Akut ve Subakut Fare Arka ayağın İskemi Yöntemleri

Özet

Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.

Özet

Periferik arter hastalığı (PAH) güvenilir bu hastalık için yeni tedavilerin geliştirilmesi için gerekli olan insan hastalığı yeniden kardiyovasküler morbidite ve gelişmiş ülkelerde ölüm ve hayvan modellerinde önde gelen nedenidir. Fare hindlimb iskemi modeli yaygın olarak bu amaçla kullanılmaktadır, ancak femoral arter ligasyonu ile akut ekstremite iskemisi uyaran standart bir uygulama iskemi vasküler ve iskelet kas dokusu yanıtları incelemek için araştırmacıların yeteneğini tehlikeye, önemli doku nekrozuna neden olabilir . Femoral arter ligasyonu için alternatif bir yaklaşım AMEROID konstriktör- kullanımı yoluyla yavaş yavaş femoral arter oklüzyonu meydana gelmesidir. daha yavaş, sub-akut iskemi ile sonuçlanır - 3 gün, femoral arter ligasyonu siteleri ile aynı ya da farklı yerlerde femoral arter etrafına yerleştirildiğinde, bu cihazlar üzerinde 1 arter tıkanması. Bu w, daha az önemli iskelet kası doku nekrozuna nedenhich daha yakından insan PAD görülen yanıtları taklit edebilir. genetik altyapı etkiler hem akut ve subakut iskemi modellerinde çıktıları, çünkü fare suşu dikkate en iyi modeli seçiminde önemlidir çalışılmaktadır. Bu yazıda fare subakut veya akut hindlimb iskemi ikna etmek için uygun prosedür ve fare femoral arter üzerinde bitişik harfler veya AMEROID konstriktör- anatomik yerleşimi anlatılır.

Giriş

Periferik arter hastalığı (PAH), gelişmiş ülkelerde ¹ kardiyovasküler morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir. Elde edilen egzersiz veya dinlenme ağrısı ve bazen bacak amputasyon gerektiren ülser ve kangren iyileşmeyen ile ekstremite iskemi neden periferik arterlerin aterosklerotik tıkanması PAD sonuçları. Esasen etkili medikal tedaviler ⁴ mevcut olarak PAD hedefleyen terapiler, öncelikle endovasküler ² veya cerrahi revaskülarizasyon ³ yöneliktir.

Baypas greft bazı toplumlarda (örneğin, sigara içen kadınlar, sigara safen ven greft) ^6,7 kötüdür ⁵ (5 yıl içinde% 50 kadar) yüksek başarısızlık fiyat bilgisi Ne yazık ki, revaskülarizasyon, genellikle sınırlı fayda sağlar. Böyle anjiyoplasti ve stent olarak Endovasküler yaklaşımlar, aynı zamanda (1 yıl içinde% 50 fazla) yüksek restenoz oranları tehlikeye edilir, i özellikleilaç salınımlı balonlar ve stentler kullanımı biraz ^9-11 sonuçlar alınmasını sağlamıştır rağmen n, hastalık ⁸ Femoropopliteal. PAD için yeni tedaviler geliştirmek için güvenilir insan hastalığı yeniden hayvan modelleri geliştirmek için gereklidir.

Bugüne kadar, PAD en yaygın model en çok farelerde ^12,13 gerçekleştirilir arka bacak iskemisi modeli (HLI) 'dir. en yaygın belirtisi, model proksimal ve distal femoral arter cerrahi ligasyonu gerektirir ve müdahil yan dalları kan akımı ve akut ekstremite iskemi indüksiyon tıkanması ile sonuçlanan geminin eksizyonu ile izledi. HLI periferik ekstremite kas dokusunda anjiyojenik ve arteriyojenik tepkiler ve bu tepkilerin çeşitli terapiler (örneğin, ilaçlar, gen aktarım, kök hücreler) etkilerini incelemek amacıyla öncelikle kullanılır olmuştur. Daha yakın zamanlarda, bizim grup iskelet kas hücrelerinin rolünü incelemek için bu modeli kullandı in tepki iskemi ve sonuçları ¹⁴ genetik farkların etkilerini ekstremite için.

HLI modeli mevcut iskemi damar ve kas yanıtları genetik (yani, doğal suş) ¹⁵ bağlıdır anlayış, yaş ¹⁶ ve diyabet ¹⁷ de dahil olmak üzere, diğer hastalıklar veya ateroskleroz ile ilgili koşullar, varlığını veya yokluğunu kolaylaştırmıştır hiperkolesterolemi ^18. Ancak, geleneksel HLI modelinin önemli bir zayıflık insan PAD periferal arterlerde tıkayıcı aterosklerotik lezyonların kademeli gelişmenin bir sonucu olarak kronik iskemi neden halbuki, akut ekstremite iskemisi ^12,13 modeli olmasıdır.

Bu zayıflığı aşmak için bir girişim, Tang ve arkadaşları başlangıçta AMEROID konstriktör- ¹⁹ kullanılarak kademeli femoral arter tıkanıklığı bir fare modeli, ve daha sonra d aynı grup geliştirdiBenzer bir fare modeli ²⁰ eveloped. AMEROID konstriktör- kronik miyokardiyal iskemi ^21,22 bir köpek modelinde 1950'lerde ilk açıklanmıştır. Bu cihazlar, genellikle kazein, higroskopik bir malzemeden bir iç tabaka saran bir dış metal manşon, ve bir arter etrafına yerleştirilen zaman çevre dokulardan nemi emer onlar yavaş yavaş damar tıkanıklığı neden olur. Modelin bunların modifikasyonda, Yang ve ark., Proksimal ve cerrahi ligasyon sitelerinin benzer yerlerde distal femoral arter hem konstriktör- yerleştirilir ve geleneksel modelde olduğu gibi, femoral arter yan dalları bağlanmıştır. Ameliyat sonrası 5 hafta ve daha az kas nekrozu ²⁰ - Akut HLI karşılaştırıldığında, AMEROID konstriktör kaynaklı iskeminin enflamatuar ve kesilme baskısı bağımlı gen alt ekspresyonu, düşük kan akışı geri 4 sonuçlandı. Bu gözlemlere dayanarak, bu kademeli arter tıkanıklığı P bir model olabilir hissedildiinsan hastalığı için daha uygun AD.

Özellikle, ilk çalışmada, AMEROID konstriktör kaynaklı iskeminin etkileri yalnızca işemi kaynaklı kas nekroz ¹⁵ göreceli olarak dirençli olan, C57BL / 6 fareleri ¹⁹ incelendi. Son zamanlarda daha yavaş iskemi modelinde değişik ve daha iskemi, hassas BALB / C fare türünde ²³ etkilerini inceledi. Modelin ilk tezahürü olarak, proksimal ve distal femoral arter hem konstriktör- yerleştirilen ancak bozulmamış tüm yan dalları bıraktı. İkinci, daha hafif değişiklik, biz sadece proksimal femoral arter tek bir yılanı yerleştirilir ve yine bozulmamış arterin tüm yan braches bıraktı. Bu modele göre, her iki modifikasyon, biz, bu BALB / c fareleri, ancak C57BL / 6 fareleri bulunan benzer kan akışını ve vasküler yoğunluğa sahip olmasına rağmen önemli bir kas nekrozunu gösterilir. Önceki çalışmamızda ¹⁴ benzer şekilde, bu bulgular o bacak kası gösterdiYaralanma sadece kan akımı etkisinde, ancak kısmen genetik yapılarına bağlı olduğu değildir. Ayrıca, biz ekstremite kan akımı böylece modeli birden fazla 'subakut' yerine kademeli ekstremite iskemi gibi görünüyor, 3 gün içinde nadir düştü bulundu.

Bu önceki çalışmalara göre, arka bacak iskemisi uyarılması için tek bir yöntem, her durumda uygun olmayabilir açıkça görülmektedir. Koşullarında (örneğin, genetik farklılıkları ve varlığı ya da ko-morbid koşullar yokluğunda) etkisi damar ve iskelet kas özel cevapları, çeşitli araştırmacılar bulabilir için gerekli kronik olup ve / veya en iyi şekilde arka bacak iskemisi şiddetini değiştirmek için kendi amaçlarına uygun. Ayrıca, model önceki tariflerde tipik haliyle tekniğin güvenilir arası Araştırmacı tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için uygun bir anatomik yerler yoktu. Bu yazıda, fare akut veya subakut ya hindlimb iskemi uyarılması için yöntemleraçıklanmaktadır ve hassas anatomik oluşumlar bulunur.

Protokol

Bütün hayvan deneyleri Duke Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir protokole göre gerçekleştirilmiştir. her iki cinsten kullanılabilmesine rağmen çalışma bilimsel bir amaç için belirtildiği gibi erkek fareler, bu çalışmada kullanılmıştır.

1. Epilasyon

1. 37 ° C'de ayarlanmış bir kapalı ısıtma yastığı ve izofluran sürekli akışına bağlı bir roket ucu konisi bağlantı oluşan bir ameliyat öncesi hazırlama alanı kurmak anestezinin indüksiyonu öncesinde.
2. Anestezi indüksiyon odasında fare yerleştirin. % 3 - 1 ile 1 L / dk ve izofluran O ₂ debimetre ayarlayın.
   Not: Anestezi, tipik olarak% 2 izofluran ile 25 g fare indüklenir.
3. yavaşça odasına sallanan ve bir düzeltilmesi refleksi eksikliği gözlemleyerek farenin teşvik yanıtını kontrol edin.
4. Açılış öncesinde izofluran temizlemek için O ₂ ile odasına yıkayın. Hızla ısıtma p için fareyi hareket ettirinreklam ve roket ucu konisi yoluyla izofluran bağlayın.
5. % 1.5 izofluran ayarlayın. Pedal refleks (ayak tutam) tarafından uyaran yanıtını kontrol edin.
6. Ameliyat sırasında kurumasını önlemek için her iki göze liberal oftalmik yağ sürün.
7. küçük bir elektrik düzeltici kullanarak her iki arka bacaklarda saç tıraş. Cildi laserasyon yaralanmasıdır önlemek için tıraş sırasında gergin cildi tutun.
8. Önceden ısıtılmış epilasyon kremi uygulayın ve 1 dakika boyunca bekletin. Yavaşça nemlendirilmiş gazlı bez kullanılarak silin.
9. daha sonra cerrahi işlem için, izofluran kapatın ve kafes yatak aspire olmayan fare sağlamak için boş bir kağıt havlu kaplı kurtarma kafesine fareyi hareket ettirin. sternal yatma koruyabilmiştir kadar hayvan izleyin. Aksi takdirde, cerrahi masaya fareyi hareket ettirin.
   NOT: Epilasyon işlemi cildi tahriş ve perfüzyon ölçümleri etkileyebilir. p önce hayvanın saçlarını çıkardıktan sonra 2 gün, 1 - beklenmesi tavsiye edilirBir ameliyat öncesi perfüzyon taraması erforming veya ameliyat gerçekleştirmek.

2. Ön-Cerrahi Hazırlık

1. Bu işlem sırasında aşağıdaki araçları kullanın; küçük düz cerrahi makas, 2 ince uçlu açılı forseps, küçük Graefe forseps, iğne sürücü forseps, 3 retraktörleri, küçük yaylı makas ve ince uçlu pamuklu çubuk.
2. Ameliyat başlamadan önce bir otoklav kullanarak tüm araçları sterilize edin. En fazla 5 hayvanlar için, her cerrahi işlem öncesi ve arasında sıcak boncuk sterilizatör kullanın. 5 daha büyük gruplar ameliyatlar için ek cerrahi alet paketleri sterilize edin.
3. kapalı ısıtma yastığı ve izofluran port oluşan steril cerrahi alanında hazırlayın. 10 Stereo diseksiyon mikroskobu altında tüm çalışmaları gerçekleştirmek.
4. Anestezisi ve adımları 1.5 1.1 de tarif edildiği gibi fare hazırlamak.
5. Fare tamamen uyuşturulmuş olup olmadığını kontrol edin ve cerrahi masaya bir yatar pozisyonda içine yerleştirin. Cerrahi bant kullanarak iki bacak sabitleyin.
6. sıcaklık kontrollü ısıtma yastığı kullanılarak, sıcaklık probu takmak ve yanlışlıkla işlem sırasında çıkardı olmayacak emin olmak için cerrahi bant kullanarak cerrahi platformunun tabanına sabitleyin.
7. 3 alternatif povidon-iyot ve alkol mendil kullanarak kesi sitesine temizleyin. Steril cerrahi örtü ile hayvan örtün ve kesi sitesine ortaya çıkarmak için bir delik.

Bacak İskemi 3. İndüksiyon

1. Karın doğru diz çalışan, medial uyluk merkezi boyunca bir başlangıç ​​kesi yapmak ve ince makas (Şekil 1A) ile yaklaşık 1 cm kesi uzatmak için bir neşter kullanın.

Şekil 1. Cerrahi Alan ve Fare Arka ayağın İskemi Cerrahisi Damar Anatomik Merkezi. (A) Dış görünümyatar pozisyonda bir fare hindlimb. Yumurtadan çizgi düzgün hindlimb iskemi işlemleri gerçekleştirmek için kesi sitesini gösterir. Proksimal fare hindlimb damarsal (B) Görünüm. Femoral arter (FA) yakın ucu, inguinal ligamanın (IL) altından çıkar. FA uzak ucu popliteal arter (PA) ve safen arter (SA) ayrılmasından yer almaktadır. FA kapalı ana teminat arterler lateral sirkumfleks femoral arter (LCFA), proksimal kaudal femoral arter (PCFA) ve yüzeysel kaudal epigastrik arter (SCEA) bulunmaktadır. femoral ven (FV) FA bitişik çalışır ve venöz şube büyük arter dalları paralel görülebilir. Yıldız (*)., AMEROID konstriktör- veya bitişik harfler yerleştirme için yakın ve uzak siteleri göstermek subakut veya akut iskemi kaynaklı olacak bağlı olarak , lütfen cliBu rakamın büyük halini görmek için buraya ck.

2. forseps kullanarak, kesi açın ve kasık yağ dokusu (IFT) kapsayan membran maruz kalmaktadır.
3. delmek IFT ve karın arasındaki ayrılık içine zarından, kapalı forseps kullanma. Yavaşça altında nörovasküler demet açığa karın kaslarının gelen IFT ayırmak için forseps üzerindeki baskıyı bırakın. Önemli anatomik (Şekil 1B) olarak proksimal ve yüzeysel kaudal şube gözlemleyin.
4. Retractor takın ve proksimal AMEROID yılanı veya ligasyon sitesi, lateral sirkumfleks femoral arter (Şekil 1B) sadece proksimal maruz proksimal karın dokusu çekin. Lateral sirkumfleks arter proksimal ve yüzeysel kaudal arterlere yaklaşık 5 mm proksimal yatıyor.
   1. , Kesi distal parçası haline iki retraktörler, bir medial ve lateral birini eklemek distale uzak IFT çekmeyecerrahi alan cerrahi alanında genişletmek için.
5. nörovasküler demet kaplayan en dıştaki zar kaldırmak için iki ince forseps kullanın. Yavaşça onları birbirine bağlayan zarının altında forseps ucu kayma, ven ve arter arasındaki ince forseps ucu yarısını yerleştirin. forseps kapatın ve hafifçe membran yırtın.
6. ven ve arter arasında kapalı forseps ucunu yerleştirin ve forseps üzerindeki baskıyı bırakarak aralarında bir boşluk oluşturun. arter ve sinir arasında bir boşluk oluşturmak için bu tekniği tekrarlayın.
7. Subakut ekstremite iskemi, proksimal femoral arter (Şekil 2) bir AMEROID yılanı yerleştirin.
   1. Proksimal AMEROID yılanı yüklemek için, nörovasküler demet onu izole etmek femoral arter altında bir forseps ucunu kaydırın. kavrama yılanının kenarına angled- forseps ikinci bir set kullanın ve femoral arter altında rehberlik.
   2. s içine femoral arter Layyılanının lot. Popliteal arter ve safen arter (Şekil 2) içine femoral arter çatallanma hemen proksimal konumlandırma, uzak yılanının için tekrarlayın.

AMEROID konstriktör- ve ligatürler Şekil 2. Yerleştirme. Subakut hindlimb iskemi ikna etmek için femoral arter üzerine yerleştirilen iki AMEROID konstriktör- (A) örneği. Proksimal yılanı lateral sirkumfleks femoral arter (LCFA) sadece yakın yerleştirilir. Distal constrictor popliteal (PA) ve safen arterler (SA) çatallanma sadece yakın yerleştirilir. Konstriktör- arter sağlamak için yukarı bakacak yuva düzgün yılanının içinde ayarlanır ile yüklenir. Akut hindlimb iskemi ikna etmek için femoral arter bitişik harfler (B) örneği. Ligatures (sarı oklar) onlar paneli (B) konstriktör- konumunu kanadını şekilde yerleştirilir ve femoral arter iki bitişik harfler (yıldız) her set arasında transeksiyon edilir. Bar, 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

8. Akut ekstremite iskemi, bağlanır ve proksimal femoral arter transect.
   1. femoral arter transect için, iplik 7 - yakın yılanının pozisyonuna sadece proksimal arter Ç dikiş ve düğüm (Adım 3.7). İlk 1 mm distalinde bir ikinci bitişik harfleri kravat.
   2. İki bitişik harfler arasındaki arter transect için yaylı makas kullanın. distal arteryel transeksiyonu için, popliteal arter ve safen arter içine femoral arter çatallanma ayrı, sadece yaklaşık 1 mm yaklaşık iki bitişik harfler yerleştirerek ancak yüzeysel Caud distal olmasını sağlamak, bu adımları yineleyinal epigastrik arter (Şekil 1)
9. O Vicryl sütürler - kesi kapatın kullanarak 5 kesildi.

4. Perfüzyon Görüntüleme

1. Lazer Doppler perfüzyon kamera (LDPI) altında ayarlanmış 37 ° C ısıtma pedi için fareyi hareket ettirin ve izofluran kaynağına bir roket ucu konisi yoluyla bağlayın. herhangi bir sıcaklık izleme mevcuttur, fare, 37 ° C 'ye kadar ısınmaya için, 5 dakika izin verir.
2. kamera açın ve görüntü yakalama yazılımı başlatmak.
3. 'Tarayıcı Ayarları' penceresini açmak için 'Yeni Tek Resim' simgesini tıklayın. '4 ms / piksel' ile 'Büyük' ​​ve 'Tarama Hızı' ile 'Tarama Boyutu' olarak ayarlayın. 'Tarama Alanı (adet)' bölmesinde x ve y değerlerini değiştirerek tarama alanını ayarlayın.
4. video beslemesini görüntülemek için 'Video ve Distance' sekmesini tıklayın ve kırmızı çizgileriyle de gösterildiği tarama alanına sığdırmak için fareyi düzenlemek. kalibre etmek 'Otomatik Mesafe tıklayınkonuya lazer mesafe. 'Konu Detayları' penceresini açmak için 'Next' tıklayın.
5. konu bilgi ve ilgili yorumlarınızı girin. tarama penceresine geçmek için 'İleri' düğmesine tıklayın.
6. 'Onayla veya Scan Distance geçersiz kıl' açmak iletişim için 'Başlat Ölçülmesine' düğmesine tıklayın. Tarama mesafe onaylamak için 'OK' tıklayın. Tarama alanının büyüklüğüne bağlı olarak 8 dakika - tarama işlemi başlayacak ve 4 aday gözlemleyin.
7. Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, 'Farklı Kaydet' penceresini gözlemleyin. Dosyayı adlandırın ve kaydedin.
8. izofluran kapatın ve boş bir kurtarma kafesine fareyi ve hayvan sternum yatma koruyabilmiştir kadar izler. diğer farelerin bir kafesin içine anestezi kurtarma fare koymayın.
9. Görüntü analiz yazılımı açın. 'Aç' simgesine tıklayın ve gidin ve analiz için görüntü dosyasını açın. Dosya penceresinde, akı gözlemlemek,fare fotoğraf ve renkli görüntüler.
10. akı resmin üzerine ilgi alanları (ROI) bölgesini işaretlemek için, 'Show ROI' simgesini tıklayın. Sonraki 'Ekle Poligon' düğmesini tıklayın ve ROI çizmek için cerrahi olmayan uzuv imleci sürükleyin. şekli kapatmak için sağ tıklatın. Seç tekrar 'Poligon Ekle' ve cerrahi uzuv etrafında eşleşen ROI çizin.
11. 'Görüntü ROI İstatistik Sonuçları (PU)' penceresi açmak için 'İstatistikler' simgesini tıklayın. 'Akı%' sütununda akı yüzde farkını dikkate alınmalıdır.
    NOT: referans olarak görev yapacak çekilen ilk ROI.
    NOT: Her bir sonraki perfüzyon sintigrafisi öncesinde fare uyutmak için Bölüm 1'de özetlenen adımları izleyin ve adım görüntüye 4.11 4.1 hayvan olarak.

Sonuçlar

Fare arka bacak damar sistemini uygun şekilde tanımlanması, burada açıklandığı gibi, subakut ve akut arka bacak iskemisi uyarılması için teknikler tekrarlanabilirliği sağlamak için çok önemlidir. Hayvan çalışmalarında kalıcı sapması, ilave olarak, diğer faktörler anestezi Çeşidi, hayvan pozisyonu (sırtüstü vs eğilimli) ve vücut sıcaklığına (bakınız Şekil 3) de dahil olmak üzere, lazer Doppler perfüzyon görüntüleme (LDP...

Tartışmalar

Belki de bu prosedürde en zorlu aşama femoral venden femoral arter ayrılmasıdır. büyük çaplı ve arterin kıyasla femoral ven daha ince duvarları delmek karşı duyarlılığının artırılması ve cerrahi manipülasyon sırasında yırtılma. ven kesintiye olasılığı PBS ile nemlendirilmiş steril bez kullanarak nemli yara tutarak azaltılabilir. Tüm forseps, keskinleştirilmiş hizalanır ve damar ve çevre dokular hassas işleme izin vermek için aralarında serbest olmasını sağlamak için de önemli...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	Dumoxel
Dumont Style 5 Mini Forceps	Fine Science Tools	11200-14	Inox
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
7 - 0 Silk Suture	Sharpoint	DA-2527N
5 - 0 Coated Vicryl Suture	Ethicon	J463G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11053-10
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Artifical Tears Ointment	Rugby Laboratories	0536-6550-91
Surgical Tape	3M	1530-0
Fine Cotton Swabs	Contec	SC-4
Temperature Controller	Physitemp	TCAT-2DF
Ameroid Constrictors	Research Instruments SW	MMC-0.25 x 1.00-SS
Hot Bead Sterilizer
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific	39DP
Needle Driver	Fine Science Tools
Phosphate Buffered Saline	Gibco	10010-023
Moor LDPI	Moor Instruments	moorLDI2
moorLDI Measurement software	Moor Instruments	v. 6.0
Hair Removal Cream	Nair