JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, akustik uyarılara karşı uyku tepkisini modüle eden, farelerde non-REM uykusunda sinirsel ve kardiyak değişkenlerin zamansal dinamiklerini tanımlamak için deneysel ve analitik prosedürleri sunuyoruz.

Özet

Uyanıklık, hızlı olmayan göz hareketi (non-REM) uykusu ve REM uykusu: Üç ihtiyatlılık durumu memelilerin yaşamına hâkim. Serbest hareket eden hayvanlarda davranışın daha fazla sinirsel korelasyonu tanımlandığından, bu üçlü alt bölüm çok basitleşir. Uyanıklık sırasında, küresel ve lokal kortikal aktivitelerin toplulukları, pupil çapı ve sempatovagal denge gibi çevresel parametrelerle birlikte çeşitli derecelerde uyarılma tanımlar. Uykunun da beyin devletlerinin bir sürekliliğini oluşturduğu belirsizliğini koruyor; duyusal uyaranlara ve uyanmaya eğilimli olma derecesine ve belki de diğer uyku işlevlerine kademeli olarak değişen ve periferal fizyolojik durumların nasıl değiştiği. Uyku esnasında birden çok parametrenin izlenmesine yönelik yöntemlerin geliştirilmesi ve bu işlevsel niteliklerin takımyıldızlarına atıf yapılmasının araştırılması, uykudaki uyumu çok işlevli bir süreç olarak inceltmenin merkezinde olup, bunun sonucunda pek çok faydalı etki önceden bulunmalıdırecuted. Uyku durumlarını karakterize eden yeni parametrelerin belirlenmesi, uyku bozukluklarında yeni teşhis yollarına fırsatlar açacaktır.

Standart polisomnografik kayıt teknikleri kullanılarak elektroensefalogram (EEG) / elektrokortikogram (ECoG), elektromyogram (EMG) ve elektrokardiyogram (EKG) sinyallerinin birleşik izleme ve analizi vasıtasıyla fare olmayan REM uyku durumlarının dinamik varyasyonlarını tanımlamak için bir prosedür sunmaktayız. Bu yaklaşımı kullanarak, fare olmayan REM uykusunun, harici uyaranlara yüksek ve düşük kırılganlık aralıklarıyla 25 sn aralıklarla eşzamanlı sinir ve kalp salınımları döngüleri halinde düzenlendiğini bulduk. Bu nedenle, merkezi ve otonom sinir sistemleri, konsolide non-REM uykusu sırasında davranışsal olarak farklı uyku durumlarını oluşturmak üzere koordine edilir. Biz, serbestçe uyku fareindeki bu döngüleri izlemek için polisomnografi ( yani EKG ile birlikte EEG / EMG) izlem için cerrahi manipülasyonlar sunuyoruz, quanti için analizDinamikleri ve uyanma olasılıklarındaki rollerini değerlendirmek için akustik uyarı protokolleri. Yaklaşımımız insan uykusuna zaten genişletilmiş ve memelilerde REM dışı uyku durumlarının ortak düzenleyici ilkelerini ortaya çıkarmayı vaat ediyor.

Giriş

Memeli uykusu, dinlenme davranışsal bir halidir ve çevresel uyarılara karşı dirençlidir. Bu belirgin tekdüzeliğe rağmen, polisomnografik ve otonomik parametreler, uykunun çeşitli temporal ve mekansal ölçeklerde niteliksel ve niceliksel olarak farklı sinirsel ve somatik durumlar arasında hareket ettiğini göstermektedir 1 . On dakika sonra onlarca dakika REM ve REM uyku modu arasında geçiş olur. REM uykusu, EEG'de büyük amplitüd, düşük frekans aktivitesi ve yaklaşık 0.5-4 Hz civarında bir spektral zirve eşliğinde bulunurken, REM uykusu teta bandında (6-10 Hz) düzenli EEG aktivitesini gösterir Kas atoni 2 . REM dışı uykuda, insanlar ışıktan (S2) ve derin yavaş dalga uykudan (SWS) dönerler. Bunların adlandırma anlaşıldığı gibi, bu iki aşama daha düşük gösterir ve daha yüksek uyarılma, sırasıyla 4, 3 eşikleri ve bunlar düşük frequ yoğunluğu yönünden farklılıkYavaş dalga aktivitesi (SWA; 0.75 - 4 Hz) olarak adlandırılan kortikal EEG gücünü saptayın. Düzensizlik, S2 ve SWS'nin bireysel sezişleri boyunca, dakikadan saniyeye kadar zaman ölçeğinde devam eder ve SWA'nın değişken varlığı ile 5 , 6 sezonu boyunca kapsamlı olarak belgelenmiş olduğu gibi, aynı zamanda EEG ve alan potansiyel ritimleri ile de belgelenmiştir Sigma bandında (10-15 Hz) ve gama ritimlerinde (80 - 120 Hz) iş mili dalgaları da dahil olmak üzere daha yüksek frekanslar (bir inceleme için bkz. 7 , 8 , 9 , 10 ).

İnsanlardaki uyku kortikal durumunu, ince olmaktan ziyade spektrumun uç noktalarına kaydırır. REM dışı uyku için bunlar SWA'nın baskınlığından yaklaşık uyandırma benzeri aktiviteye kadar geniş bir aralıkta yüksek frekanslı bileşen 11 , 12 . Kemirgenler ve kedilerde, REM dışındaki uyku aşamasına bölünmese de, ara uyku (IS) olarak adlandırılan kısa bir süre REM uykusu başlangıcından 13 önce ortaya çıkar. Sırasında, iki uyku arasında bir karışımı gösteren, hipokamp teta aktivitesi ve ponto-geniculo-oksipital dalgalar, örneğin mil dalgaları ve SWA olmayan REM uyku imzalar, hala mevcut olsa da, başlatmak olarak REM uykusu özellikleri, 15, 14 belirtmektedir. Yine de, antidepresanlar 16 tarafından modüle edildiğinden ve önceki uyanma esnasında yeni nesne sunumu vasıtasıyla işlevsel olarak ayırt edilebilir 17 ve uyarılma eşiğinin ayarlanmasına katkıda bulunur 18 . Dahası, serbestçe hareket eden sıçanların EEG ve EMG parametrelerinin durum uzayı grafikleri, REM olmayan uyku, REM uykusu ve uyanıklık arasında kesintisiz 14 noktaların bir kümesini göstermektedir. SWA'da, uyanıklık ya da REM uykusuna girmeden, 14 , 19 ve 20 numaralı konsolide olmayan bir REM uykusu sırasında düşük frekans bileşenlerinin ve yüksek frekans bileşenlerinin göreli varlığında önemli dalgalanmalara neden olan sporadik düşüşler de vardır. Son olarak, non-REM uykusu sırasında SWA değişken frekansları ve daha yüksek frekanslı ritimler, yalnızca zamanla değil, aynı zamanda kortikal alanlar arasındaki genlik ve senkronizasyonda bölgesel farklılıkları göstermektedir 19 .

Memeli non-REM uykusu üniforma uzaktır. Bununla birlikte, bu tür düzensizliğin işlev ve davranışsal özniteliklerden farklı durumlara yol açıp açmadığı açık değildir. Birkaç uyku bozukluğu türünde, sürekli uyku, kendiliğinden uyanma ve uygunsuz motor davranışı ile bozulur. Dahası, spektral analizler, EEG 21'deki daha yüksek frekansların göreli varlığında değişikliklerVe nefes alma ve kalp atışı oranları gibi otonomik parametrelerde 22 . Dengeli uyku durumlarının düzenli sırası bozulur ve kortikal ve / veya otonomik uyanış unsurları kontrolsüz bir şekilde girer. Bu nedenle, uyku durumlarının sürekliliğini anlamak, hastalık için muhtemel bir önem taşır. Ek olarak, kentsel çevrede uykunun çevresel gürültüye maruz kalması genel sağlık riskleri ile ilişkilidir ve uyku esnasında artan hassasiyet anlarını belirlemek çok önemlidir 23 .

Uykuda insanlarda davranışsal uyarılma deneyleri, hafif non-REM uykusu (S2 evresi) ve REM uykusu ile karşılaştırılabilir ve daha düşük uyarılma eşikleri 4 gösterirken, SWA baskınlı olmayan REM uykusundan (S3 evresi) uyanmanın en zor olduğunu göstermektedir. Kısa ses uyarılarının kortikal işlenmesi, REM uykusu, S2 ve S3 24 ,25 , bu duruma özgü kortikal aktivite kalıplarının duyusal işlemenin ilk evrelerini modüle ettiğini gösterir. İnsanlarda REM dışındaki uyku için, gürültüye tepki olarak uyanma eğilimi, EEG 26 , 27 , 28'de işmili dalgalarının ve alfa ritimlerinin varlığına göre değişir. Iğ sırasında Talamokortikal ritmisitesi duyusal işleme 7'nin zayıflama katkıda bulunduğu düşünülen her iki talamik ve kortikal seviyelerde geliştirilmiş sinaptik inhibisyonu ile eşlik eder.

Gürültüye karşı dirençli ve hassas dönemler nasıl düzenlenir ve belirleyicileri nelerdir? Hem farelerde hem de insanda nöral ritimlerde kızılötesi yavaş, 0.02 Hz'lik bir salınım tespit ettik. Bu 0,02 Hz'lik salınımın fazına bağlı olarak, fareler harekete geçiren uyarılara değişken uyarı gösterdi, uyanma ya da uyumaGürültü. İlginç olarak, bu salınım otonom sinir sistemi, harici uyaranlara 1 Sleep'in açığına modülasyonu katılır belirten kalp atışı oranı ile doğru orantılıydı. Hafıza ile ilgili hipokampal ritimler de bu ritim içinde organize edildi ve en çarpıcı biçimde, gücünün insanlardaki bellek konsolidasyonunun kalitesi ile korelasyona girdi. 0.02 Hz salınım, çevreye duyarlılığı ve dahili bellek işlemeyi modüle eden, kemirgen ve insan olmayan REM uykusunun düzenleyici bir ilkesi gibi görünmektedir. Bu durum, işlevselliğini tanımak ve potansiyel güvenlik açığı alanlarını belirlemek için uyku durumlarının çok parametrik ve sürekli değerlendirilmesine olan ihtiyacı vurguluyor.

Burada, kombinasyon halinde EEG / ECoG ve EMG-EKG ölçümleri için farelerin cerrahi implantasyonu, duyusal uyaranlara maruz kalma,Analiz rutinleri. Bu prosedür, uykuyu farklı temel uyku fonksiyonlarının ard arda yürütülürken sürekli olarak değişen ancak son derece organize edilmiş uyanıklık hali olarak görüntülemek için bir temel oluşturmaktadır. Daha genel olarak, bu prosedür, hem sağlık hem de hastalık hallerinde uyku esnasında davranışsal bir sonucun öncesinde bulunan spektral ve otonom özellikleri elde etmeyi amaçlayan yaklaşımlara uygulanabilir.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Lozan Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi ve Canton de Vaud Hizmet Belgelerinden Sorumlu Mülkiyet Hakları Komisyonu ve Vatandaşlık Hizmetlerine uygun olarak gerçekleştirildi.

1. EEG / EMG-EKG Kayıtlarında Cerrahi

  1. Hayvan barınağı ve seçimi.
    1. Hayvanlar (C57Bl / 6J, 7 - 9 hafta, 25 - 30 g), tek başına barındırılan ve standart koşullar altında (% 40 nem, 22 ° C), yiyecek ve suyla 12: 12 saatlik bir karanlık / ışık döngüsünde tutun Mevcut ad libitum .
    2. Uykuda hormon döngüsünün tüm etkilerinden kaçınmak için yalnızca erkek denekler kullanın.
  2. Elektrodların hazırlanması.
    1. ~ 0.5 cm uzunluğunda altın tel (% 75 Au,% 13 Ag ve% 12 Cu; çap: 0.2 mm) kullanarak bir altın üstüne lehimlenmiş EEG / ECoG elektrotları (adım 1.3.11'de kullanılır) oluşturun -plated çelik vida (3 mm uzunluk, tabanında 1.1 mm çap; Figür bkzE 1). Her bir hayvan için 2 EEG elektrot hazırlayın ve% 70 etanol içinde temizleyin.
    2. EMG-EKG elektrotlarını 3-4 cm uzunluğunda altın telleri (% 75 Au,% 13 Ag ve% 12 Cu; çap: 0.2 mm) ile hazırlayın. Telleri bir ucundan 1 cm 90 derecelik açı ile bükün ve diğer ucunda bir bobin (1-2 mm ø) hazırlayın ( Şekil 1 ). İki uç arasına, serebellum ve lambda arasındaki kemiğin yüzey profiline karşılık gelen küçük bir kavis yaratmak için telin bükülmesini sağlayın.
      1. Hayvan başına 2 EMG-EKG elektrodu hazırlayın.
    3. 6 kanallı dişi-erkek kafa konektörünü hazırlayın (raster: 2,54 mm x 2,54 mm, boyut: 5 mm x 8 mm x 9 mm, pim boyutu: 5 mm; bkz. Şekil 1 ).
      1. Dişi ve erkek pimlerin altındaki konnektörü bantla sarın.
      2. Ameliyat sırasında EEG ve EMG-EKG elektrotlarının lehimlenmesine yardımcı olmak için 6 erkek pinin 4'ünün ucu arasına az miktarda lehimleme teli ekleyin(Bakınız adım 1.3.16).

figure-protocol-2072
Şekil 1 . Fare kafatası üzerindeki EEG ve EMG Elektrot İmplantasyon Alanlarının Şematik Gösterimi.
Kraniyotomi # 1 ve # 2 orta hattan ~ 2 mm lateral, bregma ~ 2 mm rostradan oluşur. Kraniyotomiler # 3 ve # 4, lambda için ~ 2 mm buruklukta bulunur ve sırasıyla orta hatta doğru 4 ve 2 mm'dir. Altın telin altın kaplamalı bir çelik vidanın (# 2 ve # 4) üst kısmına lehimlenerek yapılan iki EEG elektrodu sağ hemisferdedir. Sola vidalar (# 1 ve # 3) destek olarak kullanılır. EMG-EKG elektrotlarının bu 2 destek vidasıyla temas halinde olmamasına dikkat edin. EMG-EKG elektrotları, rostral uçlarında 1 cm üzerinde 90 ° açılarla bükülen 3-4 cm uzunluğunda altın tellerdir ve kaudal uçlarda sargılıdırlar (1 - 2 mm ø). 2 EEG ve 2 EMG elektroduS kesikli çizgilerle gösterildiği gibi bir köşeli pin'e bir kablo lehimleyerek 2 x 3 kanallı kafa konektörüne bağlanır. Bu elektrotlar ve bunların implantasyonu hakkında daha ayrıntılı bilgi bulunabilir 29'da . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

  1. İmplantasyon ameliyatı.
    1. Izofluran indükleyici odasında hayvan anestezisi (4-5% izofluran + O 2 1 de - 4 dakika - 3 fazla 2 litre / dakika). Stereotaksik fiksasyona başlamadan önce odadan fare çıkarırken intraperitonal olarak (ip) 5 μg / g carprofen enjekte edin.
    2. Fare stereotaksik aparatta sabitlemek için standart prosedürleri takip edin. İzofluran anestezisini bir gaz maskesi (1 L / dak'da fiksasyon sırasında% 3 izofluran + O 2) ile koruyun. 37 ° C'de cerrahi boyunca vücut sıcaklığını koruyunIsıtma yastığı.
      1. Vitamin A merhemi uygulayarak kurumadan gözleri koruyun. Pençe geri çekme refleksini test ederek hayvanın cerrahi tolerans seviyesini kontrol edin.
    3. Kulak çubuklarını kafatasındaki kauçuk uçlarıyla değil, ters uçlarıyla (kulak kanallarına girmeden) yerleştirerek kafayı sabitleyin 29 . Kafanın yataylığını sağlamak için ağız çubuğunu (her zamanki gibi) yerleştirin.
      NOT: Fiksasyon, akustik uyarılma deneyleri için önemlidir (bu prosedürün 4. bölümüne bakınız) kulaklardaki hasarı en aza indirir.
    4. Prosedür sırasında hayvanın solunumunu izleyin, bu solunum 2-3 nefes / 2 s'de kalmalıdır. Gerekiyorsa, gaz dağıtıcısındaki izofluran konsantrasyonunu ayarlayın; Ameliyat sırasında azar azar, fiksasyon sırasında% 3'ten prosedürün sonuna doğru% 1.0-1.5'e düşer.
    5. Ultra ince bir insüli kullanarak saat başına 100 uL% 0.9 NaCl enjekte edinHayvan suları tutmak için şırınga.
    6. Hayvan başının parlak bir ışık kaynağı ile aydınlatıldığından emin olun.
    7. Alanı% 70 EtOH ve iyot bazlı dezenfektan ile temizleyin (ıslak kürk saçların cerrahi pencereye girmesini önler).
    8. Adson forseps ile kafatasının merkezinde cildi kaldırın ve ince çizilmiş makas kullanarak cildin kaldırılmış bölümünü orta çizgi boyunca, boynun üstünden gözlerin seviyesine kadar hafifçe kesin. Kafa derisini çıkarın (~ 1 cm anteroposterior, ~ 0.5 - 0.8 cm yanal).
      1. Kafatasının bregma ve lambda fissürlerini açıkça görmek için pencerenin yeterince büyük olduğundan (her iki tarafa doğru) emin olun. Kemiği kullanabilmek için her iki taraftaki deriyi bulldog serrefinesiyle düzeltin.
    9. Konjonktiv dokuyu (periost) dikkatle bir bisturi ile çizerek çıkarın. Alanı iyot bazlı dezenfektan ile temizleyin ve kafese antiseptik bir bezle kurulayın.
    10. Keskin bir neşter bıçağı (boyut 15) kullanarak çizikleriTemizlenmiş ve matlaştırılmış bir kemik yüzeyi elde etmek için kull. Sadece scalpel ucunu kullanarak, oluklar arasında ~ 1 - 2 mm'lik bir mesafe ile ızgaralı bir oluk ağını çizin.
      NOT: Bu, adım 1.3.15'te iki bileşenli epoksi yapıştırıcının kafatasına yapışmasını geliştirir.
    11. Belirli noktalarda kafatasında 4 kraniotomi (~ 0.7 mm ø) yapmak için 1/005 matkap boyutlu bir mikro delme aleti kullanın ( Şekil 1 ; ayrıca bkz. Adım 1.3.11.3.). Bir Pasteur pipet kullanarak kemik tozunu havaya uçurun ve antiseptik sürüntülerle kanamayı temizleyin.
      1. Kanama olursa, işlemi tekrar başlatmadan önce tamamen durdurduğundan emin olun. Hemostazı hızlandırmak için hemostatik bir sünger kullanın.
      2. Vida elektrotlarını (kraniotomiler # 2 ve # 4) yerleştirmek için sağ hemisferdeki iki kraniyotomi kullanın.
      3. İmplantın stabilize edilmesini sağlayacak sabitleme vidalarını (kraniotomiler # 1 ve # 3) eklemek için sol hemisfer üzerindeki iki kraniyotomi kullanın.
        NOT: Increase içinSe stabilite, 4 vidaya kadar vidalar kullanılmaktadır 29 .
        NOT: Kesin stereotaksik koordinatlar: Her iki hemisferdeki orta hattan 2 mm ve bregma'dan (kraniotomiler # 1 ve # 2) 2 mm rostral, lambda'dan 2 mm rostral ve orta hattan 4 mm lateral sol (kraniyotomi # 3) Lambda'dan 2 mm rostral ve orta hattan 2 mm lateral sağ (kraniyotomi 4). Bkz. Şekil 1 .
    12. Sol hemisferde, destek için kranyotomilerden altın kaplamalı iki vidayı sıkın.
      1. Vidayı bir hemostatik kelepçe ile sabitleyiniz ve kraniyotominin üzerinde dikey olarak tutunuz. Kraniyotomi üstündeki vidanın altına dikkatlice yaklaşın. Dikey konumdan sapmamak için döndürün.
        NOT: Altta yatan doku 25 üzerindeki basıncı en aza indirirken iyi mekanik stabilite ve yüksek kaliteli sinyaller elde etmek için yalnızca 1,5 rotasyon yeterlidir.
      2. Sağda, vidayı sıkıştır(1.2.1. Adımda açıklanmıştır) kraniyotomiler vasıtasıyla hazırlanmıştır.
    13. Forseps yardımı ile dikkatlice boyun kaslarından cilt sınırını kaldırın. EMG-EKG kablolarını sarılı uçları kasların içine (sol ve sağ) takın. Orta kısımları kafatasına tutkal edin, böylece sol EMG-EKG posterior sol demirleme vidasının yanında çıkar, sağ EMG-EKG ön sol demirleme vidasının yanına yerleştirilir.
    14. Uyku esnasında kalpten gelen EKG sinyallerinin algılanması için EMG-EKG kablolarının ~ 0.8 - 1 cm derinliğe kadar kas içine sokulduğundan emin olun; halka uçları olabildiğince birbirinden uzaklaşır.
    15. İki bileşenli epoksi tutkalı ile kaplanmış bir spatula kullanın ve tutkalları kafatasına vidaların arasında ve etrafında tutturun. Işık altında kurumasına izin verin, ancak hayvanın gözlerini aşırı şimşekliğinden koruyun.
      NOT: Vidaların tabanları örtülmeli ve sadece teller erişilebilir olmalı, ortaya çıkan frTutkal.
    16. Tutkalın, yüzeyden uzanan iki EMG-EKG elektrotu arasındaki boşluğu doldurduğundan emin olun; böylece, bunlar ile destek vidaları arasında elektrik teması olmaz. Cildi kafatasına yapıştırmamak için titiz bakımı yapın; Tutkalın etrafından dolaşmak için cilt serbest kalmalıdır.
    17. EEG ve EMG-EKG kablolarını tutkalın ~ 0.5 mm dışına çıkacak şekilde kesin. Adım 1.2.3'te hazırlanan konnektörün köşesindeki dört pimi lehimleyin. Tutkaldan çıkan dört telle ( Şekil 1 ).
      1. Bağlayıcı pimleri, implantın yüksekliğini en aza indirgemek için mümkün olduğunca yakın yerleştirmeyi deneyin; Bağlayıcının konumunu koruyan stereotaktik tutacağa tutturulmuş küçük bir timsah klipsi kullanın. Lehimleme ucuyla temas halinde olan zamanı en aza indirin, çünkü bu vidaları hızla ısıtır.
    18. Lehimli parçaları örtmek için tutkal ve konektör arasındaki boşluğu diş çimentosu ile doldurun. Smoo oluşturHayvanların incinebileceği keskin kenarlardan kaçının. Ayrıca, kaşıntıya yol açtığı için cilde dokunmaktan kaçının.
    19. Buldog serpantinlerini çıkarın. Gerekirse, sargıyı ön ve arkasında steril bir dikiş ipliğini (emilebilir dikiş ipliği) kullanarak kapatın ve basit, kesintili kapatma desenleri ve iki kare knot (5-0 FS-3 iğne, 45 cm filament) oluşturun.
    20. Hayvanı tamamen uyanana kadar izleyin. Hayvanı ameliyattan sonra tartın ve toparlanması için eve götürün.
  2. Ameliyat sonrası bakım ve sisteme bağlantı.
    1. Hayvanı her gün bir hafta boyunca izleyin. Kilo kaybı, azalan veya anormal aktivite ve enfeksiyon bulguları arayın. Veterinerlik otoriteleri tarafından belirlenen puanlama prosedürünü izleyin.
    2. Ameliyattan 5-6 gün sonra, kayıt kablosunu hayvanın baş konektörüne bağlayın ve ev kafesine bırakın. Kayıtçının başlamasından önce 4-5 gün bekleyin.Böylece hayvanın rahatsızlığa alışması ve doğal olarak uyur.

2. Uyarı Durumunun Belirlenmesi İçin EEG / EMG-EKG Verilerinin Temel Skorlaması

  1. EEG ve EMG-EKG verilerini, ticari bir polisomnografik yazılım ( örneğin, Somnologica, SleepSign veya Sirenia) ile 48 saat boyunca kaydedin. 2.000x kazanç gibi tipik ayarları kullanın; Edinimde 2.000 Hz'lik örnekleme hızı, edinimden sonra 200 Hz'e örneklenmiş; Ve EEG için 0.7 Hz yüksek geçiren filtre ve EMG-EKG için 10 Hz yüksek geçiren filtre.
  2. Verileri ".edf" dosya biçiminde dışa aktarın.
  3. ".edf" dosyalarını, her 4-s çağının uyanık, REM dışı uyku, REM uykusu ve REM uykusu gibi özelliklere göre yarı otomatik olarak sınıflandırdığı , özel olarak yazılmış ( örn., Matlab'da) bir yazılımla açın.
    NOT: Alternatif olarak, kullanılabilir yarı otomatik birkaç puanlama yazılımı vardır. Bu prosedür, puanlamayı ayarlamak için yapılması gereken bazı temel adımları açıklar wBurada kullanılan puanlama yazılımı ile; Diğer yarı otomatik skorlama sistemleri diğer parametrelere dayanabilir.
  4. Yazılımı kullanarak, ".edf" dosyalarını 4 saat 12 saatlik kayıtlardan ayırın.
    1. EEG sinyalinde bulunan EMG -ECG aktivitesinden veya atanamayan bir davranışsal durumdan kaynaklanan eserleri kaldırın 1 , 29 .
    2. Sırasıyla EEG ve EMG-EKG izlerinden gelen 12 saatlik kayıt boyunca mutlak EEG (EEG ortalaması ) ve EMG (EMG ortalama ) değerlerinin ortalamasını hesaplayın.
    3. Her 4-s çağının ortalama EEG / EMG değerlerini belirleyin (EEG Epoch / EMG Epoch ).
    4. EEG Epoch ortalaması ve EMG Epoch > EMG ortalaması ve EEG Epoch > EEG ortalaması ve EMG Epoch ortalaması alındığında "REM dışı uyku" olarak tanımlandığında çağları "Uyandır" olarak sınıflandırın .
    5. Yok olan çağları sınıflandırın. Bu kriterleri, önceki ve sonraki çağlara dayanan düzeltici bir algoritma ile atışlarlar.
    6. EEG Epoch ortalaması ve EMG Epoch ortalaması verildiğinde çağları REM uykusu olarak sınıflandırın.
    7. REM dışı uyku sırasında REM uykusundan uyanmadan geçişler, REM uyku bölgeleri ve mikro uyarılar gibi kritik noktaları hassaslaştırın. Dikkatli bir şekilde dikkatli olmasını sağlamak için skorlamayı görsel olarak inceleyin 29 , 30 .
      NOT: Daima son görsel muayene ve skorlamanın doğrulanması gerçekleştirin.

3. EEG ve kalp atışlarında İnfra-yavaş Osilasyon Analizi

  1. Bu analiz için yalnızca ≥ 96 s süren REM dışı uyku atışlarını seçin ( yani, en az 24 çağn 4 sn.); Şekil 2'ye bakınız.
    NOT: Özelleştirilmiş rutinler istek üzerine mevcuttur 1 .
ve_content "> figure-protocol-13827
Şekil 2 . Rahatsızlık Dışı REM Olmayan Uyku Sırasında Sigma Güç Dinamiklerini Belirleme.
( A ) Bir farede hafif fazın ilk 100 dakikasında üst, EEG (siyah) ve EMG-EKG (gri) izleri. Dikkat durumları, ham izlerin üstündeki renkli çubukla gösterilir. Orta, normal bir örnek (> 96 s) non-REM uykusu. Alt, rasgele seçilmiş, 16 sn'lik bir aralıkla alt bölümlerin 4 s'lik çağlara ayrıldığını gösterir. Analizin aşağıdaki aşaması yalnızca bu dört dönem için gösterilir, ancak bout içerisindeki her çağda geçerlidir. ( B ) A'nın alt panelinde gösterilen 4-s çağlardan üretilen en üstteki dört ardışık FFT'ler Sigma bandı (10-15 Hz) kırmızı olarak gölgeli. Kare EMG-EKG sinyalinde mevcut olan R dalgalarını gösteren son devreden sağ üst, sağa 1-inçlik. Altında, zaman çizelgesi Sigma gücü yukarıdaki ilgili spektrumdan çıkarılır. Noktalı çizgiler, gösterim için seçilen REM dışı dört karşılaşmanın öncesinde ve sonrasında güç değerlerinin devamını göstermektedir. ( C ) Dikey kesikli çizgiler arasında yer alan (B) bölümünde gösterilen normalleştirilmiş sigma gücü (kırmızı) ve kalp atışı (BPM'de) (gri) zaman çizelgeleri. Aşağıda, sigma bandındaki (10-15 Hz) ilgili filtrelenmiş EEG sinyali verilmiştir. ( D ) (C) 'de gösterilen sigma güç süresi çizelgesinde hesaplanan FFT'nin sonucu, 0.016 Hz'de dominant bir zirveyi gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

  1. Hızlı Fourier dönüşümleri (FFT) hesaplamalarını kullanarak 4 s'lik kutularda ( Şekil 2 A ve B ) sigma frekans bandı (10-15 Hz) spektral gücü için güç değerlerini çıkarın"> 1.
  2. REM dışı tüm uyku dönemleri için her frekans bölmesindeki değerleri ortalayarak non-REM uykusunun temel spektral gücünü hesaplayın (uyanıklık halleri arasındaki geçiş eserleri ve çağalar bu ortalamanın dışında tutulur). Her bir çağın sigma güç değerlerini, ilgi süresi boyunca REM dışı uyku sırasında sigma bandının ortalama gücüne normalleştirin. Zamana karşı plan yapın ( Şekil 2 C ).
  3. Güç dinamiklerinin ( Şekil 2 D ) 1 titreşim frekansı bileşenlerini ortaya çıkarmak için Hamming pencereleme ile sigma güç süresi çizelgesinin FFT'sini hesaplayın.
  4. REM dışı uyku seanslarının süreleri farklı olduğundan, elde edilen FFT'lerin farklı frekans çözünürlüğüne sahip olduğuna dikkat edin. Çözünürlüğü, en uzun non-REM uykusuzluğundan elde edilen en yüksek değere ayarlamak ve tüm maçların FFT'lerini ortalama olarak hesaplamak için enterpolate edin.
  5. Bu analizlere devam etEEG ve EKG sinyalleri dinamiği arasındaki faz ilişkilerini tanımlar.
  6. R dalgasının tepe algılaması için uygun rutinleri kullanarak, 30 Hz'lik yüksek geçişli filtrelemeden sonra kalp atışı verilerini kareli EMG-EKG sinyalinden ayıklayın.
    NOT: İki ardışık R dalgası arasındaki minimum zaman aralığını 80 ms'ye kadar kısıtlamak, kas seğirmesi nedeniyle arada bir artefaktik tepelerin bulunmasını önlemeye yardımcı olur 1 .
  7. RR aralıklarını ölçün ve her 4'lü santralın dakikada atımlarla (BPM) ortalama kalp atış hızı hesaplayın ( Şekil 2 B ve C ).

4. Gürültüye maruz kalma

  1. Özel yazılı bir yazılım aracılığıyla sesler üretin (örn. Beyaz gürültü). Süreyi 20 s ve yoğunluğu 90 dB SPL'ye ayarlayın (kafes içinde ölçülür). Gürültüyü standart aktif hoparlörler vasıtasıyla çalın 1 .
  2. Ameliyattan sonra, recor için alışkanlık sırasındaDeneysel sesleri rasgele, gün boyunca birkaç kez ve farklı anlarda oynatın 1 .
  3. Deneysel durumda (EEG / EMG / EKG verilerini kaydederken), ışık başlangıcında ilk 100 dakika boyunca sahte rasgele ses çalın (ZT0). Gürültüyü çalmak için aşağıdaki koşulları yerine getirin 1 :
    1. Farenin 40 saniyeden fazla REM uykusunda olmadığından emin olun.
    2. Önceki pozlamanın 4 dk önce gerçekleştiğinden emin olun.
      NOT: Bu, oturum başına ~ 15 pozlama ile sonuçlanır.
  4. Kayıt süresinin başlangıcını ve her bir gürültüye maruz kalmanın başlangıcını işaretleyin. İşlem sırasında, deneyciyi non-REM uykusunun spektral kompozisyonu ile köreltin.
  5. Polisomnografi yazılımıyla tüm verileri elde edin 1 , 29 .

5. Uyku Durumunun Davranışsal Sonuçlara Göre Retrospektif AnaliziGürültüye maruz kalma

  1. EEG / EMG -ECG izlerini, gürültüye maruz kalma zamanları bilgisi olmadan 4-s çözünürlükte elle puanlayın 1 .
  2. EEG / EMG -ECG / gürültü pozlama verilerini ayıklamak için özel olarak yazılmış bir komut dosyası kullanın 1 .
  3. Gürültüye maruz kalma sırasında hem EEG hem de EMG sinyalleri değişmeden kalırsa, uyku olarak puanlayın ( Şekil 3A ). EMG-EKG elektrodunda tespit edilen kas aktivitesi ile birlikte EEG genliği düştüğünde ve EEG frekansı arttığında uyanmayı düşünün ( Şekil 3B ).
  4. Uyarı öncesi dönemde ya da gürültüye maruz kalmanın ilk 4sinde hayvanlarda uyandığım denemeleri yoksayın ( Şekil 3D ).
  5. Uyarılmış başarı oranını, dahil tüm denemelerdeki uyandırma denemelerinin oranı olarak tanımlayın ("Uyanma" ve "Uyuma").
  6. Dahil edilen tüm denemelerde, sigma gücünün dinamiklerini inceleyin.Ön uyarı periyodu ( Şekil 3 E ) 1 .

figure-protocol-19979
Şekil 3 . Gürültünün Başlatılmasına Müdahale Eden Davranışsal Sonuçlar: Temsilci Sonuçlar Analizden Çıkarıldı veya Dışlandı.
( AD ) EEG'nin (siyah) ve gri başlangıçtan önceki 40 saniye boyunca ve mavi-gölgeli alanla temsil edilen 20 s'lik gürültüye karşılık gelen EMG-EKG (gri) sinyallerinin ham izleri. Dikkat durumları renk kodunda belirtilir. Analizde yer alan verileri göstermek için temsilci "Uyku" ( A ) ve "Uyandırma" ( B ) olayları gösterilir. Atılan sonuçlar REM uykusuna geçişler ( C ) ve önceden uyanık bir "Uyandırma" yanıtı ( D ) içeriyordu. Yerleştirmede bir genişleme gösteriliyorREM uykusu için EEG ve EMG-EKG izlerinin karakteristiği yoktur. ( E ) "Sleep-through" (sol) ve "Wake-up" (sağ) olayı sırasında gürült başlangıcından önceki 40 s'lik penceredeki sigma güç dinamiklerinin tipik örnekleri. Sigma bandı için bant üzerinden geçirilen ham EEG izlemesi yukarıda gösterilmiştir. Mavi alan gürültünün başlangıcını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Sonuçlar

Şekil 2 A (üst panel), açıklandığı gibi implante edilen polisomnografik elektrotlar aracılığıyla kaydedilen 100 dakikalık spontan uyku-uyanıklık davranışlarını göstermektedir (bkz. Şekil 1 ). REM dışı uyku başlangıcında EEG ve EMG genliklerinde artış ve azalmalar açıkça görülebilir. Aralıklı REM uykusu, EEG amplitüdünde bir azalma ve EMG tonusunda bu sıkıştırılmış zama...

Tartışmalar

Burada, EEG, EMG ve EKG değişkenlerini bütünleyen REM dışı uykunun sürekli bir zamansal profilini nasıl oluşturacağımızı göstereceğiz. Bu, REM uykusu olmayan 1 sırasında yüksek ve düşük gürültüye karşı düzenlenen daha önce tanınmayan zaman ölçeğini tanımlamaya yardımcı olabilen, fare uykusunun bütünleyici bir tanımını geliştirmeye yönelik ilk adımdır. Benzer bir geçici yapı, insan olmayan REM uykusunda benzer bir analizle tarif edildi

Açıklamalar

Yazarlar, rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Teşekkürler

Bu makalenin yazımına ve özenle okunmasına katkılarından ötürü tüm laboratuar üyelerine teşekkür ediyoruz. Tartışmaları teşvik ettiği için Paul Franken'e, cerrahi protokol hakkında faydalı yorumlar için Dr. Gisèle Ferrand'a ve gürültüye maruz kalma için orijinal Labview çalıştırılabilir dosyalarını sunma konusunda Dr. Jean-Yves Chatton'a minnettarız. Finansman İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (Hibe 31003A_146244 ve 31003A_166318) ve Etat de Vaud tarafından sağlandı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2-components epoxy glueHenkelLoctite EA 3450
Absorbable Suturing Fiber (Prolene)Ethicon5-0 FS-3
Adson ForcepsFST11006-12
Antiseptic swabVWR149-0332
Attane IsofluranePiramalIsoflurane 250mL
Connectors 3 x 2-channelsENA AG2.316Raster 2.54 x 2.54 mm; size 5 x 8 x 9 mm; pin size 5 mm; http://www.ena.ch/
Dragonfly commutatorDragonflyModel #SL-10
EMBLA amplifierEMBLAA10 amplifier
Fine scissorsFST14108-09
Flat Head Gold-plated steel screwJ.I. MorrisFF00CE125https://jimorrisco.com/
Gold wireCMSAT.69 5grhttp://www.cmsa.ch/en/
Hemostatic spongePfizerGelfoam
iodine-based disinfectant (Betadine)Mundipharmastandart solution 60mL
Komet drill steel 1/005PM104UNOR AG22310
Matlab Analysis SoftwareMathWorksR2016bhttps://ch.mathworks.com/products/matlab.html
MicrodrillFine Science Tools96758
Mouse Gas Anesthesia Head HolderKopf InstrumentsModel 923-Bhttp://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/
Ophtalmic ointmentPharmamedicaVITA-POS
Paladur (liquid)UNOR AG2260215for dental cement
Palavit (powder)UNOR AG5410929for dental cement
Small Animal Stereotaxic FrameKopf InstrumentsModel 930http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/
Soldering wireStannol593072
Temperature controller - Mini rectal probePhymep4090502http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/
Temperature controller- heating padPhymep4090205http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/

Referanslar

  1. Lecci, S., et al. Coordinated infra-slow neural and cardiac oscillations mark fragility and offline periods in mammalian sleep. Sci Adv. 3 (2), 1602026 (2017).
  2. Rechtschaffen, A., Kales, A. A manual of standardized terminology, techniques and scoring system for sleep of human subjects. U.S. Department of Health, Education, and Welfare. , (1968).
  3. Blake, H., Gerard, R. W. Brain potentials during sleep. Am J Physiol. 119, 692-703 (1937).
  4. Rechtschaffen, A., Hauri, P., Zeitlin, M. Auditory awakening threshold in REM and NREM sleep stages. Percept Mot Skills. 22 (3), 927-942 (1966).
  5. Achermann, P., Borbély, A. A. Low-frequency (< 1 Hz) oscillations in the human sleep electroencephalogram. Neuroscience. 81 (1), 213-222 (1997).
  6. Aeschbach, D., Borbély, A. A. All-night dynamics of the human sleep EEG. J. Sleep Res. 2 (2), 70-81 (1993).
  7. Astori, S., Wimmer, R. D., Lüthi, A. Manipulating sleep spindles--expanding views on sleep, memory, and disease. Trends Neurosci. 36 (12), 738-748 (2013).
  8. Brown, R. E., Basheer, R., McKenna, J. T., Strecker, R. E., McCarley, R. W. Control of sleep and wakefulness. Physiol Rev. 92 (3), 1087-1187 (2012).
  9. Buzsáki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  10. Rasch, B., Born, J. About sleep's role in memory. Physiol Rev. 93 (2), 681-766 (2013).
  11. Halász, P., Bòdizs, R. . Dynamic structure of NREM sleep. , (2013).
  12. Terzano, M. G., Parrino, L., Spaggiari, M. C. The cyclic alternating pattern sequences in the dynamic organization of sleep. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 69 (5), 437-447 (1988).
  13. Gottesmann, C. Detection of seven sleep-waking stages in the rat. Neurosci Biobehav Rev. 16 (1), 31-38 (1992).
  14. Benington, J. H., Kodali, S. K., Heller, H. C. Scoring transitions to REM sleep in rats based on the EEG phenomena of pre-REM sleep: an improved analysis of sleep structure. Sleep. 17 (1), 28-36 (1994).
  15. Sullivan, D., Mizuseki, K., Sorgi, A., Buzsáki, G. Comparison of sleep spindles and theta oscillations in the hippocampus. J Neurosci. 34 (2), 662-674 (2014).
  16. Vas, S., et al. Differential adaptation of REM sleep latency, intermediate stage and theta power effects of escitalopram after chronic treatment. J Neural Transm (Vienna). 120 (1), 169-176 (2013).
  17. Schiffelholz, T., Aldenhoff, J. B. Novel object presentation affects sleep-wake behavior in rats. Neurosci Lett. 328 (1), 41-44 (2002).
  18. Wimmer, R. D., et al. Sustaining sleep spindles through enhanced SK2-channel activity consolidates sleep and elevates arousal threshold. J Neurosci. 32 (40), 13917-13928 (2012).
  19. Fernandez, L. M. J., et al. Highly dynamic spatiotemporal organization of low-frequency activities during behavioral states in the mouse cerebral cortex. Cereb Cortex. , (2016).
  20. Franken, P. Long-term vs. short-term processes regulating REM sleep. J Sleep Res. 11 (1), 17-28 (2002).
  21. Feige, B., et al. The microstructure of sleep in primary insomnia: an overview and extension. Int J Psychophysiol. 89 (2), 171-180 (2013).
  22. Parrino, L., Halasz, P., Tassinari, C. A., Terzano, M. G. CAP, epilepsy and motor events during sleep: the unifying role of arousal. Sleep Med Rev. 10 (4), 267-285 (2006).
  23. Akinseye, O. A., et al. Sleep as a mediator in the pathway linking environmental factors to hypertension: a review of the literature. Int J Hypertens. 2015, 926414 (2015).
  24. Campbell, K., Muller-Gass, A. The extent of processing of near-hearing threshold stimuli during natural sleep. Sleep. 34 (9), 1243-1249 (2011).
  25. Nir, Y., Vyazovskiy, V. V., Cirelli, C., Banks, M. I., Tononi, G. Auditory responses and stimulus-specific adaptation in rat auditory cortex are preserved across NREM and REM sleep. Cereb Cortex. 25 (5), 1362-1378 (2015).
  26. Dang-Vu, T. T., et al. Interplay between spontaneous and induced brain activity during human non-rapid eye movement sleep. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (37), 15438-15443 (2011).
  27. Elton, M., et al. Event-related potentials to tones in the absence and presence of sleep spindles. J Sleep Res. 6 (2), 78-83 (1997).
  28. McKinney, S. M., Dang-Vu, T. T., Buxton, O. M., Solet, J. M., Ellenbogen, J. M. Covert waking brain activity reveals instantaneous sleep depth. PLoS One. 6 (3), 17351 (2011).
  29. Mang, G. M., Franken, P. Sleep and EEG phenotyping in mice. Curr Protoc Mouse Biol. 2 (1), 55-74 (2012).
  30. Borbély, A. A., Tobler, I., Hanagasioglu, M. Effect of sleep deprivation on sleep and EEG power spectra in the rat. Behav Brain Res. 14 (3), 171-182 (1984).
  31. Jurysta, F., et al. The impact of chronic primary insomnia on the heart rate--EEG variability link. Clin Neurophysiol. 120 (6), 1054-1060 (2009).
  32. Silvani, A., Calandra-Buonaura, G., Benarroch, E. E., Dampney, R. A. L., Cortelli, P. Bidirectional interactions between the baroreceptor reflex and arousal: an update. Sleep Med. , (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

SinirbilimiSay 126SinirbilimuykudavranpolisomnografiEEGEMGEKGuyanmauyku milig spektrumu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır