Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Özet

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Özet

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Giriş

Floresan mikroskobu uzun zebrabalıkları MSS transgenlerin, kalkınma ¹ özellikle etkileri etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi beyin gelişimi, kas üretimi, ve diğer birçok gelişimsel olayların ² katılan hücresel süreçlerin detaylı haritalama izin verdi. Tek bir hücrenin ölümünü incelenmesi esas olarak standart görüntüleme işlemleri sırasında seçici hücre ölümünü teşvik teknik zorluklar, daha zor olmuştur. Ancak, tek hücreli çözünürlükte görüntüleme ve yüksek hedefli ablasyon tekniklerinin birleşimi sonucu hücre-hücre etkileşimleri yanı sıra, stres ve yaralanma anında hücresel yanıtları soruşturma sağlar. Bu süreçlerin daha iyi anlaşılması, özellikle, nöron glia etkileşimleri ilerlemesine katkıda bulunduğu gösterilmiştir motor nöron hastalığı (MSB), nörodejeneratif hastalıklar, kritikHastalığın ^3.

MSB, ya da Amyotrofik lateral skleroz (ALS), beyin sapı, motor korteks ve omurilikteki motor nöronlarını etkileyen yıkıcı bir nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu nöronların kaybı, kas kaybına yol açar ve hastalar 3 içinde ölür - tanı ⁴ 5 yıl. kas lifleri omurilik renkli motor nöron ve kas kasılması kolaylaştıran bir rol oynamaktadır. Bu nöronların bu iletişim veya ölüm başarısızlığı giderek kasları zayıflatır ve yutmak yürümek, konuşmak ve nefes hastanın yeteneğini etkiler. canlı bir hayvanda bir motor nöron ve kısa vadeli sonuçların ölümünü görselleştirme daha normal hücre homeostazında ve hastalıkta rol dinamik süreçleri anlamak için mükemmel bir fırsat sağlar.

Balığı nörodejeneratif hastalıklar ¹ çalışma için cazip bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. BuBu dış döllenme kısa gelişim süresi, sinir sistemine bir optik erişim ve transgenesis kolaylığı gibi, bu model organizma sunduğu avantajlardan kaynaklanmaktadır. Buna ek olarak, kolay bileşiği, transjenik zebrafish oluşturma yeteneği, farklı hücre tipleri çok markalama stratejileri sağlar. Genetik ablasyon spesifik hücre tipleri oldukça geniş rahatsızlık verir, ancak tek tek hücrelerin ⁵ hedefleme iyi denetim eksikliği öldürmek için yaklaşımlar. Lazer destekli teknikleri, diğer taraftan, ince geçici ve aralıklı kontrolünün sağlar ve farklı hayvan modellerinde kullanılmıştır. Iken gibi çoğu yaklaşımlar kullanmak özel ekipman, lazer yazıcılarını ^{6, 7, 8, 9, 10, 11, 12} ya da iki-foton set-up'lar ¹³ darbeliaraştırma grupları son zamanlarda geleneksel konfokal mikroskoplar ¹⁴ UV lazer avantajı almış.

Burada anlatılan teknik, seçilen motor nöronlarda doza bağlı bir şekilde hücre stres veya ölüme neden UV lazer kaynaklı yaklaşım yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi birleştirir. Bu, hücre kültüründe ve yaşam hayvanlarda başarıyla test edilmiştir yaygın olarak yüklenmiş 405-nm lazer kullanımına dayanır ve bu nöronal ölümünden sonra mikrogliyal açıklık gibi hücresel etkileşimleri, detaylı karakterizasyonu sağlar.

Protokol

NOT: Hayvan deneylerinde tasarımı, yürütülmesi ve raporlama güncel kılavuzlarda ¹⁵ dikkate almak zorundadır. Böyle bir çalışma, yerel hayvan koruma otorite tarafından önceden onaylanmış olmalıdır (bizim durumumuzda, Macquarie Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Komitesi).

1. Montaj ve UV Hücre Ablasyon için Zebra balığı hazırlayın

1. Zebrafish (Danio rerio) floresan proteinleri ifade oluşturun.
   1. , Zebra balığı ilgi floresan proteinleri ifade Zebra balığı yumurta tek hücreli aşamaya plazmid enjeksiyonları gerçekleştirmek (başka yerde ¹⁶ açıklandığı gibi) ya da floresan transgenik hatları kullanın. Birden fazla hücre tiplerini etiketlemek için, ilgi soruya uygun kurulmuş transgenik hatları geçerek bileşik transgenik zebrafish hatları oluşturmak. Akşamları bir yanlış alt çifti çiftleşme tankının her iki tarafında bir erkek ve bir kadın zebrafish yerleştirin ve ışığın başlangıcı ile bölücü kaldırmak(başka yerde ¹⁷ ayrıntılı olarak) Ertesi sabah. 28 ° C zebrafish tutmak ve kurulan protokolleri ^{17, 18} göre bunları idare.
   2. plastik çay süzgecinden embriyoları içeren tankı suyun süzme başarılı yumurtlama sonrası embriyolar toplayın. Sistem su ile yumurta durulayın ve bir Petri kabındaki yumurta su içine aktarabilirsiniz.
   3. döllenmeyi belirlemek için bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Mağaza bir Petri kabındaki yumurta döllenir ve 28 ° C ¹⁸ bir inkübatör koyun.
2. İsteğe bağlı: Belirli hücre popülasyonlarının etiket bir mikroenjeksiyon gerçekleştirin.
   Not: Bu, stabil transgenik çizgiler yükseltmek gerek kalmadan, ifade ve protein görünüm için izin veren bir alternatif bir yöntemdir. İlgili protein, toksik olan ve dengeli bir trans üretilmesini engeller, bu yöntem de avantajlıdırgen çizgiler.
   1. Başka bir yerde ^{19, 20, 21} tarif edilen şekilde, zebra balığı embriyoların tek hücreli aşamada plazmid yapıları enjekte edilir.
      Not: Bu yöntem, ilgilenilen proteinin mozaik ifadesi ile sonuçlanır. İlgili protein seçim promotöründen yapılır Tol2 çevrili (örneğin, ²⁵ ya da MPEG1 ²⁶ araya ^24, -3mnx1 ^{23 22} islet1) tekrarlar ²⁰ ters.
3. İstenilen büyüklükte balık yaş.
   1. 3 balık yükseltmek - 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) ve floresan bileşik mikroskop altında koyun. Uygun fluorofor ifade hayvanları Ekran ve parlak etiketli balık seçin. Geç gömmek için yumurta su ile başka bir çanak içine uygun larvaları ayırın(28 ° C inkübatör deposunda) üzerine r.
      İsteğe bağlı: Embriyolar pigmentasyon oluşumunu inhibe 24 saat sonra döllenme (HPF) bir 0.2 mM 1-fenil-2-thioures (PTU) Ringer çözeltisi içine yerleştirilebilir. toksik ve yan fizyolojik, genetik veya morfolojik etkileri olabilir olarak bakım, PTU ile alınmalıdır.
   2. Erken gelişim aşamasında çalışmalar için (<2 dpf), elle keskin forseps kullanarak embriyolar dechorionate. enzimatik olarak yumurta su pronase (2 mg / ml) eklenmesi ve 28 ° C 'de 10 dakika boyunca inkübe edilerek embriyo sayıda Dechorionate.
   3. dechorionation kolaylaştırmak için plastik Pasteur pipeti ile periyodik embriyolar geçirin. embriyoların çoğunluğu yumurta su ile onları birkaç kez yıkayarak kendi chorions ortaya çıkmıştır zaman süreci sonlandırmak.
4. agaroz Zebra balığı gömme için çözümler hazırlayın.
   1. 4 g / L MS222 ekleyerek anestezi solüsyonu hazırlayın (tricaine stok çözeltisi, pH 7.0)Yumurta su içeren bir Petri kabı ilave edildi. 50 mg / ml dozu ile, tavsiye edilen bir başlangıç noktası (Şekil 1A) 'dir.
   2. yumurta suda - (% 1.5 0.8) ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler içine bölmeyin düşük erime agaroz bir stok hazırlayın. Önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğu içinde bir kısım yerleştirin (38-40 ° C) ve bu ayar sıcaklığına gelmesini sağlar (~ 30 dak; Şekil 1B).
   3. İsteğe bağlı: uzun vadeli görüntüleme (> 4 saat) için, 35 mm cam alt Petri kabı içinde küçük bir agaroz daire hazırlamak ve (Ek Şekil 1) ayarlamanıza olanak verir.
      NOT: Bu fazladan adım daha uzun zaman dilimlerinde üzerinde zebrabalıkları ile tüm agaroz damla herhangi bir hareketi önlenmesinde etkili oldu.
      1. Bunu yapmak için, cam alt çanak iç çemberin boyunca agaroz yer ~ 300 uL balık yerleştirmek için hangi ortasında küçük bir açıklığı olan bir halka şekilli daire hazırlamak için (adım 1.5.3; Ek Şekil 1) .
5. mikroskopi için agaroz zebrafish monte edin.
   1. Seç 1 - ablasyon ön elemeden balık 3 ve anestezi solüsyonu ile bir çanak içine (bir transfer pipet kullanarak) onlara aktararak larvaları uyutmak (adım 1.4.1; Şekil 1C, yaklaşık 5 dakika).
      NOT: balıklar sığ solungaç hareketi ve azalmış kalp hızı gösterdiğinizde anestezi ve artık dokunmatik uyarılmış kaçış tepkisi sergilerler (teer; başarısızlık uzakta sonra yavaşça yüzmek bir fırça ile kendi kuyruk dokunmadan). balık etik tedavisi için uygun anestezi sağlamak ve floresan ışığa agaroz veya maruz içine transfer edildiği seğirmesi önlemek için.
   2. Anestezi onaylandıktan sonra (için ~ 30 uL set cut-off 200 mcL ucu ile) ayarlanabilir bir pipet kullanarak bir larva emmek ve ucu dibine çöker edelim. ile sıvı bir damla bırakarak önceden ısıtılmış agaroz (adım 1.4.2) içine larva transferiagaroz içine larva (agaroz girmeden yumurta su miktarını en aza indirmeye çalışın; Şekil 1D).
   3. agaroz çevrili balık emmek. önceden hazırlanmış cam alt 35 mm çanak içine hızlı bir şekilde dağıtın.
   4. Tarafında (solda kafa) böylece vücut ve kuyruk düz (Şekil 1E) agaroz içinde hayvan konumlandırmak için bir diseksiyon mikroskobu ve standart bir boya fırçası (uzun astar, boyut 1) kullanın. Birden çok balık ile çalışan, bunlar daha sonra kolayca konfokal mikroskop kullanılarak bulunan, böylece çanak tüm balık hizalayın.
      NOT: Hızla konumlandırma ve hizalama bu yordamı gerçekleştirmek (agaroz soğuk sıcaklıklara maruz kaldıktan sonra hemen ayarlamak başlar gibi, bazı pratik gerekebilir).
   5. Agaroz sıkıca ayarlanana kadar 15 dakika - 10 agaroz gömülü balık bırakın. Dikkatle ~ 2 mL yumurta su içeren tricaine (Şekil 1F) ile 35 mm Petri kabı kontör.

2. Konfokal Mikroskop ve Görüntüleme parametreleri ayarlama

1. konfokal mikroskop sahnede gömülü larva ile Petri kabı yerleştirin ve (parlak alanını kullanarak) hayvan omurilik dorsal tarafına odaklanmak. Uygun büyütme (40X) ve floresan ayarı altında hayvan inceleyin ve ilgi yapısını görselleştirmek (örneğin, etiketli nöronların veya mikroglial hareketin floresan yoğunluğu) sonraki ablasyonu (Şekil 2) için gerekli tüm görüntüleme parametreleri onaylamak için. Biz rutin zaman atlamalı çalışmalar yapmak 40X objektif kullanın.
2. İsteğe bağlı: birkaç saat boyunca zaman atlamalı çalışma gerçekleştirmek için, bu hücrenin ve çevresinin soğukkanlı fizyolojik yanıtı kurmak için ablasyona tek ya da birkaç zaman noktaları öncesinde kayıt tavsiye edilir (örneğin, mikroglial hareket bazal hız kurmak ve hareketliliği).
3. yapının kalınlığını belirlemekUV lazer ablasyon ilgi ure.
   1. Z-sürücü kullanarak, manuel olarak odaklama ve aşağı tarafından ilgiyle yapısı (örneğin, hücre soma) üst ve alt doğrulayın. Ablasyon edilecek z-düzlemi not edin (örneğin, hücrenin merkezi).
      NOT: deneyim, bu yöntem parlak etiketli omurilik nöronlar (ablasyon sonrası kolay time-lapse görselleştirme sağlayan yüksek sinyal-gürültü oranı, örneğin, Şekil 4) hedefleyerek en etkili ve orta ablasyon ile hücre soma. Hücre çekirdeği floresan doğru hedefleme ve yüksek ablasyon etkinliğini sağlamak için avantajlı olabilir.

3. Lazer Ablasyon Zebra balığı Omurilik Bireysel Hücreler Hedefli gerçekleştirin

NOT: Bu ablasyon ve görselleştirme yaklaşımı için, bir konfokal mikroskop (Leica SP5) kullanıldı. hücreye özel dest için 405 nm diyot kullanarak ablasyon işlemiruction yazılımı (Leica Application Suite, v2.7.3.9723) göre ayrıntılı. Ancak, 405-nm lazer ve sıkı bağlamak (photobleaching sonra floresan kurtarma) ya da ağartıcı modülü ile donatılmış herhangi bir geleneksel konfokal mikroskop ancak potansiyel biraz farklı ayarlar parametreleri ve isimleri ile, aynı hücre manipülasyonlar performansını sağlayacaktır.

1. Yazılım menüsü (Şekil 3A, 1 ve 2) üstündeki açılır menüden üzerine tıklayarak sıkı bağlamak sihirbazını başlatın. Lazer ablasyon için spesifik parametreler kurulumunu izin veren farklı adımlarla yeni bir pencere gözlemlemek (Şekil 3B, 3).
2. Biçimi, tarama hızı (Şekil 3B, 4) seçerek ve ortalamasını alarak ablasyon yaklaşım görüntü parametreleri belirlemek (Şekil 3B, 5). 400 Hz ve bir çizgi tarama hızında 1024 x 1.024 bir resim biçimi4 ortalama en uygun oldu.
   NOT: önceki edinme olarak belirlenmiştir (örneğin uyarma veya emisyon parametreleri gibi) spektral algılama değiştirmeye gerek, genellikle vardır.
   1. (Adım 2.4 açıklandığı gibi.) Ablasyon z-düzlemi zaten seçili değilse, "Canlı" butonuna basın ve floresan yapı veya kesilip olacak istenen z-düzlemi kadar numune ile odak odakta.
3. Genel görüntü parametreleri ayarlandıktan sonra, "Bleach" adımı (Şekil 3C, 6) özel ablasyon bileşenlerini kontrol etmek erişir.
   Not: Lazer yoğunluğunun kombinasyonu (Şekil 3C, 8), tarama hızı ve aşama 3,2 (Şekil 3B, 4 ve 5) 'de ayarlanır tekrarlama, sayısı olarak ayarlanmış olan ortalama 3.5 (Şekil 3E adım12), bu nedenle ağartma verimliliği ROI UV lazer toplam bekleme zamanını belirlemek ve edecektir.
   1. Ağartma prosedürü (Şekil 3C, 8) için aktive ederek 405-nm lazer Engage.
      NOT: - Bizim deney düzeneği içinde% 80 yukarıda belirtilen ayarlarla çoğu başarı 60 arasında 405 nm lazer yoğunlukları ile elde edilmiştir. Bu lazer güç çıkışı enstrüman özgüdür ve her konfokal kurulum için farklı olacağını unutmayın.
   2. Bu nedenle bekleme süresini maksimize tarama alanını azaltarak seçilen ROI ağartma yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için bir seçenek "zoom" (Şekil 3C, 7) kullanın. Alternatif olarak, bu işlem için seçim yazılımı "Bleach noktası" seçeneğini kullanın.
4. Görüntü elde etme rüzgarda çizim araçlarından birini kullanarak ablasyonu için bir ya da birden fazla ROI'leri (Şekil 3B, 10) seçinizOw (Şekil 3D, 9). 8 mikron - yaklaşık 4 dairesel çizim aracı ile, örneğin, akson tepecik hedefleyin.
   NOT: ablasyon alan uygulamaya bağlı olarak daha geniş bir alana tek bir pikselin, ayarlanabilir.
5. ROI kurduktan sonra, "Zaman Kursu" tuşuna (Şekil 3E, 11) seçin ve ROI (Şekil 3E, 12) ablasyon / taranır döngü sayısını onaylayın. ağartma işleminden sonra hemen önce ve hemen tüm görüntünün bir bakış izin istendiği gibi "Ön Bleach" ve "Post-Bleach" kare seçin.
6. Gerekli tüm ablasyon parametreleri, basın "Run Experiment" (Şekil 3E, 13) ve ablasyon etkinliğini izlemek kurduktan sonra.
   NOT: Bizim sıkı bağlamak kurulumunda, tek bir görüntü öncesi ve uygun lazer e sıkı bağlamak devrinden sonra alınacakxcitation (EGFP ifade eden hücreler için, örneğin, 488 nm eksitasyon). Bunlar öncesi ve sonrası ablasyon resimler seçilen ablasyon parametreleri ne kadar tatmin edici ROI ağartılmış ve ne kadar etkili bir hızlı bir yargıya izin verir.
7. Lazer yoğunluğu ayarlanarak tekrarlayın (Şekil 3C, 8), bir tarama hızı ve ortalama (Şekil 3B, 4 ve 5) ve bir durumda tekrar (Şekil 3E, 12) seçilen YG de tamamlanmasından sonra, yüksek floresans yoğunluğunu gösterir sıkı bağlamak çevrimi.

4. "Rescue" veya Bertaraf balık dahil, Takip Prosedürü uygulayın

1. Deney terminali ise, Tricaine aşırı dozda hayvan euthanize. Yumurta suyu çıkarmak ve 10 dakika boyunca anestezi stok solüsyonu ile değiştirin. ötenazi sağlamak için, kalp atışı kesilmesi için mikroskop altında kontrol edin.
2. İsteğe bağlı:Deney terminali değilse, ince forseps ve bir fırça ile agaroz dikkatlice balık çıkarın. Taze yumurta suda balık yerleştirin ve 15 dakika boyunca gözlem altında kurtarmak için izin verir. Normal yüzme davranışı dönerse, inkübatör balık dönün.
3. Kurumun onaylanan GDO'lu atık akımının göre transgenik hayvanlar imha ediniz.

Sonuçlar

Burada tarif edilen yöntem, ticari konfokal mikroskop FRAP modülü kullanılarak zebra balığı omurilikteki motor nöron ablasyon sağlar. Gibi özel promotörlerin kontrolü altında nöronlarda yeşil floresan protein ifade eden bir transjenik zebra balığı hatları - 3mnx1, islet1 veya araya kullanılmıştır. (Örneğin -3mnx1 veya tanıştığımız) motor nöron organizatörü tarafından tahrik GFP ifade hücre gövdeleri, ana akson ve kaslara uzanan çevresel dalları (Şekil 4 ve Video 1) yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar.

3. Başarılı ablasyon olduğunu adımda açıklanan% 70 ~ bir lazer gücü ve genel ayarlarda 80 sn - 3- 5 gün yaşlı balıkların omurilikte Nöronlar başarıyla 60 genel bir bekleme süresi ile ablasyon edilmiştir floresan ablasyonu sonrası hemen kaybolur zaman eldeve asla (Şekil 5, C ve D) devam eder. (Örneğin 488 nm lazer çizgisi gibi) diğer lazer hatları ile ablasyon girişimleri kalıcı solma neden olmadı, ve floresan kısa zaman dilimleri içinde restore edilmiştir. Önemli olarak, bu yöntem, Annexin V varlığında lizozomal dejenerasyon görünen morfolojik değişiklikler ve ablasyon nöron ²⁷ aksonal blebbing UV ablasyon nöronların apoptotik hücre ölümünün karakteristik özelliklerini ortaya koymuştur.

Bu yaklaşımın özgüllük hücresel belirtileri olmadan tek bir hedef sinir dönüştürüldü photoconvertible fluorofor Kaede (yani, UV ışığına maruz kaldıktan sonra yeşilden kırmızıya olan emisyonunu geçer), (Şekil 5 A ve B) kullanılarak yapılan deneyler ile teyit edilir birkaç saat içinde yok. Daha yüksek lazer gücü kullanımı yerine t açarO, kesip çıkarılacak bölgede (Şekil 5, C ve D) yakın hücreler (~ 20 mm) hedeflenen nöron (ölüm olmaksızın) (Resim Fotoçevrim veya floresan yeniden ortaya çıkma) ve Fotoçevrim yok oluşu.

Bu lazer kaynaklı ablasyon tekniğinin önemli bir avantajı yaklaşım doz bağımlılığı. Farklı yoğunluklarda ile hedef hücrelere, ince ayar çok katmanlı (8 Şekil 3C), tarama hızı ve hat ortalama (Şekil 3B, 4 ve 5), ROI boyutu ablasyon için lazer gücünü ayarlayarak kullanılabilir (Şekil 3D, 10) ve tekrar (Şekil 3E, 12). Özellikle, bu yaklaşım aynı zamanda, hücrenin ölümünü teşvik bireysel hücrelerin hücresel stresi uygulamak için kullanılabilir. Örneğin, ince ayar olmuşturBir nöronun ölümüne sırasında hücresel süreçleri değerlendirmek için oldukça değerli. Düşük UV lazer yoğunlukları ile ablasyon yapıldı uzun akson projeksiyonlar motor nöronların karakteristik "blebbing" hedefli soma de başlamış ve zamanla akson boyunca (40 devam etmiştir (oluşumu ve hücresel veziküllerin parçalanması), ortaya - 90 dakika; Şekil 4 ; 3D) video 1 Bu ablasyon filmi render. Sonuç olarak, farklı lazer ablasyon parametreler ve dolayısıyla indüklenen hücre stresi ve ölüm zaman sürecini modüle araştırmacılara deney esneklik, yüksek düzeyde sağlar.

Şekil 1: canlı görüntüleme için zebrafish gömülmesi. (AF) canlı görüntüleme prosedürü gömülmesi: (A) Tricaine zebra balığı A uyuşturan yumurta suya eklenir 50 mg / L ta başlangıç ​​doz oranı. (B), düşük ısıda eriyen agaroz (0,8-1,5%) hazırlanmış ve 38 kadar ısıtılır - 40 ° C. Bir transfer pipeti kullanarak (C), filtrelenmiş ve seçilen zebra balığı tricaine çözeltisi ile bir çanak içine aktarılmaktadır. Başarılı sedasyon sonra, balık önceden ısıtılmış agaroz (D) aktarılır (sığ solungaç hareketi, kalp hızı, dokunmatik uyarılmış yanıt eksikliği azalma). sonraki seyreltme önlemek için agaroz aktarılır yumurta su miktarını en aza indirin. Bir cam alt 35 mm tabak üzerine zebrafish ihtiva eden - (50 uL ~ 30) (E) agaroz bir damla aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirin ve yavaşça tercih yönelimine zebrafish hizalamak için bir fırça kullanın. Agaroz ayarlamak kadar 15 dakika ve çanak (F) tricaine çözeltinin ~ 2 mL ekleyin - 10 bekleyin.ank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: 3-dpf'e zebrafish omurilik nöronların görselleştirilmesi ve mikroglia. 3 günlük eski transgenik zebrafish omurilikte mikroglia ve nöronlar görselleştirme ifade (A) GFP pozitif nöronlar (islet1: GFP) ve (B) mCherry-pozitif mikroglia (MPEG1: GAL4, UAS: mCherry). (C) birlikte parlak alan görüntü ile nöron ve mikroglia kanalının Kompozit görüntü. (C) şematik uç balık yönünü göstermektedir ve sunulan bölgeyi özetliyor. Ölçek çubuğu 30 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: (protokolde tarif edilen, aşama 3), UV lazer ablasyon işleminde Adım. Adımlar konfokal yazılımı (Leica Application Suite) FRAP yazılım modülünü kontrol etmek. (A) UV lazer ablasyon gerçekleştirmek için bir araç olarak sıkı bağlamak modülü başlatılıyor. Lazerin bekleme süresi belirleyecek biçimi, hız ve ortalama alma gibi ablasyon ve diğer sıkı bağlamak ayarları z-düzlemi kurma (B). Lazer yoğunluğu ve ağartma verimliliği maksimize etmek "seçeneği yakınlaş" (C) Kontrol. Ablasyon olacaktır (D) (ROI), bir ya da birden fazla bölgelerin seçimi. Beyazlatma zaman sürecini ayarlanması (E) ağartıcı döngüleri ve ROI de genel lazer bekleme süresini belirler. Onu tıklayınız E bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 4: UV ablasyon nöronun anterograd dejenerasyon. UV-ablasyon spinal nöronun nörodejenerasyonun Time-lapse görüntüleme. (AF), tek bir omurga nöronun UV ışınlaması (buluştu: GAL4, UAS: EGFP; A; daire) aksonal parçalanma, ardından (AC) daralma ve zamanla yuvarlama nöronun soma sonuçlandı (CF; ok başları) . Aksonal dejenerasyon soma (ablasyon sitesi) başlayan ve nihayet, soma floresan kayboldu ve tüm akson "blebbing" (DF) gösterene kadar akson uzak ucuna doğru anterograd ilerledi. Ölçek çubukları 20 mikron =. Bu ablasyon 3D render time-lapse film video 1'de gösterilmiştir.es / ftp_upload / 54983 / 54983fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: Bir motor nöron bir photoconvertible flüorofor (Kaede) ile tek hücreli UV ışıması etkisinin doğrulanması. Bir nöron içinde photoconvertible fluorofor Kaede aktivasyonu yoluyla tek hücreli UV ışınlaması Doğrulama. Kaede ile etiketlenmiş nöronların (AD), UV ışınlama. 10 saniye için% 30 bir lazer gücü ile tek bir nöron (daire) (A) Fotoçevrim sadece hedeflenen tek tek nöron (B) (yeşilden kırmızıya) Kaede bir Fotoçevrim yol açtı. dönüştürülmüş hücre birkaç saat hayatta ve bozulma hiçbir görsel işaretler, örneğin blebbing olarak veya yukarı yuvarlama gösterdi unutmayın. Tek bir nöronun Ablasyon (Cı ; daha yüksek bir lazer gücünün (10 s için% 95) olan bir daire), yaklaşık 20 um'lik bir yarıçaptaki nöronların küçük bir sayı olduğu nöron (D hemen yok olması) ve Kaede sonraki Fotoçevrim sonuçlandı. Ölçek çubukları 20 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Video 1: Şekil 4'te gösterildiği UV ablasyon nöronun 3D yüzey render (Imaris).
Şekil 4'te gösterilen nöron time-lapse video görselleştirme yazılımı (Imaris, Bitplane) kullanılarak işlenen yüzeydir. Bu anterogradely hücrenin uzak ucuna doğru aksonal parçalanma ardından ablasyon soma küçülme sürecini vurgular.euron_ablation-3D_rendered.mov "target =" _ blank "> Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Ek Şekil 1: Uzun süre görüntüleme için isteğe bağlı agaroz döküm.
uzun vadeli satın alma sırasında balık ve agaroz hareketini önlemek için bir donut cam alt 35 mm çanak (A) ortasında kenarları boyunca agaroz şeklindeki daire hazırlar. 10 dakika ~ için agaroz set edelim ve agaroz (B) bir damla iç daire içine balık transfer. katıştırma için agaroz miktarını en aza indirmek (balık yönlendirici sonra dışarıya aşırı agaroz fırça) deneyin. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Tartışmalar

Lazer Ablasyon Yaklaşımlar

Lazer destekli ablasyon teknikleri hücrelerin bireysel ya da küçük gruplar hassas hedefleme sağlar. yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve zebrabalıkları gibi hayvan modellerinde görülen genetik manipülasyonlar ile birleştirme tekniği araştırmacılar sistematik tek bir hücre kaderine ve yaralanma sonrası etkileşimleri çalışma sağlar.

Burada tarif edilen UV (405 nm) lazer ile kesip alma protokolü tek tek hücreler stresli veya öldürülmüş seçici (doza bağlı bir şekilde), nöronlar, glia komşu iken, aksonlar zarar görmeden kalır nasıl özetlenmektedir. Biz başarıyla hücre kültürü deneylerinde bu yaklaşımı kullanılmıştır ve burada Zebra balığı omurilik ayrıntılı bir yaklaşım açıklar var. Biz seçici diğer hücreler (Şekil 5, A ve bir ağ içinde tek bir nöron vurgulayarak Zebra balığı omurilikteki bu yaklaşımın uygulanmasını göstermek B) ya da hemen ve kurtarma olmayan tek bir nöronu öldürerek (Şekil 5, C ve D).

Daha önce, bu tür darbeli azot lazer ya da iki-fotonlu lazer sistemleri gibi özel lazer sistemleri, doku hasarı ve motor sinir transection ^{10, 11, 12, 13} oluşturmak için gereken edildi. Bu lazer sistemleri başarıyla tür arterler ve venler ⁶ tromboz, akut böbrek hasarı ^7, kardiyak hasar ⁸ gibi hücre hasarına, neden ve kalsiyum dalgaları ve beyin hasarı ⁹ sonra mikrogliyal tepkisini incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, Soustelle ve arkadaşları Drosophila ^{14 epitel hasarı ve glial hücreler ikna etmek için geleneksel bir konfokal kurulum (351 nm ve 364 nm UV lazerler) kullanılır/ Sup>.}

ALS Anlamak için Zebra balığı Modeller Uygunluk (ve Diğer İnsan Hastalıkları)

Balığı, özellikle gelişim çalışmalarında ^{28, 29, 30} için, yaygın olarak kullanılan bir model organizma olarak. belli sınırlamalar varken, insan hastalığı modellemek ve patojenik moleküler mekanizmaları bir anlayış vermek için kendi potansiyeli çok büyüktür. Balığı modeller MSB'nin çalışma için iyi kurulmuş ve önemli moleküler Insights ^{31, 32, 33, 34} yol açmıştır. Transgenik zebrafish hatları hızla oluşturulabilir (4-5 ay) ve belirli bir hücre tipi, onları ALS mevcut hayvan modellerinde değerli bir katkı yapmak özelliklerin seçici izleme sağlar. Zebra balığı embriyolar / larva optik şeffaf ve benzersiz bu deneyimlerden teklifbeyin veya kolayca kemirgen modellerinde elde edilen (ya da insanlarda) olamaz omurilik, tek hücre düzeyinde uzun vadeli canlı görüntüleme sağlayan zihinsel avantajları. Bu tür tek hücreli ablasyonu gibi moleküler teknikler ile kombine edildiğinde, bu in vivo kesin moleküler mekanizmaları çalışmak için eşsiz bir deneysel bir platform sağlar.

Motor Nöronlar Seçici UV Lazer Ablasyonunu kullanma Hedefli Olabilir

Zebra balığı spinal nöronlar doğumdan sonraki 10 saat içinde gelişmeye başlar ve sonra yaklaşık 48 saat ^{35 36} kurulmuştur. Bu hızlı gelişme, kısa zaman dilimlerinde ve yüksek verimlilik ile bu nöronların görselleştirme sağlar. Motor nöronlar ALS, motor korteks (üst motor nöronlar), beyin sapı ve omurilik (alt motor nöronlar) etkilendiğini, beyin ve kaslar arasında gerekli bağlantıyı sağlamak ve. Bu nöronların kaybı kaçınılmaz mu yol açarSistemik lupus atrofi ve güçsüzlük. Zebrafish omurilikteki motor nöronlar, ayırt edici projeksiyonları tarafından ve -3MNX1 gibi motor-nöron özel promoterlerin kullanımı ile tespit edilebilir. Bu tür çıkıntı nöronların hücre soma Hedefleme zaman (Şekil 4 ve Video 1) üzerinden aksonal projeksiyon boyunca ileriye dejenerasyon saptandı. Spinal motor nöronlarının Tek hücreli çözünürlüklü görüntüleme ayrıca lazer ablasyon (Şekil 4 ve Referans 27 Ek video 3'e bakınız) sonra fosfatidilserin translokasyon ve buna bağlı olarak Annexin V-etiketleme doğruladı. Bizim UV lazer ablasyon yaklaşımı sonra nöronlar ölüyor içinde Annexin V aktivasyonunu rapor olmasına rağmen bu hızlandırılmış süreçte tetiklenir ölüm kaskad tam nörodejenerasyon veya normal hücre homeostazında sırasında meydana nöron ölümünü eşleştiğini, belli olamaz.

Bu ablasyon yaklaşımı son derece tekrarlanabilir ikenve özel, farklı gömme stratejileri de UV ablasyon verimliliğini etkileyebilir. bizim deneyim, biz bizim balık gömülü agaroz katmanı en aza indirmek için en başarılı oldu. nedeniyle zayıflama ve meydana gelen saçılma etkileri sonuçta hücre tarafından alınan UV gücünü azaltabilir yumurta su ilave tabaka ile orta gömme kalın tabakalar ışın yolu boyunca.

Gelecekte, farklı transjenik balık hatlarının kesiştiği lazerle indüklenen hücre yıkımı için, örneğin glia gibi etkilenmiş hücrelerin, tepkileri (12 saat kadar) anında ve kısa dönem gözlenmesi için izin verir. Örneğin, ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarda astrosit olmayan hücreli bağımsız toksisite araştırması spot edilmiş ve büyük ölçüde düzensiz ve ailesel ALS ^{37, 38} arasında patojenite rol oynar. Bununla birlikte, mekanizma glial toksisite ve seçicilik yatanMotorun doğru nöronlar belirsizliğini koruyor. Biz ve diğerleri son zamanlarda mikroglia tarafından nöronları ölen yutulmasına incelemek için bu yaklaşımın yararlandı ve nöronal kalıntıları ^{27, 39, 40} temizlenmesini görüntülendi.

yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve nöro için işaretleri ile ablasyon tekniği birleştiren gelecekte araştırmacılar tek hücre fonksiyonu ve birbirine pili sistemlerinin anlaşılmasını genişletmek için izin verecektir. In vivo ortamda bu işlemlerin karakterizasyonu gelişim ortamlarda hem de hücresel etkileşimler ³ bozulmuş olabilir ^{MSB, 41} dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların, modellerinde, sadece önemlidir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low melting	Fisher-Scientific		Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8 - 1.5%
Tricaine	Argent Labs	MS-222	0.02%
Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass	World Precision Instruments, Inc.	GC100F-10 (short) GC100F-15 (long)	Pull to a resistance of 2 - 7 MΩ
Egg water			0.6 g Instant Ocean sea salt, 4 mL of 1 mg/mL methylene blue in 10 L deionized water
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
Pronase	Sigma	10165921001
Heat block	Select BioProducts	Digital block heater (SBD110_)
Microinjection apparatus	World Precision Instruments, Inc.		Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation)
Stereoscope	Leica		Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica)
Microscope	Leica	SP5
35 mm glass bottom dish	MatTek Corporation	P35G-0-20-C