Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Özet

Bu protokol, biz görüntüleme Ca son gelişmeleri güncellemek ^{2 + sinyalleri 2 + Gösterge boyası.}

Özet

Beyinde bilgi kodlama, kesin moleküler adımları yanı sıra hipotalamus kalır gibi beyin bölgelerinin çok fonksiyonlu çekirdekler belirli nöronların aktivitesi açısından merkezi bir soru altında yatan mekanizmalar hakkında bilgimiz çok büyük bir artış olmasına rağmen. Bu sorun, çeşitli nevrohormondur sinyal iletim cascades düzenlenmesinde rol oynayan moleküler bileşenlerin tanımlanmasını içerir. Hücre içi ^{Ca2 +} yükselmesi iki sinyal iletim seviyesinde ve sinaptik de nöron duyarlılık düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır.

Yeni araçlar, belirli bir promotör kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade ederek beyin nöronlarının sayısız nöronlar belirlemenize yardımcı olmak için ortaya çıkmıştır. Hem mekansal ve zamansal olarak uyaran-indüklenen izlemek için Ca ² GFP etiketli nöronlar, olmayan bir yeşil floresan Ca ^{2 +} göstergesi boya n ⁺ yanıtlarıeeds kullanılır. Buna ek olarak, konfokal mikroskopi doku içindeki derinliği farklı düzlemlerde nöronlar görselleştirmek ve out-of-odak floresans sınırlamak için kabiliyeti nedeniyle doku dilimleri görüntüleme bireysel nöronların bir favori yöntemidir. Nöronlar ¹ GFP-etiketli rasyometrik Ca ^{2 +} gösterge fura-2 kombinasyon halinde kullanılmıştır. Ancak, boya ultraviyole (UV) ışık tarafından heyecanlı. UV ışık lazer ve sınırlı optik penetrasyon derinliği maliyeti birçok laboratuvarda kullanımı engellemiştir. Ayrıca, GFP floresan fura-2 sinyalleri ² etkileyebilir. Bu nedenle, bir kırmızı floresan Ca ^{2 +} gösterge boyası kullanmaya karar verdi. Fura-kırmızı büyük Strokes vites bir tek uyarılma dalgaboyu kullanılarak GFP ile kombinasyon halinde kırmızı renkli floresans analiz izin verir. Biz olfaktör nöronlar ³ GFP etiketli birlikte fura-kırmızı kullanarak önceden iyi sonuçlar vardı. Olfaktör doku dilimleri için protokoller e işe yaradıqually iyi hipotalamik nöronlar ^4. Ca ² tabanlı Fura-kırmızı ⁺ görüntüleme de başarıyla GFP etiketli pankreatik β-hücreleri ve HEK hücre ^5,6 olarak ifade GFP etiketli reseptörleri ile kombine edildi. Fura-kırmızı küçük bir cilvesi göstergesi kalsiyum ⁷ bağlar kez 650 nm'de onun floresans yoğunluğunu azaltır olmasıdır. Bu nedenle, düşük ^{Ca2 +} konsantrasyon ile dinlenme nöronların floresan nispeten yüksek yoğunluğuna sahiptir. Unutulmamalıdır, diğer kırmızı Ca ^{2 +-göstergesi} boyalar var veya şu anda geliştirilmekte olan, farklı nöron ve beyin bölgelerinde daha iyi ya da daha iyi sonuçlar verebilir.

Protokol

1. Çözüm ve Agaroz Jel Hazırlanması

1. Çift distile su ile tabloya göre ekstrasellüler çözüm hazırlayın. PH değeri 7.3 olacak ~ carbogen (% 95 _O2 /% 5 _CO2), osmolarite 300 mOsm ⁸ ile 10 dk sonra havalandırma. Daha yüksek bir osmolarite gerekli ise, daha fazla glikoz (1 mM 1 mOsm eşit) eklenmesi ile ayarlanabilir. Çözelti, toz partikülleri ve olası bakteriyel kontaminasyon ortadan kaldırmak için bir 0.2 um zar filtresi kullanılarak iki kez süzülür.

Reaktif Adı	Kısaltma	Mol. ağırlık	Kons.	Şirket	Kedi. N °
Sodyum klorür	NaCl	58.44 g / mol	120 mM	VWR	27810
Sodyum hidrojen karbonat	NaHCO 3	84,01 g / mol	25 mM	Merck	106329
Potasyum klorür	KCl	74.55 g / mol	5 mM	Merck	104936
BES *	C 6 H 15 NO 5 S	213,25 g / mol	5 mM	Sigma	14853
Magnezyum sülfat, susuz	MgSO4	120,37 g / mol	1 mM	Sigma	M7506
Kalsiyum klorür dihidrat	CaCl * 2H 2 O	147,02 g / mol	1 mM	Merck	102382
D (+)-glikoz monohidrat	C 6 H 12 O 8 * H 2 O	198.17 g / mol	10 mM	Merck	108342

*N, N-Bis (2-hidroksietil)-2-aminoethansulfonic asit

2. Çözelti 4 ° C'de muhafaza edilir, ancak kullanımdan önce 10 dakika için carbogen (% 95 _O2 /% 5 _CO2) ile havalandırılır olmalıdır.
3. Şu anda, (bkz: adım 3) kesme işlemi sırasında beyin stabilize etmek için 1 cm agar jel ³ blok da hazırlar. İlk olarak, yaklaşık olarak 60 ° C'ye ısıtma çözelti ile çifte damıtılmış su içinde% 4 (w / v) agar (Sigma) çözülür Isıtmalı çözünmüş agar solüsyonu 1 cm yüksekliğinde bir kare Petri kabı içine dökülür. Soğutma ve sertleşme sonra,% 4 agar jeli ¹ cm3 bloklar halinde kesilir. Bu bloklar 4 ° C'de 4 hafta kadar saklanabilir

2. Fare Beyin diseksiyonu

Tüm hayvan deney prosedürleri ilgili kurumların hayvan refahı kuruluşlar tarafından oluşturulan ilkelere uygun olarak yapıldığından emin olun.

1. SACR öncehayvan ificing, agar jel blokları kullanıma hazır olduğundan emin olun.
2. Izofluran ile fare (yaklaşık 1 dak için hassas bir buharlaştırıcı kullanılarak oksijen izofluran% 1-4) uyuştur. Bu hipoksi ve dolayısıyla nöronal hasarı önlemek için önemlidir. Izofluran bir dezavantajı hassas buharlaştırıcılar kullanarak maliyet ve lojistik. Fare feda edilecektir yana açık bir sistem içinde bir ölümcül aşırı doz, bir alternatif olabilir. İş güvenliği bu durumda ciddi bir endişe içinde. Izofluran doğrudan odadan boşaltılmalıdır. Bu nedenle, açık bir sistem içinde bir aşırı kimyasal bir çeker ocak içinde yapılmalıdır.
3. Arka ayak refleks test ederek anestezi derinliğinin izlenmesi sonra hayvanlar fare Euthanize. Bu pedal pençe ya da kıskı refleks sıkıca hayvan tarafından bir çekme yanıt ortaya çıkarmak için, bir kişi parmaklarını arasında bir pençe ya da parmak kısma göre gerçekleştirilir. Bir refleks gösterir bir hayvan anestezi cerrahi bir düzeyde değildir ve kesinlikle deötenaziyle bir devlet.
4. Dekapitasyon sonra, frontal kemikten dış oksipital tümsek için, sagital yönde merkezi tek bir kenar jilet ile kafa derisi kesilir. Daha sonra aşağı yönde ventral (Şekil 1A-C), rostral yanal yönde orta kuyruk ucundan ilk olarak, kafa derisi iki parçası hareket ettirin.
5. İki yan ve küçük bir yay makas (Şekil 1C yön siyah kesikli oklar kesme için bakınız) foramen magnum bir rostral kesim olun. Künt forseps (Şekil 1C konusunda geniş gri oklar) ile yanal rostral için mediocaudal gelen kafatası kapalı dikkatlice yapışmak. Büyük hayvanlarda sutur küçük bir kesim beynin zarar kortikal katmanları önlemek için yararlı ve sık sık gerekli olabilir.
6. Bu anda oksipital, interparietal ve parietal kemikler ayrılmasıdır. Hala mevcut ise, dura mater dikkatli br zarar görmesini önlemek için forseps kullanılarak kaldırılmalıdırsonraki adımda ain.
7. Squamosal kemik, anterior etmoid ve frontal foramen (Şekil 1D) götürün.
8. Beyin artık kolayca ters mikro kaşık spatula kullanarak ve kranial sinirler (Şekil 1E) severing kaldırılabilir.

3. Fare Beyin Koronal Hipotalamus Bölümleri Dilimleme

1. Bir kesim dayanıklı yüzey üzerinde ventral tarafta beyin yerleştirin ve tek bir kenar jilet (Şekil 2A) ile serebellum çıkarın. Bu, düz kesim yüzeyi koronal beyin bölümleri dilimleme sağlamak için bir plaka üzerinde beyin montaj için temel olacaktır.
2. Hızlı kür alan yüksek performanslı siyanoakrilat yapıştırıcı yapıştırıcı (; Şekil 1A Loctite 406) düşük miktarda kullanarak Mikrotom kaide üzerine kesme bölümünde (Zeiss, damanı V50) ile Tutkal beyin. Buna ek olarak, tutkal beynin ventral tarafında 1 cm ³ agar jel bloğu (1.5 'e bakınız) (in' v 'bakın Şekil 2B) (Zeiss, damanı V50) beyin desteklemek ve düzeltmek için. Beyin ve jel blok kesme sonra doku dilim giderilmesinde sorunlara neden arasındaki tutkal erişir kaçmayı çok fazla tutkal kullanmak için değil emin olun. Jel blok mikrotom (Şekil 2B) kesme bıçağının karşı tarafında yer alacaktır.
3. Tahvil kuruduktan birkaç saniye sonra, ile dolu Mikrotom banyoya tabak koydu 6 ° C soğuk oksijenli (% 95 O ₂ /% 5 CO ₂₎ ekstrasellüler çözeltisi (1.1).
4. Uygun düşük dilimleme hızı kullanın ve 300 mikron kalınlığında dilimler kesip. Bizim mikrotom durumunda, 60 Hz, 0.8 mm bir genişlik ve 0.8 mm / s (Şekil 2C) Bir hız frekans kullanır. Koronal beyin dilimleri ya her kesimden sonra doğrudan toplanan veya tüm beyin kesitli olmuştur kadar banyosunda bırakılabilir. Koronal beyin dilimleri dikkatle transfe edilirSoğuk oksijenli ekstraselüler çözümü ile bir behere rred. Çeşitli araçları transferi (örn. kesim geniş plastik veya cam Pasteur pipetler veya geniş kaşık spatula) gerçekleştirmek için dizayn edilmiştir. Bu tercih edilmektedir experimentator bağlıdır. En önemlisi, dilim hasarı en aza indirmek için uygun ele alınmalıdır.
5. Mikrotom otomatik dilimler kesmek için programlanmış olabilir, bu anda Ca ^{2 +} göstergesi boya yükleme çözeltisi hazırlamak için başlayabilirsiniz. Aksi takdirde, dilimleme beyin adım 2 başlamadan önce, yani nöronlarda Ca ^{2 +} tepkilerini ölçmek için en aza indirmek için gecikme sona erdikten önce bu çözeltinin hazırlanması yapılması tavsiye edilmektedir.

4. Ca ^{2 +} Gösterge Boya Yükleme Çözüm hazırlanması

Yükleme nöronlarda kritik bir safha, sık sık neden olduğu hasar miktarına bağlıdır hücrelerinin sağlık ve hız olmuşturdiseksiyon prosedürü. Bir diğer önemli adım taze Pluronic kullanımı F-127 çözümü (4.1) gibi görünüyor. Bu laboratuvarda bu çözüm yapmak ve bir satıcıdan bir premade çözüm kullanmamaları tavsiye ediliyor. Sıcaklık, nem ve F-127 çözümü Pluronic ve raf ömrü ile ilgili olarak, biz, Ca ^{2 +} yükleme işlemi sırasında koku ve beyin nöron bozulması kaydetti.

1. DMSO çözelti üstüne Pluronic F-127 pudra katarak, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde% 20 (w / v) Pluronic F-127 (Sigma) hazırlayın. Doğrudan önceki girdap veya karıştırma olmadan bu çözümü sonikasyon. 2 dakika sonikasyon içinde Pluronic F-127 eritilecektir. 100 ul Pluronic F-127 çözümler haftada bir taze hazırlanmıştır.
2. 50 mikrogram hücre geçirgen fura-red/AM (Invitrogen, AM, asetoksimetil ester) bir tüpü alın ve F-127 çözümü 5 ul% 20 Pluronic ekleyin. Pipet ucu kullanılarak çözelti karıştırılır.
3. 45 ul ekstraselüler soluti ekleüzerine karışımı ve kısa vorteks ona (1.1).
4. Ek bir 325 ul ekstrasellüler çözüm ekleyin ve 3 dk süreyle tüp sonikasyon.
5. Sonication oksijenli 1.156 ml (% 95 O ₂ /% 5 CO _2), son Ca ^{2 +} göstergesi boya yükleme çözeltisi (30 uM fura-red/AM,% 0.33 DMSO ve% 0.065 Pluronic F-127) almak için ekstrasellüler çözüm ekledikten sonra . Kullanıma kadar karanlık bir yerde (4.8), tüp saklayın.
6. Oksijenli (% 95 O ₂ /% 5 CO ₂₎ ekstrasellüler çözeltisi (kuyu başına kadar altı dilim) ile dolu bir 6-hücre kültürü plaka (BD Falcon) için koronal beyin dilimleri aktarın.
7. Beyin dilimleri zarar vermemeye dikkat ederek 6-plaka odalarından oksijenli ekstrasellüler çözüm emmek.
8. Her kuyuya Ca ^{2 +} göstergesi boya yükleme çözümü Pipet doğrudan 750 ul. Beyin dilimleri fura-red/AM (daldırma yükleme) içeren çözelti ile kaplanmış olmalıdır.
9. Incubat37 ve 45 ila 60 dakika boyunca ° C:;: bir O ₂ / CO ₂ hücre kültürü kuluçka makinesi _(% 5 CO2% 23.5 'O ₂₎ e dilimleri
10. İnkübasyon süresinin sonunda, Fura-kırmızı hücreleri ile aşırı ve boya kenetleme hareket yoluyla ince bir şekilde Ca ^{2 +} ölçüm etkileyen önlemek için taze çözelti ile oksijenli hücre dışı ^{Ca2 +} indikatör boya yükleme çözelti değiştirin. Dilimler sonra O ₂ / kullanıma kadar CO ₂ inkübatör (ayarlar için önceki maddeye bakınız) tutulur ve 3-6 saat için geçerli olan edilmektedir.

5. Mikroskopi ve Analiz

Bu protokolde, ilgi hücreyi tanımlar GFP, ve Ca ^{2 +} göstergesi boya floresan yoğunluğu beyin dilimleri aynı anda ölçülecektir. Böylece, konfokal mikroskop iki yayılımı toplamak için doğru lazer, filtre ve iki fotoçoğaltıcı tüp ile donatılmış olmalıdırsinyalleri. GFP ve Fura-kırmızı flüoresans şiddeti değişikliği 488 nm'lik bir uyarma dalga boyunda tek kullanılarak ölçülebilir. Floroforlar gelen Emisyon floresans GFP ve fura-kırmızı için 600 nm den büyük dalga boyları için uzun geçiş filtresi için filtre 522/DF35 nm kullanılarak toplanabilir.

1. Hücre içi Ca ^{2 +} konsantrasyonunun bir ölçüsüdür floresans sinyal izleme uyaran indüklenen değişiklikler, başlatmak için fura-kırmızı yüklü beyin dilim birinin bir kayıt odası (yani Warner Instruments RC-27 Açık Banyo Odası) aktarılır ki konfokal mikroskop setup (Şekil 3A, B) üzerine monte edilebilir.
2. (; Adım 1.1 'e bakınız oksijenli ekstrasellüler çözüm) nedeniyle banyo çözüm perfüzyon hızına geçmek için dilim önlemek için arp (Şekil 3C) ile beyin dilim sabitleyin. Durmak (dilim tutucu) tutturulabilir naylon parçacığı paralel bir dizi (~ 1 mm ile birbirinden ayrılmış) yapılmıştırU şeklinde gümüş veya platin çerçeve. Bu aşamada küvet Çözeltinin sıcaklığı oda sıcaklığı en az olmalıdır. Yüksek sıcaklık gerekli olursa, uygun bakım mikroskobu parçaları değişen nedeniyle odak düzlemi mikroskop mercekleri ve hareket üzerine yoğunlaşmayı önlemek için alınmalıdır.
3. Hücre dışı ^{Ca2 +} gösterge boyası herhangi bir fazlalık çıkarmak için oksijenli ekstraselüler çözeltisi ile 10 dakika süreyle dilim serpmek. Perfüzyon debisi ~ 100 s / ul (uygun bir perfüzyon sistemi ^9'a bakınız ilgili ipuçları) ayarlanmalıdır.
4. Düşük büyütmede mikroskop aracılığıyla dilim bak, kayıtlarınız için dilim yönünü bir yere not edin ve beyindeki hipotalamik alanda bizim durumumuzda, dilim ilgi alanı bulabilirsiniz.
5. Yüksek büyütme değiştirin ve GFP görüntüleri toplayarak dilim ilgi hücre bulmak ve aynı anda fura-kırmızı floresan yoğunluğu kontrolSinyal (Şekil 4A-C). Yüzeye yakın hücreler hasarlı veya ölü olabilir. Bu nedenle, daha fazla 10 um arasında bir derinlikte bulunan hücreler görüntüleme için seçilmelidir. Biz güvenilir 40-50 mikron derinliğinde hücreleri ölçebilir, whereafter sinyal gücü düşmeye başladı. Düşük Ca ^{2 +} konsantrasyonu istirahatte hücrelerin fura-kırmızı sinyal görece yüksek floresans yoğunlukları var unutmayın. Bu yüksek floresans şiddetinin bu durumda ölü hücrelerin bir işaretidir. GFP sinyali doku dilim veya hücre içi pH ¹⁰ değişiklikler için bir gösterge olarak herhangi bir kayması ya da hareketi tespit etmek için kullanılabilir.
6. Fura-kırmızı floresans şiddetinin değişimi ölçümleri sağlar ve iki floroforlar ağartma engelleyen bir değere lazer gücünü ayarlayın. Bu nedenle, düşük lazer gücü ile başlar ve siyah düzeyi (ofset), dedektör diyafram, kazanç ve lazer nötral yoğunluk filtresi değiştirerek yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için ayarlayıns. Lazer gücü dışında, aynı GFP sinyali için yapılmalıdır.
7. 0.5 arasındaki oranlarda görüntüler elde etmek için Başlat - 2 Hz fura-kırmızı ve GFP sinyalleri toplamak için. Toplama düzeyi her bir ^{Ca2 +} sinyalinin beklenen oran için optimize edilmelidir. ^{Voltaj-bağımlı} Ca2 ⁺ kramponları çeşitli ikincil habercilerin aktivasyon gerektiren bazı sinyal iletimi kaskadlar aktivasyonu daha hızlı ve daha kısa geçici neden olabilir. Görüntü elde etme süresini deneyin amacı için uygun olmalıdır. Zamanla GFP sinyali beyin dilim herhangi bir hareket oluştu olmadığını belirlemek yardımcı olacaktır.
8. Edinimi ve deney sırasında, tüm tarama kafası ayarları mukayese edilebilir güvenilir sonuçlar kaydetmek için sabit tutulması gerekir.
9. ; Zamanla floresans değişimleri farklı matematiksel programlar, yani ImageJ (NIH, Bethesda, MD kullanılarak analiz edilebilir http:/ / Rsb.info.nih.gov / ij /), Igor Pro (Wavemetrics) veya MatLab (MathWorks). İlgilenilen bölgeyi gösteren bir GFP etiketli nöronun somata çevreleyen tarafından (ROI), bu aynı bölgede Ca ² değişiklikler için analiz edilebilir ⁺ zamanla fura-kırmızı floresans sinyali kullanılarak.

Ca ^{2 +} sinyalleri rasgele floresan birimleri olarak veya başlangıç ​​floresans (F) için normalize floresans yoğunluğunu (hızındaki) içinde göreceli değişim değerlerinin (hızındaki / F) olarak sunulabilir. Bu prosedür, bir negatif sapma ile sonuçlanır Ca ^{2 +} gösterge boya gibi fura-kırmızı kullanarak, hücre içi ^{Ca2 +} konsantrasyonu artar. Sonuçların yorumlanması kolaylaştırmak için, Ca ^{2 +} (Şekil 4C) bir artış görüntülemek için pozitif floresans sinyalleri almak için -1 ile hızındaki / F değerleri çarpmadan öneririz.

Nöronların Ca genlik ve frekans arasındaki sonuçları karşılaştırmak için ^{2 + sinyalleri genellikle analiz edilir. Ancak, bazı Ca 2 + sinyalleri düzenli bir dönem veya karşılaştırılabilir genlikleri ile meydana gelmez. Bazı sinyaller güçlü hücre içinde stokastik süreçler tarafından etkilenebilir. Böylece, belirli bir hücrede + Ca 2 toplam değişimin niceliğini ve beynin farklı bölgelerinde, alan-altında-eğrisi (EAA) analizi nöronlar arasındaki + tepkileri daha uygun olduğunu Ca 2 karşılaştırma etkinleştirmek için. Ca 2 miktarı için bu tedbir + herhangi bir başlangıç ​​Ca 2 + geçici, ikinci aşamalarını kapsar ve artmış Ca 2 + yanıtları ve salınımlar sürdürmüştür. Bu durumda basamakta nöronlar arasında karşılaştırma yapabilmek için aynı zaman diliminde analiz için alınmalıdır.}

6. Temsilcisi Sonuçlar

Hipotalamustaki nöronlarda eksprese gonadotropin salgılatıcı hormon reseptörü (GnRHR) karakterize başlatmak için biz transgenik farelerin kullanımı yaptığınız Cre-aracılı exci sonra ekspres GFPde sion nöronlar ^4,11 GnRHR-ifade. GFP floresan nöronlar hipotalamus dahil olmak üzere çeşitli beyin alanları tespit edilmiştir. Bu GnRHR nöronların fizyolojik özelliklerini incelemek için, öncelikle Ca ^{2 +} kaydedilen bir konfokal mikroskop kullanılarak hipotalamik dilimlerden sinyaller. İlk olarak, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak bu fareler, koronal beyin kesitleri elde edilmiştir. Şekil 1, bu gerekli araçları, malzeme ve bir fare beyin eksize için adımlar gösterilmektedir. Koronal hipotalamik beyin dilimlerini protokolünün 4. noktasına adımlara göre kesilir (Şekil 2) ve daha sonra yüklendi. Uygun alan Tek beyin dilim (adım 5,1-5,9 bakınız) bir enstrüman (Şekil 3) ile sabitlenir ve daha sonra bir konfokal mikroskop ile görüntülenmiştir, bir kayıt odasına yerleştirilir. Şekil 4, tek bir tespit iki ayrı koronal beyin kesitleri bir örnek gösterilmektedir GnRHR-τGFP hücre gövdeleri, loadin sonra istirahat floresansg fura-red/AM ile beyin dilim ve GFP nöron uyaran-indüklenen Ca ² soruşturma sağlamak için yeterince fura-kırmızı aldığını belirten Birleştirilen konfokal görüntü ⁺ bu hücrelerde sinyaller. Bizim protokol kullanarak biz başlangıçta GnRHR nöronlar GnRH ile doğrudan aktivasyonu (Şekil 4E) yanıt olarak hipotalamusun farklı alanlarda teşvik tespiti için benzer Ca ^{2 +} sinyalleri kullanan olmadığını test. Ancak, bu sinyalleri uyaran gücünü ve beyin alanında ⁴ bağlı olarak kendi dalga farklıydı. Ca ^{2 +} yanıtların dinamik olarak değişiklik ölçmek için, bölge-altında-eğri (AUC) hücre içi ^{Ca2 +} (Şekil 4E) ⁴ artışı için bir ölçü olarak hesaplanabilir. Çalışmalar şu anda Ca ^{2 +} dalgalar ve titreşimler, seks bağımlılığı ve hayvanın hormonal durum altında yatan moleküler temelini araştırmak için çalışmalar devam etmektedir ve bunlar modüle edilebilir olmadığınıdiğer doğal uyaranlarla.

Şekil 1. Araçlar, malzeme ve bir fare beyin eksize için adımlar. A. Beyin diseksiyon için kullanılan araçlar ve malzemeler: 1, Loctite 406 yapıştırıcı; 2, mikro kaşık spatula, 3, tek kenar jilet, 4, küçük ve orta bahar makas, 5, künt forseps; 6, makas, 7, Petri agar içeren jel bloğu; 8, mikrotom içine montaj beyin için taban plakası. BF. Protokol noktası 2'de tarif edilen bazı adımlar görüntüleri. Kesme kafa derisi pozisyonlar (kırmızı çizgi) ve deri (adım 2.4) kemik uzak çekilmelidir yönünü gösteren oklarla (turuncu) gösteren bir fare kafası B. Fotoğraf. Ten (adım 2.4) kemik yapıları gösteren uzağa doğru çekilir sonra fare kafa C. Fotoğraf. Küt forseps ile kafatasına açık bozduğu için makas ve yön doğrultusunda kesme ya da siyah ile gösterilirsırasıyla, oklar veya gri geniş okları kesik. Çeşitli kemik yapıları ortadan kaldırarak sonra fare beyin (- 2.7 adım 2.5) D. Fotoğraf. Beyin çıkarılması E. Fotoğraf yine kafatası sinirleri üzerinden kafatası bağlanır. Nispeten zarar görmemiş fare beyin F. Fotoğraf.

Şekil 2. Fare beyin koronal hipotalamik bölümden Dilimleme. A. (Adım 3.1) serebellum ortadan kaldırmak için tek bir kenar jilet yerini gösteren fotoğraf. Beyin göre agar jel blok B. Pozisyon (adım 3.2) mikrotom bir taban plakası üzerine yapıştırılır. Koronal beyin dilim C Kesme (burada beyin ve Mikrotom kesme bıçağı açısından jel blok pozisyonların yerini not edin;. Adım 3.4 'e bakınız). d, dorsal; v, ventral.

Şekil 3. Kayıt odasına yerleştirilir Beyin dilim. A, B, Genel Bakış (A) ve daha yüksek büyütme (B) koronal beyin dilim hipotalamik alanları (bkz: adım 5.1) geniş erişim veren bir Warner Instruments RC-27 açık banyo kayıt odası. (Adım 5.2) kayıt odasında pozisyonda dilim tutacak naylon konuları paralel dizileri içeren C. U-şekilli metal arp.

Şekil 4. Ca ² fare hipotalamik beyin dilimleri τGFP nöronlarda ⁺ sinyalleri. AD. Bir GFP nöron ve koronal fare beyin dilimleri fura-kırmızı floresans eşzamanlı edinimi belirlenmesi. GnRHR-τGFP nöronlar (yeşil) tanımlayan bir koronal beyin dilim A. Konfokal görüntü. Beyin bölgesinde B. nispeten homojen bir floresan sinyali (kırmızı) A fura-red/AM ile beyin dilim yükleme sonra gözlenen gösterilmektedir. C. neu gösteren görüntüyü MergedRons A Ca ^{2 +} yüklü gösterge boyası (sarımsı) tasvir. Iki olmayan GFP somata (oklar) örnekleri gri hatları belirtilmiştir oysa GFP nöron somata sınırları, kesik beyaz çizgiler olarak gösterilmektedir. Arka plana göre kırmızı floresans yüksek miktarda bir GFP ve non-GFP nöron D. örneği. Somatik uyaran indüklenen Ca ² E. örnekleri farklı hipotalamik beyin alanlarda bireysel GFP etiketli nöronlar (Pe, periventriküler çekirdeği; DM, dorsomedial hipotalamus; Arc, arkuat nükleus) ^{+ 'dan} yanıtları. Alan-altında-eğrisi (EAA) kırmızı alan ile gösterilir. Farklı Ca ² arasındaki ⁺ sinyalleri GnRHR-ifade Farklı hipotalamik nükleus nöronları Ca ² toplam değişim için bir tahmin olarak EAA ile mukayese edilebilir ⁺ aynı dönemde belirli bir hücrede. F. Şematik çizimler ve diyagram AE analiz GFP etiketli nöronların yerini gösteren paneli Üst:. Koronal beyin s konumuhipotalamik beyin bölgeleri (kırmızı çizgi) içeren ection Orta ve alt panel:. beyin dilim (orta) ve kırmızı noktalar itibaren kaydedilen GFP etiketli nöronların yaklaşık konumunu gösteren, kırmızı kutulu alanı büyütme (alt panel) şematik çizimi E gösterilen Pe, DM ve Arc; alt panel düzeni siyah alan: ^3. ventrikül. Alt iki diyagramları Paxinos ve Franklin ¹² uyarlanmıştır. Sol alt köşedeki sayı bregma mesafe (mm) gösterir.

Tartışmalar

Sinirbilim bir önemli soru beynin sosyal bilgiler nasıl işlediğini anlamak. Sosyal tanıma için gerekli bilgilerin bir baskın kaynağı koku veya pheromonal sinyalleri tarafından kodlanmıştır. Nöronal burun nüfus ve özellikle beyin, hipotalamus sinyallerin tanınması ile bu sinyallerin tespiti, birçok sosyal süreçler ve etki hormonlar ve diğer nöroendokrin faktörler ^13-16 anahtar bir rol oynamaktadır. Birden çok fonksiyonlu nöronlar çekirdekler içeren hipotalamus gibi beyin bölgeleri...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Şirket	Kedi. N °
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimetil sülfoksit	Fisher Scientific	BP231
Titreşimli-Blade Mikroskobik damanı V 50	Zeiss	9770170
Mikroskobik damanı V 50 için Aygıt CU 65 Soğutma	Zeiss	9920120
O 2 / CO 2 İnkübatör, CB210-UL	Cilt	0019389
Süper yapıştırıcı, Loctite 406TM	Henckel	142580
İkili spatula, kaşık şekilli	Bochem	3182
Microspoon spatula, kaşık şekilli	Bochem	3344
Bahar Makas, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Bıçakları	Güzel Bilim Araçları	15370-52
Bahar Makas, Vannas - 3mm Bıçakları	Güzel Bilim Araçları	15000-00
Wagner Makas	Güzel Bilim Araçları	14071-12
Tıbbi Forseps, Dumont 7b	Güzel Bilim Araçları	11270-20
Büyük Dikdörtgen Açık Banyo Odası (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Konfokal Mikroskop BioRad Işıltı 2100	Zeiss	na