수면 마우스의 스펙트럼 파워 및 심박수의 저속 역학 정량화

요약

여기, 음향 자극에 수면 반응을 조절하는 생쥐의 비 REM 수면의 신경 및 심장 변수의 시간적 역학을 설명하기위한 실험 및 분석 절차를 제시합니다.

초록

포유 동물의 삶을 지배하는 세 가지 경계 상태 : 깨어 있음, 비 급속 안구 운동 (비 REM) 수면, 그리고 REM 수면. 자유롭게 움직이는 동물에서 행동의 신경 상관 관계가 더 많이 식별됨에 따라이 3 배 세분은 너무 단순 해집니다. 각성 (wakefulness) 동안, 전역 및 국소 피질 활동의 앙상블은 동공 직경 및 교감 신경 균형과 같은 주변 변수와 함께 다양한 정도의 각성을 정의합니다. 수면이 또한 뇌 상태의 연속체를 형성하는 정도는 불분명하며, 그 안에서 감각 자극 및 각성, 그리고 아마도 다른 수면 기능에 대한 복원력의 정도는 점진적으로 변하고 주변 생리 상태는 어떻게 변하는 지 불분명합니다. 수면 중 여러 매개 변수를 모니터링하는 방법을 발전시키고 이러한 기능적 특성의 별자리로 귀결시키는 연구는 여러 가지 유익한 효과가 있어야하는 다기능 프로세스로서 수면에 대한 이해를 개선하는 데 핵심적입니다적응. 수면 상태를 특징으로하는 새로운 매개 변수를 확인하면 수면 장애에서 새로운 진단 방법을 찾을 수 있습니다.

우리는 표준 polysomnographic 기록 기술을 사용하여 뇌파 (EEG) / electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG) 및 심전도 (ECG) 신호의 결합 모니터링 및 분석을 통해 마우스 비 REM 수면 상태의 동적 변화를 설명하는 절차를 제시합니다. 이 접근법을 사용하여 우리는 마우스 비 REM 수면이 외부 자극에 대해 높고 낮은 취약성의 연속 25 초 간격을 생성하는 조정 된 신경 진동 및 심장 진동의 주기로 구성된다는 것을 발견했습니다. 따라서 중추 신경계와 자율 신경계는 통합 된 비 REM 수면 중에 행동 적으로 다른 수면 상태를 형성하도록 조정됩니다. 자유롭게 수면을 취하는 마우스에서 이러한주기를 추적하기 위해 polysomnographic ( 즉, EEG / EMG와 ECG) 모니터링을위한 수술 조작을 제시하고, quanti그들의 역 동성 및 음향 자극 프로토콜을 사용하여 깨어날 확률을 평가합니다. 우리의 접근법은 이미 인간의 수면으로 확장되었으며 포유류에서 비 REM 수면 상태의 일반적인 조직 원칙을 풀어 나갈 것을 약속합니다.

서문

포유류의 수면은 환경 적 자극에 대한 휴식과 회복력의 행동 상태입니다. 이 명백한 균일 성에도 불구하고, polysomnographic 및 자율 매개 변수는 다양한 시간적 및 공간적 척도 ¹ 정성 및 양적으로 다른 신경 및 신체 상태 사이의 수면 이동을 나타냅니다. 몇 분에서 수십 분 동안 비 REM과 REM 수면 사이의 전환이 발생합니다. 비 REM 수면은 뇌파에서 큰 진폭, 저주파수 활동을 수반하며, REM 수면은 세타 밴드 (6 - 10 Hz)에서 규칙적인 뇌파 활동을 보여 주며 근육 atonia ² . 비 REM 수면에서 인간은 빛 (S2)과 깊은 저속 수면 (SWS)을 순환합니다. 그들의 명명에서 알 수 있듯이,이 두 단계는 각각 낮고 높은 각성 문턱 값 ^{3 , 4를} 보여 주며, 주로 낮은 빈도slow wave activity (SWA; 0.75 - 4 Hz)라고 불리는 대뇌 피질의 뇌파 에너지. 비 균일 성은 시합 ^{5 , 6} 의 과정에서 SWA의 다양한 존재에 의해 광범위하게 문서화되어 있기 때문에 분과 초 2 배 시간대에 S2와 SWS의 개별 관찰을 통해 지속되지만 EEG와 현장 잠재 리듬에도 영향을 미친다. 시그마 대역 (10-15 Hz)과 감마 리듬 (80-120 Hz)에서 스핀들 파를 포함하여 더 높은 주파수 (검토를 위해 ^{7 , 8 , 9 , 10 참조} ).

미묘한 변화보다는 인간의 수면 피질 상태를 극단적 인 스펙트럼으로 이동시킵니다. 비 REM 수면, SWA의 우위 상태에서 이러한 범위는 대략 웨이크 같은 활동들은 고주파 부품 ^(11)의 상당 부분을 포함하고 있기 때문 ^{, 12 . 비 REM 수면 단계로 분할되지 않는다 설치류 및 고양이에서는 중간 슬립 (IS)이라는 짧은 기간이 REM 수면 개시 전에 13 나온다. IS 동안, hippocampal theta activity와 ponto-geniculo-occipital waves와 같은 REM 수면 특징이 시작되고 스핀들 파와 SWA와 같은 비 REM 수면 시그니처는 여전히 존재하며 두 수면 상태 14 , 15 사이의 혼합을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, IS는 항우울제 16에 의해 변조되고 이전 깨우기 17 동안 새로운 대상 제시를 통해 기능적으로 구별 될 수 있으며 각성 문턱 설정에 기여합니다 18 . 또한, 자유롭게 움직이는 쥐의 뇌파 및 EMG 매개 변수의 상태 공간 플롯은 비 REM 수면, REM 수면 및 각성 사이에 연속하는 점 14 의 클러스터를 보여줍니다. SWA에는 간헐적으로 쇠퇴하거나 REM 수면을 취하지 않아 합병 된 비 REM 수면 시합 중 저주파 및 고주파 성분의 상대적인 존재가 상당 부분 변동합니다 14 , 19 , 20 . 마지막으로, 비 REM 수면 중에 SWA 및 고주파수 리듬의 가변 비율은 시간뿐만 아니라, 대뇌 피질의 영역 (19) 사이의 진폭과 동기 지역적 차이를 보이지에만 발생한다.}

포유 동물의 비 REM 수면은 획일적이지 않습니다. 그러나 그러한 불균일성이 기능과 행동 특성이 다른 상태로 연결되는지 여부는 명확하지 않다. 수면 장애의 여러 유형에서, 지속적인 수면은 자발적 각성과 부적절한 운동 행동에 의해 방해받습니다. 더욱이, 스펙트럼 분석은 EEG ²¹ 에서의 더 높은 주파수의 상대적 존재의 변화를 보여준다호흡 률 및 심장 박동 비율과 같은 자율 매개 변수 ²² . 안정된 수면 상태의 질서있는 순서는 따라서 교란되고, 피질 및 / 또는 자율 신경 자극의 요소는 통제되지 않은 방식으로 침입한다. 그러므로 수면 상태의 연속을 이해하는 것이 질병과 관련이있을 수 있습니다. 또한, 도시 환경에서 환경 소음에 의해 수면의 동요는이 중요한 수면 ^23시 고조 취약점의 순간을 식별하기 위해 렌더링, 일반 건강 위험과 연관되어 있습니다.

인간을 자고 행동 각성 실험 광 불 REM 수면 (단계 S2) 및 REM 수면 쇼 비교 및 하부 자극 반면 ⁴ 임계 값, SWA 지배 비 REM 수면 (단계 S3)에서 일어나 어려운는 것을 나타낸다. 짧은 소리 자극의 피질 처리는 REM sleep, S2 및 S3 ²⁴ 사이에서 상당히 다르며 ^,(25), 상태 별 피질 활동 패턴 감각의 제 1 프로세싱 단계를 조절하는 것을 나타낸다. 사람의 비 REM 수면의 경우 소음에 대한 반응으로 기상하는 경향은 뇌파의 존재와 EEG ^{26 , 27 , 28} 의 알파 리듬에 따라 다릅니다. 스핀들 중 Thalamocortical 율동성 관능 처리부 ^(7)의 감쇠에 기여하는 것으로 생각된다 모두 시상과 피질 수준에서 향상된 시냅스 저해를 수반한다.

소음에 강하고 잠잘 수없는 잠자는 시간은 어떻게 구성되며 그 결정 요인은 무엇입니까? 생쥐와 인간 모두에서 최근에 우리는 신경 리듬에서 0.02Hz 이하의 느린 진동을 확인했습니다. 이 0.02-Hz 발진의 위상에 따라, 마우스는 외부 자극에 대한 반응성이 가변적이었으며, 깨어나거나 잠자는 동안잡음. 흥미롭게도이 진동은 심박동 수와 상관 관계가있어 자율 신경계가 외부 자극에 대한 수면의 조절에 참여한다는 것을 나타냅니다 ¹ . 기억과 관련된 해마 리듬도이 리듬 내에서 조직되었으며, 가장 두드러지게 그 강도는 사람의 기억력 강화의 품질과 관련이 있습니다. 0.02-Hz 발진은 환경에 대한 민감도와 내부 기억 처리를 모두 조절하는 설치류 및 인간 non-REM 수면의 조직 원리 인 것으로 보인다. 이것은 잠자기 상태에 대한 다중 매개 변수화 및 연속 평가의 필요성을 다시 한번 강조하여 잠재적 인 취약성을 식별하고 기능을 인식합니다.

여기서는 이러한 역학 파형을 추출하는 절차를 제시합니다. 여기에는 EEG / ECoG 및 EMG-ECG 측정, 감각 자극에 대한 노출,분석 루틴. 이 절차는 수면을 지속적으로 다양하지만 고도로 조직화 된 경계 상태로 보는 기본을 제공하며 그 동안 서로 다른 기본 수면 기능이 순차적으로 실행됩니다. 보다 일반적으로이 절차는 건강 상태와 질병 상태 모두에서 수면 중에 행동 결과를 선행하는 스펙트럼 및 자율 특징을 추출하는 것을 목표로하는 접근법에 적용 가능하다.

프로토콜

모든 실험 절차는 로잔 동물 관리위원회 (University of Lausanne Animal Care Committee) 및 서비스 de la Consommation et des Affaires Vétérinaires of Canton de Vaud에 따라 수행되었습니다.

1. EEG / EMG-ECG 기록을위한 수술

1. 동물 주택 및 선택.
   1. 음식물과 물과 함께 표준 조건 (습도 40 %, 22 ° C) 하에서 12 : 12-h 어둡거나 가벼운 사이클에서 동물 (C57Bl / 6J, 7-9 주, 25-30g) 이용 가능한 광고 libitum .
   2. 호르몬주기가 수면에 끼치는 모든 영향을 피하기 위해 남성 과목 만 사용하십시오.
2. 전극 준비.
   1. ~ 0.5 cm 길이의 금 와이어 (75 % Au, 13 % Ag, 12 % Cu, 직경 : 0.2 mm)를 사용하여 EG / ECoG 전극 (단계 1.3.11에서 사용)을 만들고 금 - 도금 스틸 스크류 (길이 3mm,베이스에서 1.1mm 직경, Figur 참조)e 1). 동물 당 2 개의 EEG 전극을 준비하고 70 % 에탄올로 세척하십시오.
   2. EMG-ECG 전극을 3 - 4cm 길이의 금선 (75 % Au, 13 % Ag, 12 % Cu, 직경 0.2mm)으로 준비하십시오. 전선을 한쪽 끝에서 90 cm 각도로 구부린 다음 다른 쪽 끝에 코일 (1 - 2 mm ø)을 준비하십시오 ( 그림 1 ). 두 끝 사이에서, 소뇌와 람다 사이의 뼈의 표면 프로필에 해당하는 작은 곡률을 만들기 위해 와이어를 굽히십시오.
      1. 동물 당 EMG-ECG 전극 2 개를 준비하십시오.
   3. 6 채널 female-to-male 헤드 커넥터 (래스터 : 2.54mm x 2.54mm, 크기 : 5mm x 8mm x 9mm, 핀 크기 : 5mm, 그림 1 참조)를 준비하십시오.
      1. 암수 핀 밑면의 커넥터를 테이프로 덮으십시오.
      2. 6 개의 수 핀 중 4 개의 팁에 소량의 납땜 와이어를 추가하여 수술 중 EEG 및 EMG-ECG 전극의 납땜을 돕습니다.(단계 1.3.16 참조).

그림 1 . EEG 및 EMG 전극 삽입을위한 부위의 도식적 인 표시
Craniotomies # 1과 # 2는 정중선에 ~ 2mm 측면에 위치하고 ~ bregma에 ~ 2mm 주동이. Craniotomies # 3과 # 4는 람다에 ~ 2mm의 위치에 있으며, 각각 정중선의 측면 4와 2mm입니다. 금도금 스틸 스크류 (# 2와 # 4) 상단에 금선을 납땜하여 만든 두 개의 EEG 전극이 오른쪽 반구에 있습니다. 2 개의 왼쪽 나사 (# 1과 # 3)는 지지대 역할을합니다. EMG-ECG 전극은이 2 개의지지 나사와 접촉해서는 안됩니다. EMG-ECG 전극은 3 - 4cm 길이의 금선으로 꼬리 끝에 1cm 이상 90 ° 구부러지고 꼬리 끝에 코일이 감겨져 있습니다 (1 - 2mm ø). 2 개의 뇌파와 2 개의 EMG 전극s는 점선으로 표시된 것처럼 하나의 모서리가있는 핀에 하나의 와이어를 납땜하여 2 x 3 채널 헤드 커넥터에 연결됩니다. 이 전극과 이식에 대한 더 자세한 정보는 ^{29 년} . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 이식 수술.
   1. isoflurane 유발 챔버 (4 - 5 % isoflurane + O ₂ 1 - 2 L / min 3 - 4 분 이상)에서 동물을 마취. stereotaxic 고정하기 전에 챔버에서 마우스를 제거하면 intraperitoneally (IP) 5 μg / g carprofen을 주사.
   2. stereotaxic 장치에 마우스를 고정 표준 절차를 따르십시오. 가스 마스크 (1 L / 분 고정시 3 % 이소 플루 란 + O _2)를 통해 이소 플루 란 마취를 유지하십시오. 37 ° C에서 수술을 통해 체온 유지GA 난방 패드.
      1. 비타민 A 연고를 바르면서 눈이 건조하지 않도록하십시오. paw withdrawal reflex를 검사하여 동물의 수술 내성 수준을 확인하십시오.
   3. 그 평활와 두개골에 귀 바의 위치로 헤드를 수정 역 ²⁹ (귀 운하를 입력하지 않고)보다 오히려 그들의 팁 끝난다. 헤드의 수평을 보장하기 위해 마우스 막대를 (평소와 같이) 위치시킵니다.
      참고 : 고정은 귀의 손상을 최소화합니다. 이는 음향 각성 실험에 중요합니다 (이 절차의 섹션 4 참조).
   4. 시술 중 동물의 호흡을 모니터링하십시오. 호흡은 2 ~ 3 회 / 2 초 동안 유지되어야합니다. 필요한 경우 가스 분배기의 이소 플루 란 농도를 조정하십시오. 수술 중 고정시 3 %에서부터 수술이 끝날 때 1.0 ~ 1.5 %로 조금씩 감소해야합니다.
   5. 초 미세 인슐린을 사용하여 시간당 1 회 0.9 % NaCl을 100 μL 주입동물을 수분 상태로 유지하는 주사기.
   6. 동물의 머리가 밝은 광원에 의해 켜지는지 확인하십시오.
   7. 70 % EtOH 및 요오드 계 살균제로 모서리를 닦으십시오 (젖은 모피로 인해 모발이 수술 창에 들어 가지 않습니다).
   8. Adson 포셉으로 두개골 중앙의 피부를 들어 올리고 목의 꼭대기에서 눈높이까지 정중선을 따라 피부의 들어 올려 진 부분을 미세한 가위로 부드럽게 자릅니다. 두피를 제거하십시오 (~ 1 cm 전후, ~ 0.5 - 0.8 cm 측면).
      1. 두개골의 bregma와 lambda 균열을 명확하게 볼 수 있도록 창문이 충분히 커야합니다 (양쪽을 향해). 뼈에 접근 할 수 있도록 불독 세 파린으로 양측 피부를 고정하십시오.
   9. 메스로 조심스럽게 긁어 결막 조직 (골막)을 제거하십시오. 요오드 기반 소독제로 부위를 닦고 살균 면봉으로 두개골을 말립니다.
   10. 날카로운 메스 블레이드 (크기 15)를 사용하여 s를 긁습니다.깨끗하고 뼈가있는 뼈 표면을 얻을 수 있습니다. 메스 팁만을 사용하여 그루브 사이에 ~ 1-2mm의 거리를두고 격자 모양의 그루브 망을 긁으십시오.
       참고 : 이것은 1.3.15 단계에서 두개골에 대한 2 액형 에폭시 접착제의 부착을 향상시킵니다.
   11. 특정 위치의 두개골에서 4 개의 두개골 (~ 0.7 mm ø)을 수행하기 위해 1/005 드릴 크기의 미세 드릴을 사용하십시오 ( 그림 1 , 1.3.11.3 단계 참조). 파스퇴르 피펫을 사용하여 뼈 먼지를 날려 버리고 소독제로 흘린 모든 것을 닦아내십시오.
       1. 출혈이 발생하면, 치료를 다시 시작하기 전에 출혈이 완전히 중단되었는지 확인하십시오. 지혈 속도를 높이려면 지혈 스폰지를 사용하십시오.
       2. 오른쪽 반구에있는 두 개의 두개골을 사용하여 나사 전극 (craniotomy # 2와 # 4)을 삽입하십시오.
       3. 왼쪽 반구에 두개의 두개골을 사용하여 임플란트를 안정화시킬 고정 나사를 삽입하십시오 (craniotomies # 1과 # 3).
          참고 : increa하려면안정성, 최대 4 개의 고정 나사 사용 ²⁹ .
          참고 : 정확한 stereotaxic 좌표는 : bregma (craniotomies # 1과 # 2), 람다에서 2mstrostral과 정중선 (craniotomy # 3)에서 왼쪽으로 4mm 측면에서 2mm의 주전자에서 양쪽 정중선에서 중간 선에서 2mm, 람다에서 2mm, 중앙에서 2mm 측면으로 오른쪽 (craniotomy # 4). 그림 1을 참조하십시오.
   12. 왼쪽 반구에서 두 개의 금도금 된 나사를 두개골을 통해지지하십시오.
       1. 지혈 클램프에 나사를 고정하고 craniotomy 수직으로 잡고 있습니다. 조심스럽게 craniotomy 상단에있는 나사의 바닥에 접근하십시오. 수직 위치에서 벗어나지 않도록 회전하십시오.
          참고 : 1.5 회전의 하부 조직 ^(25)에 압력을 최소화하면서 우수한 기계적 안정성 및 높은 품질의 신호를 획득하기에 충분하다.
       2. 오른쪽에서 사전을 조입니다.두뇌 절단술을 통해 대단히 준비된 전극 (단계 1.2.1에서 설명).
   13. 집게발의 도움으로 조심스럽게 피부의 경계를 목 근육에서 들어 올리십시오. EMG-ECG 전선을 코일 안쪽 끝이 근육 안쪽 (왼쪽과 오른쪽)에 삽입합니다. EMG-ECG가 앞쪽 고정 나사 옆에 위치하는 동안 왼쪽 EMG-ECG가 뒤쪽 왼쪽 고정 나사 옆에 나오도록 가운데 부분을 두개골에 붙입니다.
   14. 수면 중에 심장에서 심전도 신호를 감지하려면 EMG-ECG 전선이 루프에서 끝까지 가능한 한 멀리 끝까지 ± 0.8-1 cm의 깊이까지 근육에 삽입되어 있는지 확인하십시오.
   15. 두 구성 요소 에폭시 접착제로 덮여있는 주걱을 사용하여 나사 주위와 두개골에 접착제를 바르십시오. 빛에 말려 주되 과도한 번개로부터 동물의 눈을 보호하십시오.
       참고 : 나사의 받침대를 덮어야하며, 와이어 만 접근 할 수 있어야하며, 새는 from 접착제.
   16. 접착제가 표면에서 뻗어나가는 두 개의 EMG-ECG 전극 사이의 공간을 채우므로 접착제와지지 나사 사이에 전기적인 접촉이 없어야합니다. 해골에 피부를 붙이지 않도록 세심한주의를 기울이십시오. 피부는 접착제 주위를 자유롭게 움직여야합니다.
   17. EEG 및 EMG-ECG 전선을 잘라내어 접착제에서 ~ 0.5 mm까지 뻗으십시오. 단계 1.2.3에서 준비한 커넥터 모서리에있는 4 개의 핀을 납땜하십시오. ( 그림 1 ).
       1. 임플란트 높이를 최소화하기 위해 가능한 한 커넥터 핀을 가깝게 두십시오. 커넥터의 위치를 ​​유지하는 stereotactic holder에 부착 된 작은 crocodile clamp를 사용하십시오. 납땜 팁과의 접촉 시간을 최소화하십시오. 납땜 팁이 빠르게 가열되므로 납땜 팁과의 접촉 시간을 최소화하십시오.
   18. 납땜 된 부품을 덮기 위해 접착제와 커넥터 사이의 공간을 치과 용 시멘트로 채 웁니다. smoo 만들기동물에게 상처를 줄 수있는 날카로운 모서리를 피하십시오. 또한, 피부가 닿지 않도록주의하십시오. 가려움증을 유발할 수 있습니다.
   19. 불독 세린을 제거하십시오. 필요하다면 간단하고 중단 된 폐쇄 패턴과 두 개의 정사각형 (5-0 FS-3 바늘, 45cm 필라멘트)을 만드는 커넥터 앞뒤에 멸균 봉합사 (흡수 가능한 봉합사)를 사용하여 상처를 닫습니다.
   20. 완전히 깨어날 때까지 동물을 관찰하십시오. 수술 후 동물의 무게를 재기 위해 회복을 위해 집에 되돌려줍니다.
4. 수술 후 관리 및 시스템 연결.
   1. 일주일 동안 매일 동물을 관찰하십시오. 체중 감소, 감소되거나 비정상적인 활동 및 감염 징후가 있는지 확인하십시오. 귀하의 수의 당국이 수립 한 채점 절차를 따르십시오.
   2. 수술 후 5-6 일 후, 기록 케이블을 동물의 머리 커넥터에 연결하여 홈 케이지에 놓습니다. 레코더가 시작되기 4 ~ 5 일 후에 추가로 기다립니다.동물이 조건에 익숙해 져서 자연스럽게 잔다.

2. 경계 상태 결정을위한 EEG / EMG-ECG 데이터의 기본 점수

1. 상업용 다기능 소프트웨어 ( 예 : Somnologica, SleepSign 또는 Sirenia)를 사용하여 EEG 및 EMG-ECG 데이터를 48 시간 이상 기록하십시오. 2,000x 게인과 같은 일반적인 설정을 사용하십시오. 획득시 2,000 Hz 샘플링 속도, 획득 후 200 Hz로 샘플링 다운, EEG를위한 0.7-Hz 고역 통과 필터와 EMG-ECG를위한 10-Hz 고역 통과 필터가있다.
2. ".edf"파일 형식으로 데이터를 내 보냅니다.
3. awake, non-REM 수면, REM 수면 및 해당 인공물을 반자동으로 반자동으로 분류하는 맞춤 작성된 ( 예 : Matlab의) 소프트웨어로 ".edf"파일을 엽니 다.
   참고 : 또는 반자동 채점 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 이 절차에서는 채점을 설정하기 위해 수행해야하는 몇 가지 기본 단계를 설명합니다.여기에 사용 된 득점 ​​소프트웨어; 다른 반자동 채점 시스템은 다른 매개 변수를 기반으로 할 수 있습니다.
4. 이 소프트웨어를 사용하여 4 시간 12 시간 동안 ".edf"파일을 분리하십시오.
   1. 뇌파 신호 또는 할당이 불가능한 행동 상태 ^{1 , 29} 에있는 EMG -ECG 활동에서 발생하는 인공물을 제거합니다.
   2. EEG 및 EMG-ECG 추적에서 각각 12 시간 동안의 절대 EEG ( _평균 뇌파 _평균 ) 및 _평균 뇌파 (EMG _평균 ) 값을 계산합니다.
   3. 4-epoch (EEG _Epoch / EMG _Epoch )의 평균 EEG / EMG 값을 확인합니다.
   4. EEG _Epoch 평균 및 EMG _Epoch > EMG _{평균 일} 때 "Wake"로 분류하고 EEG _Epoch > EEG _평균 및 EMG _Epoch 평균 일 때 "Non-REM sleep"로 분류하십시오 _.
   5. s가 아닌 신기원을 분류하십시오. 선행 및 후속 에포크에 기초한 정정 알고리즘으로 이들 기준을 만족시킨다.
   6. EEG _Epoch 평균 및 EMG _Epoch 평균 인 경우 REM 수면으로 분류하십시오.
   7. 비 REM 수면에서 깨우기까지의 전환, REM 수면 기 본 및 비 REM 수면 중 미세 각성과 같은 중요한 포인트를 미세 조정하십시오. 시각적으로 득점을 검사하여 경계 태세를 올바르게 결정하십시오 ^{29 , 30} .
      참고 : 최종 육안 검사와 채점 확인은 항상 수행하십시오.

3. 뇌파 및 심장 박동을위한 천천히 진동의 분석

1. 이 분석을 위해서는 96 초 이상 지속되는 비 REM 수면 관찰 만 선택하십시오 ( 예 : 4 초 이상 24 epoch). 그림 2를 참조하십시오.
   참고 : 요청시 사용자 정의 루틴을 사용할 수 있습니다 ¹ .

ve_content ">
그림 2 . 방해받지 않은 비 REM 수면 중 시그마 동력학 결정.
( A ) 한 마우스의 밝은 상 태의 처음 100 분 동안 탑, EEG (검정) 및 EMG-ECG (회색) 추적. 경계 상태는 원시 트레이스 위에 색상 막대로 표시됩니다. 연속적인 (> 96-s) non-REM sleep bout의 전형적인 중간 예. 하단, 무작위로 고른 16 초 간격으로 4 초 신분으로 세분화되어 있음을 나타냅니다. 분석의 다음 단계는이 네 개의 신기원에 대해서만 보여 지지만, 한판 승부에 포함 된 모든 신기원에 유효합니다. ( B ) A의 하단 패널에 표시된 4 초마다 4 개의 상위 FFT가 생성됩니다. 시그마 밴드 (10-15 Hz)는 빨간색으로 표시됩니다. 오른쪽 상단, 제곱 된 EMG-ECG 신호에있는 R- 파를 보여주는 마지막 에포크로부터의 1-s 삽입. 아래, 시간 코스 Σ 파워는 위의 해당 스펙트럼에서 추출됩니다. 점선은 디스플레이를 위해 선택된 4 개의 비 REM 관찰 전후의 힘 값의 연속을 나타낸다. ( C ) 수직 파선 사이에 위치한 (B)에 표시된 부분과 함께 정규화 된 시그마 파워 (적색) 및 하트 비트 (BPM) (회색) 시간 코스. 아래는 시그마 대역 (10-15 Hz)에서 필터링 된 EEG 신호입니다. ( D ) (C)에 표시된 σ 파워 시간 코스에서 계산 된 FFT 결과로 0.016 Hz에서 우세한 피크를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 고속 푸리에 변환 (FFT) 계산을 사용하여 4s 빈 ( 그림 2A 및 B )에서 시그마 주파수 대역 (10-15Hz) 스펙트럼 전력의 전력 값을 추출합니다."> 1.
3. 비 REM 수면에 대한 각 주파수 빈의 값을 평균하여 비 REM 수면에 대한 기준 스펙트럼 전력을 계산합니다 (경계 상태 간의 이슈 및 이음새는이 평균화에서 제외됩니다). 관심있는 기간 동안 비 REM 수면 동안 시그마 밴드의 평균 파워로 각 신기원의 시그마 파워 값을 표준화하십시오. 시간에 따른 플롯 ( 그림 2 C ).
4. 전원 역학의 진동 주파수 성분 (도 2 D)를 ¹ 공개 해밍 윈도우와 시그마 전원 시간 코스의 FFT를 계산한다.
5. 비 REM 수면 관찰에는 다른 지속 시간이 있기 때문에, 결과 FFT는 다른 주파수 해상도를가집니다. 해상도가 가장 긴 비 REM 수면 시합에서 얻은 가장 높은 해상도로 조정하고 모든 시합의 FFT를 평균화합니다.
6. 이 분석을 계속하십시오.EEG와 ECG 신호의 동역학 사이의 위상 관계를 설명합니다.
7. R 파의 피크 검출에 적합한 루틴을 사용하여 30Hz 고역 통과 필터링 후 제곱 된 EMG-ECG 신호에서 하트 비트 데이터를 추출합니다.
   참고 : 두 개의 연속적인 R 파 사이의 최소 시간 간격을 80 ms로 제한하면 근육 경련으로 인해 가끔 인공적인 봉우리가 포함되는 것을 방지 할 수 있습니다 ¹ .
8. RR 간격을 측정하고 4-s 빈마다 분당 비트 수 (BPM)로 평균 심장 박동수를 계산하십시오 ( 그림 2 B 및 C ).

4. 소음에 노출

1. 맞춤형 소프트웨어를 통해 잡음 (예 : 백색 잡음)을 생성하십시오. 지속 시간을 20 초로 설정하고 강도를 90dB SPL (케이지 내부에서 측정)로 설정하십시오. 표준 액티브 스피커를 통해 잡음을 재생하십시오 ¹ .
2. 수술 후, 기록부에 습관이있는 동안딩 조건, 실험 소음을 무작위로, 여러 번 하루 동안 그리고 다른 순간에 재생합니다 ¹ .
3. 실험 조건 (EEG / EMG / ECG 데이터 기록 중)에서는 가벼운 발증 (ZT0)에서 처음 100 분 동안 무작위로 잡음을 재생합니다. 소음을 재생하려면 다음 조건을 충족하십시오. ¹ :
   1. 마우스가 40 초 이상 비 REM 수면 상태인지 확인하십시오.
   2. 이전 노출이 4 분 전에 발생했는지 확인하십시오.
      참고 : 이로 인해 세션 당 ~ 15 회의 노출이 발생합니다.
4. 녹음 시간의 시작과 각 노이즈 노출의 시작을 표시하십시오. 수술 중 비 REM 수면의 스펙트럼 구성에 대해 실험자를 눈이 멀게 유지하십시오.
5. polysomnographic 소프트웨어 ^{1 , 29로} 모든 데이터를 습득하십시오.

5. 행동 결과에 따른 수면의 후 향적 분석소음에 노출

1. 노이즈 노출 시간에 대한 지식없이 수동으로 4-s 해상도의 EEG / EMG -ECG 트레이스 스코어를 계산합니다 ¹ .
2. 맞춤형 스크립트를 사용하여 EEG / EMG-ECG / 노이즈 노출 데이터 추출 ¹ .
3. 노이즈 노출 ( 그림 3A ) 중에 EEG 및 EMG 신호가 변경되지 않은 채 슬립 스루로 기록됩니다. EMG-ECG 전극 ( 그림 3B )에서 감지 된 근육 활동과 함께 뇌파 진폭이 감소하고 뇌파 빈도가 증가 할 때 웨이크 업을 고려하십시오.
4. 사전 자극기 또는 노이즈 노출의 처음 4 초 동안 동물이 일어난 시련을 버리십시오 ( 그림 3D ).
5. 각성 성공률을 모든 포함 된 임상 시험 ( "Wake-up"및 "Sleep-through") 내에서의 임상 시험의 비율로 정의하십시오.
6. 모든 포함 된 시험에서, σ 파워의 동력학을전자 사전 자극 기간 ( 그림 3 E ) ¹ .

그림 3 . 소음 발병에 대한 행동 결과 : 분석에서 제외되거나 제외 된 대표 결과.
( AD ) 노이즈가 발생하기 전과 노이즈가 20 초 동안 나타나는 40 초 동안 파란색 눈부심 영역으로 표시된 EEG (검은 색) 및 해당 EMG-ECG (회색) 신호의 원시 흔적. 경계 상태는 색상 코드로 표시됩니다. 분석에 포함 된 데이터를 설명하기 위해 대표적인 "Sleep-through"( A ) 및 "Wake-up"( B ) 이벤트가 표시됩니다. 폐기 된 결과에는 REM 수면으로의 전이 ( C )와 조숙 한 "Wake-up"반응 ( D )이 포함되었습니다. 삽화는 창피를 보여준다.REM 수면에 특징적인 EEG 및 EMG-ECG 추적의 일부분을 표시합니다. ( E ) "Sleep-through"(왼쪽) 및 "Wake-up"(오른쪽) 이벤트 동안 노이즈가 발생하기 전의 40 초 창에서의 시그마 동력학의 전형적인 예입니다. 시그마 대역에 대해 밴드 패스 필터링 된 원시 EEG 추적이 위에 나와 있습니다. 파란색 영역은 노이즈가 발생 함을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

도 2 A (상부 패널)에 기술 된 바와 같이 전극을 통해 주입 수면 다원 기록 자발 슬립 웨이크 동작 100 분 뻗어을 나타낸다 (도 1 참조). 비 REM 수면 시작시 EEG 및 EMG 진폭의 증가 및 감소가 명확하게 표시됩니다. 간헐적 인 REM 수면은 EEG 진폭이 감소하고이 압축 된 시간 눈금에서 보이지 않는 EMG 톤이 더 감소 함으로 표?...

토론

여기서는 EEG, EMG 및 ECG 변수가 통합 된 비 REM 수면의 연속 시간 프로파일을 설정하는 방법을 보여줍니다. 이것은 마우스 수면에 대한 통합 설명을 개발하기위한 첫 번째 단계입니다. 비 수면 중 수면 중 잡음에 대한 높은 탄력성과 낮은 탄력성을 구성하는 이전에 인식 할 수 없었던 시간을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다 ¹ . 유사한 시간적 구조는 유사한 분석 ^(1)...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-components epoxy glue	Henkel	Loctite EA 3450
Absorbable Suturing Fiber (Prolene)	Ethicon	5-0 FS-3
Adson Forceps	FST	11006-12
Antiseptic swab	VWR	149-0332
Attane Isoflurane	Piramal	Isoflurane 250mL
Connectors 3x2-channels	ENA AG	2.316	Raster 2.00 x 2.00 mm; size 5x8x9 mm; pin size 5mm; http://www.ena.ch/
Dragonfly commutator	Dragonfly	Model #SL-10
EMBLA amplifier	EMBLA	A10 amplifier
Fine scissors	FST	14108-09
Flat Head Gold-plated steel screw	J.I. Morris	FF00CE125	https://jimorrisco.com/
Gold wire	CMSA	T.69 5gr	http://www.cmsa.ch/en/
Hemostatic sponge	Pfizer	Gelfoam
iodine-based disinfectant (Betadine)	Mundipharma	standart solution 60mL
Komet drill steel 1/005PM104	UNOR AG	22310
Matlab Analysis Software	MathWorks	R2016b	https://ch.mathworks.com/products/matlab.html
Microdrill	Fine Science Tools	96758
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf Instruments	Model 923-B	http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/
Ophtalmic ointment	Pharmamedica	VITA-POS
Paladur (liquid)	UNOR AG	2260215	for dental cement
Palavit (powder)	UNOR AG	5410929	for dental cement
Small Animal Stereotaxic Frame	Kopf Instruments	Model 930	http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/
Soldering wire	Stannol	593072
Temperature controller - Mini rectal probe	Phymep	4090502	http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/
Temperature controller- heating pad	Phymep	4090205	http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/