарождающегося романа пептид накапливается в E. кишечной системы (~ 17,7 кДа рис. 2.2), скорее всего, вызвано рибосомы останавливаясь на этих тандем редких кодонов. Обратите внимание, что нет полосы можно наблюдать в отсутствие мРНК (рис. 2.3), и что пуромицин обработка удаляет большую часть зарождающейся цепи с полисом (рис. 2.3). Длительное лечение пуромицин (> 15 мин) удаляет все зарождающейся сети (данные не представлены). Это подтверждает, что наблюдаемые полипептидные продукты рибосомы связанный зарождающийся цепи, а не mRNPs cosedimenting с полисом.

Как упоминалось выше, кодон смещения организма, а также ткани конкретно. Представитель пример, описанный здесь, ясно указывает, что изменение окружающей среды перевода, т.е. репертуара тРНК / кодонсмещение может привести к изменено движение рибосомы вдоль мРНК. Очевидно, что этот простой метод не только позволяет идентифицировать поступательного сайтов паузу вдоль мРНК, но и позволяет быстро сравнение перевод сайтов паузы между различными системами.

Рисунок 1. Схематическое объяснение шагов выделить рибосомы связанных зарождающейся полипептидов. Говядине Гамма-B кристаллина ORF последовательность (528 пар оснований) был клонирован вниз по течению от промоутера T7 в pBSKS +. Ибо в пробирке транскрипции шаблона ДНК линеаризовать, рассматривая его с EcoRI. Линеаризованные шаблон был использован в пробирке транскрипции. Т7 промотора в матричной ДНК признается Т7 РНК-полимеразы, что транскрипция вниз гамма-B кристаллина ген. мРНК очищают, используя хлорид лития осадков методом. Очищенные РНК используется для перевода в пробирке. Послеинкубации, перевод реакции на верхнем уровне 30% глицерин и центрифугировали в течение 1 часа при температуре 4 ° С на 100 000 Х г выделить рибосомы связанных зарождающейся полипептидов.

Рисунок 2. Изоляция рогатого Гамма-B кристаллина зарождающейся полипептидов переведены на кролика ретикулоцитов лизата (РРЛ) и Е. палочки лизата. 2 мкг мРНК смешиваются в 100 мкл реакции содержащие РРЛ или E. палочки S30 экстракт системы (Promega, Madison, WI) в соответствии с инструкцией производителя с 20 мкКи ^[35 S]-метионина и инкубировали при 30 ° C в течение 5 мин. После инкубации перевод реакции на верхнем уровне 4,5 мл 30% глицерина в 10 мМ Трис-HCl буфере рН 7,6, содержащего 100 мМ KCl, 10 мМ MgCI _2, и центрифугировали в течение 1 часа при температуре 4 ° C и 100,000 г Х в TLA-110 ротора (Beckman Coulter, Inc, Brea, Калифорния). Изолированной polyribosome осадок гезиspended в 20 мкл 1 мМ Трис-HCl, рН 7,6, содержащий 0,5 мг / мл рибонуклеазы (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) с последующей обработкой NaOH (как описано в протоколе раздел). Находятся в стадии становления полипептиды были решены на 16,5%, T, C 6% Трис-Tricine SDS геле. Гель сушили и подвергаются за авторадиографии. После воздействия геля отсканированный с помощью сканера изображений Тайфун GE Healthcare в. Рисунок 2.1 показывает, гель с зарождающейся полипептидов изолированы и решил после перевода реакции сделано в двух разных систем (РРЛ и кишечная палочка). Рисунок 2.2 геле проанализированы изображения Квант TL ., v2005 программного обеспечения и используется здесь в качестве примера, чтобы показать, что молекулярный вес и интенсивность накопления зарождающегося полипептидов в двух системах можно легко проанализировать и сравнить Рисунок 2.3 показывает два набора элементов управления: зарождающийся полипептидов изолированы и решаться на SDS PAGE после перевода реакции были собраныбез мРНК и / или после перевода реакции лечили пуромицин (5 мин, конечная конц. 1 мм) до реакции был подвергнут центрифугирования.

Обсуждение

Для воспроизводимости результатов, качества и концентрации компонентов, используемых для транскрипции в пробирке и перевод реакции являются критическими. В настоящем исследовании мы использовали коммерчески доступных наборов и экстракты, которые обеспечивают высокую воспроиз...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / Kit	Компания	Номер по каталогу
MEGAscript T7 Высокая доходность Kit Транскрипция	Ambion	AM1333
Ингибитор рибонуклеазы	Invitrogen	15518012
Транс [35 S]-Label	MP Biomedicals	0151006
Рибонуклеазы-	Invitrogen	12091
Кролик ретикулоцитов лизата система, нуклеазы Обработанные	Promega	L4960
Кишечная палочка S30 экстракт системы линейных шаблонов	Promega	L1030
Центрифугирование	Beckman Coulter	Optima TLX ультрацентрифуге
Хранение фосфор авторадиограммау	GE Healthcare	Тайфун 9410 изображений в режиме переменной
Программное обеспечение для рождающегося полипептида анализ	GE Healthcare	Изображение Квант TL, v2005