Bakteriyel büyüme kesin, yüksek üretilen iş analizi

Özet

Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji bir sistemleri-düzey olgu olarak anlamak için gerekli. Deneysel manipülasyon ve analitik bir yaklaşım için bir protokol bırakmak kesin, yüksek üretilen iş analizi anahtar sistemleri Biyoloji ilgi konusu bakterilerin büyüme için sunulmaktadır.

Özet

Bakteriyel büyüme, modern mikrobiyal Fizyoloji geliştirilmesi, hem de sistem düzeyinde hücre dinamiği soruşturma merkezi bir kavramdır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bakterilerin büyüme ve genom azaltma ve transcriptome yeniden yapılanma gibi genom-wide olaylar arasındaki ilişkiler bildirdin. Bakteriyel büyüme doğru analiz büyüme bağımlı koordinasyon gen fonksiyonları ve hücresel bileşenleri anlamak için önemlidir. Buna göre bir yüksek-den geçerek şekilde Bakteriyel büyüme kesin kantitatif değerlendirilmesi gereklidir. Ortaya çıkan teknolojik gelişmeler Bakteriyel büyüme çalışmak için kullanılan yöntemlerin güncelleştirmelere izin yeni deneysel araçları sunar. Burada sunulan Protokolü Mikroplaka okuyucu dağlık iyimserlik deneysel bir işlem tekrarlanabilir ve hassas değerlendirme bakterilerin büyüme ile istihdam etmektedir. Bu iletişim kuralı birkaç büyüme değerlendirmek için kullanılan daha önce açıklanan Escherichia coli suşları. Protokol ana adımları aşağıdaki gibidir: çok sayıda küçük şişeleri hisselerinde hücre hazırlık tekrarlanabilir sonuçlar, 96-şey plakaları kullanım için yüksek üretilen iş büyüme değerlendirme ve iki büyük el ile hesaplama ile tekrarlanan testler için parametreleri (örneğin, maksimal büyüme oranı ve nüfus yoğunluğu) büyüme dinamikleri temsil eden. İle karşılaştırıldığında hangi cam tüplerde bitti Ağar kaplamalar zamanında kültürlü hücreleri sayar, geleneksel koloni oluşturan birim (CFU) tahlil, mevcut yöntemi daha etkilidir ve büyüme değişiklikleri daha ayrıntılı geçici kayıt sağlar, ancak bir daha sıkı sahiptir düşük nüfus yoğunluğu algılama limitte. Özet olarak, açıklanan yöntemi kesin ve tekrarlanabilir yüksek üretilen iş analizi kavramsal sonuçlara ulaşmak için veya teorik gözlemler yapmak için kullanılabilir Bakteriyel büyüme için avantajlıdır.

Giriş

Mikrobiyolojik çalışmalar genellikle bakteriyel hücre kültürü ve bakteri fizyolojisi^1,2,3temel bir fenomen temsil Bakteriyel büyüme eğrileri değerlendirilmesi ile başlar. Bakteri kültürü bir temel metodoloji olduğundan temel kültür ilkeleri yaygın olarak Yayınlanan araştırma edebiyat ve ders kitapları mevcuttur. Tezgah düzeyinde önemli dikkat geleneksel büyüme medya en iyi duruma getirme ve koşullar kültür üzerinde yoğunlaştı ancak büyüme hızını denetleme, hangi büyük olasılıkla mikrobiyal fizyoloji, daha büyük anlayış sağlayacak olmamıştır ⁴yaygın olarak okudu. Katlanarak bakteri için hücresel devlet anahtar parametresini genom, transcriptome ve Proteom^{5,6,7,8 ile koordineli olduğu bildirilen büyüme oranı büyüyor} . Böylece, Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji anlamak için önemlidir.

Bakteriyel büyüme değerlendirmek için biyokütle tahmin etmek için kullanılan deneysel yöntemleri de kurulan^9,10 ve optik bulanıklık gibi biyokimyasal, fiziksel veya biyolojik parametreleri algılama temel alır. Buna ek olarak, büyüme değişiklikleri dinamik özelliklerini yakalamak için kullanılan analitik yöntemleri yaygın olarak kurulan doğrusal olmayan modelleri^11,12,13, örneğin, lojistik denklemler temel alır. Büyüme dinamikleri genellikle hücre büyüme kültür zamanlanmış örnekleme tarafından optik bulanıklık ölçüm veya koloni oluşturan birim (CFU) deneyleri performans elde edilir. Bu kültür ve algılama yöntemleri sınırlandırılması veri noktaları nüfus dinamikleri gerçek bir yansımasıdır ölçüm aralıkları genellikle saat içinde olduğu için ve çünkü değildir kültür durumu (örneğin, sıcaklık değişiklikleri ve Havalandırma) örnekleme anda bozulmuştur. Kültür ve analiz teknikleri teknoloji ve anlayış son gelişmeler kullanarak güncelleştirilmiş olması gerekir. Mikroplaka Okuyucular son gelişmeler bakterilerin büyüme gerçek zamanlı gözlem izin ve işçilik maliyetleri önemli ölçüde azaltabilirsiniz. Bu gelişmiş cihazlar kullanarak, Bakteriyel büyüme üzerinde son çalışmaları için yüksek üretilen iş ölçümleri^14,15analitik yöntemleri bildirdi.

Bu iletişim kuralı, hassas büyüme dinamikleri sonuçta nasıl büyüme oranı belirlenir ve büyüme oranı ne etken etkiler sorular adresi nicel çalışmalar için değerli olacaktır yüksek üretilen iş bir şekilde değerlendirmek için amaçtır. Protokol bakterilerin büyüme tekrarlanabilir ve hassas Nefelometri için dikkate alınması gereken tüm faktörler ele alır. Deneysel yöntem ve analiz ana metin ayrıntılarıyla açıklanmıştır. Bu yöntem Bakteriyel büyüme kesin ve tekrarlanabilir analizini bir yüksek-den geçerek şekilde izin verir. Microbiologists bu iletişim kuralı ek nicel sonuçları onların deneysel kanıt türetmek için kullanabilirsiniz. Bu iletişim kuralı kavramsal sonuçlara ulaşmak için veya büyüme teorik bir bakış elde etmek için çalışan sistemleri Biyoloji çalışmaları için de kullanılabilir.

Protokol

1. büyüme orta hazırlama

Not: en az orta M63 kimyasal bileşimi gibidir: 62 mM K ₂ HPO ₄, 39 mM KH ₂ PO ₄, 15 mM (NH ₄) ₂ SO ₄, 1.8 µM FeSO ₄, 15 µM tiamin-HCl, 0.2 mM MgSO ₄ ve 22 mM glikoz. M63 üç hisse senedi çözümleri karıştırılarak yapılır: beş X çözüm, % 20 glikoz ve MgSO ₄ tiamin çözüm. Saat 4'te tüm çözümler depolamak ° C.

1. 1. 5 X çözüm FeSO ₄ çözüm, hazırlamak için hazırlanıyor bir elektrik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet GKD ₂ O 50 mL santrifüj tüpü eklemek için kullanın. Bir P-200 0,06 mL HCl 0.01 M HCl. ekleyin 36 mg FeSO ₄-7 H ₂ O elde edilir ve iyice karıştırın eklemek için kullanın.
   2. 160 mL GKD ₂ O ölçüm silindir ölçmek ve 500 mL kabı için ekleyin. Bu sırada aşağıdakileri ekleyin: 10,72 g K ₂ HPO ₄, 5,24 g KH ₂ PO ₄, 2.0 g (NH ₄) ₂ SO ₄ ve 0.5 mL (1.1.1. adımda hazırlanan) FeSO ₄ çözüm.
   3. Hassas pH metre, kullanarak, 7.0 pH 2 M KOH ekleyerek ayarlayın. GKD ₂ O toplam hacmi 200 mL için eklemek ve bir ölçüm silindir çözüm dökün. 250 mL filtrasyon ünitesi (PVDF, 0,22 µM) kullanarak çözüm sterilize.
2. % 20 glikoz çözüm hazırlama
   1. 200 mL GKD ₂ O ölçüm silindir ölçüp 500 mL kabı dök. Manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırma sırasında 50 gr şekeri ekleyin. Bir ölçüm silindir 250 mL toplam hacmiyle çözümde sulandırmak. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.
3. MgSO ₄ tiamin çözüm hazırlama
   1. 150 mL GKD ₂ O 500 mL kabı için ekleyin. Manyetik karıştırıcı ile karıştırma sırasında 1.0 g tiamin-HCL ve MgSO ₄-7 H ₂ O. Dilute çözüm 10 g toplam hacmi 200 mL için bir ölçüm silindir ekleyin. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.
4. En az orta M63 hazırlama
   1. 5 X çözüm, % 20 glikoz çözüm, MgSO ₄ tiamin çözüm, elektronik bir pipet, P-200 pipet ve 200-µL pipet ipuçları temiz bir bankta yerleştirin.
   2. Ölçmek 155.8 mL GKD ₂ O ölçüm bir silindir ve 500 mL kabı dökün.
   3. Elektronik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet, kullanarak Ekle beş X çözüm ve 4 mL % 20 glikoz çözüm 40 mL ölçülen GKD ₂ için O. Daha sonra 0.2 mL MgSO ₄ tiamin çözüm P-200 ile ekleyin. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.

2. Gliserol stok hazırlanması

1. hücre kültür
   Not: bakteri suşları (örneğin, W3110 ve onun azaltılmış genleri) yük banka kuruluşlardan mevcuttur. Suşlarının agar plakaları koloniler şeklinde genellikle elde edilir.
   1. Silikon kauçuk Stoper, elektronik bir pipet, P-1,000, 1.000-µL pipet ipuçları, P-200, 200-µL pipet ipuçları ve temiz bir Bank üzerinde hedef suşları (kolonileri plakaları) ile beş steril cam tüplerin yerleştirin.
   2. Cam tüp Bunsen Burner ağız silikon kauçuk tıpa açmadan önce ortaya çıkarmak. Tüp açıldıktan sonra silikon kauçuk tıpa aleve maruz ve hafifçe kap cam tüp geri yerleştirin.
   3. 5 mL M63 bir cam tüpler ve diğer dört tüpler için 4.5 mL M63 eklemek için elektronik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet kullanın.
   4. Bir koloni alıp 5 mL M63 içeren cam tüpte aşılamak için P-200 ipucu kullanın.
   5. Bir süspansiyon yapmak için girdap tüp. O zaman, çözüm 10 kat seyreltik tarafından Bu çözümün 0.5 mL 4.5 mL M63 içeren dört tüpler birine transfer.
   6. Kalan tüpler 2.1.5. adımda açıklanan işlemi yineleyin. Beş farklı konsantrasyonları ile seyreltme serisi (dilutions 1, 10, 100, 1000 ve 10.000) şimdi hazırdır.
   7. Cam tüp ve 2.1.2. adımda açıklandığı gibi silikon kauçuk stoper ağızlarını sterilize. Stoper tüplerini kap. Kontaminasyon silikon kauçuk stoper kırışıklıklar değil.
   8. Önceden ısıtılmış sallayarak kuluçka 37 ° C'de beş tüpler yerleştirin ve 200 devir / dakikada sallamak. Kültür gecede veya 10-30 h. için kuluçkaya
2. Seçimi gliserol hisse senedi için kültür
   1. Önceden ısıtılmış oda sıcaklığında M63 orta, P-1,000, 1.000-µL pipet ipuçları ve tek kullanımlık bir küvet temiz bir bankta yerleştirin.
   2. Ekle 1000 µL M63 tek kullanımlık bir küvet için bir P-1, 000 ile. Tek kullanımlık küvet bir Spektrofotometre yerleştirin, sabit bir dalga boyu 600 adlı programını başlatmak nm ve ölçü birimi boş.
   3. Beş cam tüpler temiz kürsüye sallayarak kuluçka taşımak.
   4. Atmak M63 tek kullanımlık küvet gelen ve aynı tek kullanımlık küvet bir P-1, 000 ile 1.000 µL kültür ekleyin. 2.2.2. adımda açıklandığı gibi hücre kültürü (OD ₆₀₀) optik bulanıklık ölçmek.
      Not: herhangi bir kontaminasyon ve hassas bir ölçüm elde etmek için cam boru ve açıklandığı gibi alev ve girdap kültür önce örnekleme stoppers maruz. Özellikle hücre yoğunluğu düşük olduğu zamanlarda güvenilir sonuçlar alabilmek için tekrarlanan ölçüler, tavsiye edilir.
   5. Beş hücre kültürleri, erken üstel büyüme aşamasında birini (OD ₆₀₀ = 0,01 - 0,05) gliserol hisse senedi için.
      Not: birden çok kültürü yoğunlukları optimum menzili içinde varsa, 0,05 en yakın yaygın olarak seçili.
3. Tekrarlanan testleri için gliserol hisse senedi olun.
   Not: Bu on hisse senetleri hazırlamak için tanımlanır. Daha büyük veya daha küçük miktarlarda deneysel gereksinimlerine göre yapılabilir.
   1. Steril % 60 gliserol çözüm getirin, on 1.5 mL mikrotüpler, P-1,000 sterilize ve P-200, 1000 ve 200 µL pipet ipuçları ve bir microtube stand temiz bir bankta.
   2. Ekleyin 250 µL sterilize % 60 gliserol çözüm ve 1.5 mL microtube ve mix için seçili hücre kültürünün 750 µL tarafından pipetting.
      Not: Stok birimi değişkendir, ancak her zaman % 60 gliserol hücre kültürü için 1:3 oranını korumak; Bu % 15 gliserol son bir konsantrasyon sonuçlanır.
   3. Kalan dokuz mikrotüpler microtube tribünde yer ve her tüpün 2.3.2. adımda hazırlanan karışımı 100 µL dağıtmak. Şimdi ileride kullanmak için on aynı gliserol hisse senedi vardır.
   4. Derin dondurucu-80, hisse senetleri depolamak ° C.

3. Büyüme eğrileri elde

1. yukarıya Mikroplaka okuyucu ayarlama.
   Not: (bkz: malzemeler tablo) plaka okuyucu kullanılan belirli phrasing burada kullanılan tırnak işaretleri gösterisinde gösterilen koşulları.
   1. Açık belgili tanımlık bilgisayar yazılımı. Açık " iletişim kuralları " içinde " Görev Yöneticisi " ve seçin " Yeni Oluştur ". Seçin " standart protokol ".
   2. Aç " yordam " ve ayarlarını yapın. Açık " sıcaklık ayarla " ve seçin " kuluçka makinesi üzerinde ". Ayarla " sıcaklık " 37 ° c ve " degrade " 0 ° C. onay " Onceden " sonraki adımla devam etmeden önce. Açık " başlatmak Kinetik ", set " çalışma zamanı " için 24:00:00 ya da 48:00:00, ve " aralığı " 00:30:00 ve 01:00:00 için.
      Not: Tüm 96 de plaka okumak için yaklaşık 1 dakika sürer.
   3. Aç " sallamak " ve " sallamak modu " olarak " lineer ". Kontrol " Constitution sallamak " ve " frekans " 567 BGBM. Açık " okuma ", kontrol " Absorbans ", " son nokta/Kinetik ", ve " Monochromators. " ayarla " dalga boyu " 600.
   4. Tıklama " doğrula " yordam doğru olduğunu onaylamak için. ' I tıklatın " kurtarmak " ileride kullanmak üzere yeni bir program olarak kaydetmeyi.
2. Gerçek zamanlı büyüme kayıt
   1. aşısını kültür örnekleri 96-şey plaka üzerinde konumlarını belirtmek için bir 96-şey plaka sembol (8 × 12 tablo) çizin. Tablo baskı ve deneme için bir başvuru olarak kullanın.
      Not: Mikroplaka kenarlarında bulunan kuyu yalnızca buharlaşma nedeniyle boş orta içermelidir.
   2. Yer sterilize edilmiş bir 96-şey düz alt Mikroplaka kapak, P-1000, 1000-µL pipet ipuçları, P-200, 200-µL pipet ipuçları, birkaç 1.5 mL mikrotüpler, bir 8-çok kanallı pipet, steril reaktif su deposu, oda sıcaklığında M63 ve gliserol ile temiz bir banka hisse senetleri (2.3 adımda hazırlanan).
   3. Yaklaşık 25 mL M63 reaktif havzanın ekleyin. Bu depo stok için aşağıdaki adımların tümünü kullanın.
   4. Ekleyin 900 µL M63 mikrotüpler seri dilutions yapmak için hazırlık için.
   5. Gliserol stok oda sıcaklığında erimek. 900 µL eklemek M63 çözdürülen gliserol hisse senedi ve girdap. Bu orijinal gliserol hisse senedi 10 kat bir seyreltme içinde sonuç.
   6. 900 µL M63 ve girdap içeren başka bir microtube için 10 kat seyreltme transfer 100 µL. Bu 100-fold bir seyreltme olur.
   7. Tekrarlama adım dilutions için istediğiniz sayıyı elde kadar 3.2.6.
   8. Doldurmak wells 200 µL M63 kullanarak Mikroplaka kenarında bir 8 kanallı pipet (P-200).
      Not: Bu kuyu boş kullanılabilir.
   9. Yük 200 µL her adımda 3.2.4 - 3.2.7 başvuru tablosu (Adım 3.2.1) göre Mikroplaka wells için hazırlanan örnek seyreltilmiş. Girdap seyreltilmiş numune önceden yükleme ve yük aynı örnek birden çok Wells için çeşitli konumları plaka üzerinde.
   10. 96-şey Mikroplaka plaka okuyucu üzerinde yerleştirin.
   11. Aç " okunur Şimdi " içinde " Görev Yöneticisi " ve program (Bölüm 3.1) seçin. ' I tıklatın " Tamam " ölçümünü başlatmak için. Veri analizi (Bölüm 4) için yeni bir deneysel dosya kaydı saklamak.

4. Veri analizi

1. verme bir USB bellek için gerçek zamanlı büyüme hızında veri (Bölüm 3.2) sonuçlarını bir metin dosyası olarak sopa.
   Not: Bir 96-iyi biçimlendirilmiş sonuçlar (eğriler) plaka okuyucu gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Saatlik kayıtları (OD değerleri) bir tablo olarak verilebilir; satır ve sütunları iyi numarası (örneğin, A1, B1) ve ölçüm saat (örneğin, 00:00:59) temsil sırasıyla.
2. Elektronik tablo yazılımı ile metin dosyası açın.
3. Saatlik OD ₆₀₀ okur 96-şey Mikroplaka sayısı daha fazla çözümleme için yeni bir çalışma sayfasına kopyalayın.
4. Arka plan okur, çıkarma zaman her örneğinin saatlik okuma sıfırdan de.
   Not: kolaylık sağlamak için boş ortalama değerini içeren M63 kuyuları (Adım 3.2.8)-ebilmek var olmak kullanılmış ile arka plan değeri.
5. Maksimal nüfus yoğunluğu tahmin etmek için beş ardışık OD ₆₀₀ okuma ortalamasını hesaplamak.
   Not: Maksimal OD ₆₀₀ karşılık gelen büyüme eğrisi beş ardışık OD ₆₀₀ okuma en büyük ortalama değeri tanımlanır.
6. Hesaplamak büyüme oranı, μ (s ^-1), tüm çift ardışık değerleri aşağıdaki denklemi OD ₆₀₀ uygulayarak:
   
   Not: Bu denklemde _ben C ve C _{ı + 1} herhangi iki ardışık zaman nokta (_Ben t ve t _{ı + 1}, OD ₆₀₀ değerleri temsil sırasıyla). Doğal logaritma LN gösterir.
7. Zamanla büyüme oranı değişiklikleri saatlik OD ₆₀₀ dayalı Calculate adım 4,6 göre okur. Ortalama ve standart sapma maksimum büyüme oranı tahmin etmek için beş ardışık büyüme oranları hesaplamak.
   Not: En büyük ortalama en küçük standart sapma ile ilgili büyüme eğrisi maksimal büyüme oranı tanımlanır.

5. 96-iyi okur (isteğe bağlı) genel önyargı teyit

Not: her iki plaka okuyucu ve tüketim 96-şey plaka önyargılı ölçümleri neden olabilir. Son derece hassas ve tekrarlanabilir sayısal sonuçlar elde etmek için genel önyargı 96-şey plaka teyit önerilir.

1. 96-şey plaka ve plaka okuyucu için önyargı testi 3.2.2 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın.
2. Ekle 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü M63. Gliserol stok aynı santrifüj tüpü ve girdap ekleyin. Askıya alınmış çözüm bir steril reaktif rezervuar transfer.
3. Askıya alınmış çözüm 200 µL 96-şey plakasına aktarmak için bir 8 kanallı pipet kullanın.
4. 96-şey plaka plaka okuyucu üzerinde yerleştirin ve ölçüm başlar.
5. Kayıt OD ₆₀₀ saatlik okur ve 4 bölümde açıklandığı gibi analiz. 96-iyi okur gerektirebileceği önyargı belirlemek için her şey hesaplanan maksimal büyüme oranı ve nüfus yoğunluğu karşılaştırın.

Sonuçlar

Açıklanan yöntemi dinamik Bakteriyel büyüme sürekli, yüksek üretilen iş bir şekilde çeşitli zaman aralıkları (dakikadan gün saat) birden fazla optik yoğunluk ölçümleri alır bir 96-şey biçimi okuyucu kullanarak yakalamak için bir yol sağlar. E. coli suşlarının çeşitli genleri ifade bir ürün yelpazesine büyüme eğrileri tam olarak tek bir deneyi (şekil 1A) elde edilebilir. Açıklanan yöntemi ile karşılaştırıldı...

Tartışmalar

Kritik adımlar protokolündeki hücreleri ve çeşitli pozisyonlarda Mikroplaka üzerinde birden fazla Wells aynı örnekleri çoğaltmasını katlanarak büyüyen bir hisse senedi hazırlanması içerir. Daha önce microbiologists bir gece öncesi Kültür Kültür başladı. Bu yöntem Bakteriyel büyüme gecikme süresini azaltmak iken, tekrarlanabilir büyüme eğrileri elde etmek zordur. Şekil 2' de gösterildiği gibi ortak gliserol hisse senetleri kullanarak bağımsız ölçüleri ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2HPO4	Wako	164-04295
KH2PO4	Wako	166-04255
(NH4)2SO4	Wako	019-03435
MgSO4-7H2O	Wako	138-00415
Thiamine-HCl	Wako	201-00852
glucose	Wako	049-31165
HCl	Wako	080-01066
Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O)	Wako	094-01082
KOH	Wako	168-21815
Glycerol	Wako	075-00611
Centrifuge tube (50 mL, sterilized)	WATSON	1342-050S
Pipette Tips, 200 µL	WATSON	110-705Y
Pipette Tips, 1,000 µL	WATSON	110-8040
Microtube (1.5 mL)	WATSON	131-715C
8 multichannel-pipette	WATSON	NT-8200
PASORINA STIRRER	AS ONE	2-4990-02
Glass cylinder (200 mL)	AS ONE	1-8562-07
Precision pH mater	AS ONE	AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200	GILSON	1-6855-05
Pipetman P-1000	GILSON	1-6855-06
Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)	SANPLATEC	SAN27014
Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)	SANPLATEC	SAN27015
Microtube stand	BM Bio	801-02Y
Vortex	BM Bio	BM-V1
Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)	Sigma-Aldrich	Corning, 3370
Corning Costar reagent reservoir (50 mL)	Sigma-Aldrich	Corning, 4870
Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM)	Merck Millipore	SCGVU02RE
Pipet-Aid XP	DRUMMOND	4-000-101
Bioshaker (BR-23UM MR)	TAITEC	0053778-000
Disposal cell (1.5 mL)	Kartell	1938 / 2-478-02
DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter	A23616
EPOCH2	BioTek	2014-EP2-002 / EPOCH2T
Beaker (500 mL)	IWAKI	82-0008
BIO clean bench	Panasonic	MCV-B131F
Glass tubes	NICHIDEN RIKA GLASS	P-10M~P-30 /101019
Silicone rubber stoppers	ShinEtsu Polymer	T-19
Bacterial strains	Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan