Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Özet

Macropinocytosis, büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımı, klinik biyoloji İmmünoloji, enfeksiyon, kanser ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok alanda önemlidir. Burada, mevcut teknikleri macropinocytosis model organizma Dictyostelium discoideum kullanarak macropinocytosis ölçümü akış sitometresi yüksek üretilen iş, tek hücreli çözümleme'ye izin için adapte edilmiştir.

Özet

Büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımını macropinocytosis tarafından bazı kanser hücreleri, antijen örnekleme, konak hücre işgali ve nörodejeneratif hastalıkların yayılması yayılması için önemlidir. Amip Dictyostelium discoideum yaygın olarak kullanılan laboratuar suşları hangi yüzde 90'ını macropinocytosis nedeniyle bitti besin ortamda büyüdü son derece yüksek sıvı alımını oranlarına sahip. Buna ek olarak, birçok memeli macropinocytosis bilinen çekirdek bileşenlerinin da macropinocytosis çalışmak için bir mükemmel model sistem yapım mevcuttur. Burada, içselleştirilmiş sıvı floresan dextran etiket olarak kullanarak ölçmek için standart teknik yüksek üretilen iş örnekleme (HTS) eki kullanarak akış sitometresi tarafından analiz örnekleri ile bir 96-şey plaka biçimine adapte olduğunu.

Hücreler için önceden belirlenmiş bir süre boyunca buz gibi soğuk arabellek daldırma tarafından yıkanmış ve ayrıca ekzositozu durur 5 mM sodyum azid kullanarak müstakil quenchable floresan dextran beslenir. Her şey hücrelerde sonra akış sitometresi tarafından incelenir. Yöntem aynı zamanda membran alımı ve fagositoz floresan boncuk veya bakteri ölçmek için adapte edilebilir.

Bu yöntem yüksek üretilen iş, emek ve kaynak verimli şekilde Dictyostelium tarafından sıvı alımını ölçümü izin vermek için tasarlanmıştır. Birden fazla suşları (Örneğin bir genin nakavt mutantlar) ve koşullar aynı anda karşılaştırma sağlar(hücreleri farklı medya veya inhibitörü farklı konsantrasyonları ile tedavi) paralel ve zaman-Dershaneler kolaylaştırır.

Giriş

Büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımını macropinocytosis tarafından birkaç biyolojik bağlamlarda¹' de, önemli olan antijen örnek bağışıklık yanında da dahil olmak üzere hücreleri², patojen giriş ana hücreleri içine³, kanser hücre proliferasyonu⁴ ve prion hastalıkları⁵/ yayılıyor. Memeli ve Dictyostelium hücreleri, aktin^6,7, PI (3,4,5) P3^8,9,10 (lipid kesin yapısını iki¹¹arasında farklı olsa da), aktif Her ne kadar orada kalır macropinocytic yama nasıl hakkında cevaplanmamış birçok soru Ras^12,13ve aktif Rac^14,15 macropinocytosis tarafından verimli sıvı alımı için önemlidir. , organize ve sonunda içselleştirilmiş kurdu. Macropinocytosis daha kapsamlı bir anlayış vermek daha fazla protein macropinocytosis ve çeşitli biyolojik bağlamlarda nasıl önemliler sonraki belirlenmesi için önemli keşfetmek ve gelişmesine olanak sağlayabilecek koşullar bir dizi için hedeflenmiş tedaviler.

Dictyostelium macropinocytosis okuyan bir ideal modeli sistemidir. Standart laboratuar suşları bünye macropinocytosis yüksek düzeyde o sıvı alımı üzerinde macropinocytosis⁶nedeniyle % 90'ı demektir. Bu sadece memeli hücreleri macropinocytosis nedeniyle sıvı alımı oranı çok daha düşük nerede farklı olarak sıvı alımını belirlenerek ölçülecek macropinocytosis sağlar. Macropinocytosis çok iyi tanımlanmış ve bu sistemde kolayca görüntülenmeyecektir¹² benzer şekilde sunan soruşturma için farklı avantajlar çekirdek macropinosome korunmuş bileşenlerinin diğer sistemleri üzerinde olabilir yerde birden çok düzenleyici sinyaller ^{16 , 17}.

Macropinocytosis ölçmek için memeli hücreleri tarafından kullanılan standart teknik dextran pozitif veziküller¹⁸tarafından işgal bir hücre alanı belirlemek için mikroskobu ardından kısa bir süre için dextran ile darbe sonra hücreleri tamir içerir. Bu teknik ancak Dictyostelium¹⁹' bildirdi ve sadece tek uçak hücrenin içselleştirilmiş birim anlamı dikkate alır hücre, girdikten sonra daralma macropinosomes olasılığı için hesaba katmaz belli değil. Belirli bir süre içinde içselleştirilmiş macropinosomes sayılması alternatif bir tekniği, aynı downsides²⁰vardır. Dictyostelium kullanarak bu sorunları önler; Ancak, Dictyostelium tarafından sıvı alımını ölçmek için varolan teknikleri nispeten hücreleri ve dextran²¹emek yoğun, büyük bir kullanarak miktarı vardır. Hücreleri yüksek yoğunluklu floresan dextran ve çeşitli noktalarda zaman-bir fluorimeter kullanarak içselleştirilmiş floresans tespiti için kaldırıldı örnekleri sarsıldı. Her ne kadar bu düşük işlem hacmi kalır bu şekilde hazırlanan hücreleri tek hücre, tercihan--dan nüfus düzeyi, çözünürlük²², kazanmak için akış sitometresi tarafından çözümlenebilir.

Burada, içselleştirilmiş sıvı floresan dextran etiket olarak kullanarak ölçmek için standart teknik yüksek üretilen iş örnekleme (HTS) eki kullanarak akış sitometresi tarafından analiz örnekleri ile bir 96-şey plaka biçimine adapte olduğunu. Hücreler için önceden belirlenmiş bir süre boyunca buz gibi soğuk arabellek daldırma tarafından yıkanmış ve ayrıca ekzositozu durur 5 mM sodyum azid kullanarak müstakil quenchable floresan dextran beslenir. Her şey hücrelerde sonra akış sitometresi tarafından incelenir. Bu yöntem yukarıdaki yöntemleri sınırlamalarının üstesinden gelir ve daha az kaynak kullanarak ve işçilik dahil azaltarak eşzamanlı suşları/koşullar çok sayıda sıvı alımını karşılaştırılması izin vermek için tasarlanmıştır.

Protokol

1. hücre ve malzemelerin hazırlanması

1. Hücreleri ya SM ağar kaplamalar Klebsiella aerogenesgibi bakteriler ile birlikte veya HL5 gibi besin Orta tarihinde açıklanan²³yetiştirmek.
   Not: kusurlu macropinocytosis bakteri içinde nakavt mutantlar büyüyen macropinocytosis oranını artırabilir ikincil mutasyonların birikimi önlemek yardımcı olur. En iyi sonuçlar için hisse senedi hücrelerden kaplama sonra geçiş sayısını 4 aşağıda tutun. Mutantlar donmuş hisse senetleri en kısa zamanda yalıtım sonra muhafaza edilmelidir.
2. SM ağar kaplamalar hücrelerdeyse yetiştirmek için K. aerogenes izdiham SM ortamda büyümeye. 200 – 300 μL bakteri bir SM agar plaka üzerine ekleyin ve yayıldı. Bir kısır döngü hücre (başka bir bakteriyel tabaktan aktarırken) almak ve plaka bir kenarında yayıldı. Bir haftaya kadar 22 ° c için kuluçkaya.
3. Tetra-metil-rodamine isothiocyanate (TRITC-) dextran 50 mg/ml suda çözülür, 1 mL aliquots 0,22 mikron filtre kullanarak filtre uygulama ve -20 ° C'de depolayın Aliquots süresiz olarak saklanır.
   Not: 155 kDa bu yöntemle, rezervasyon yaptırın toplu olarak satın alınabilir, ama daha küçük dextrans macropinocytosis Dictyostelium²⁴yılında sadece etkili tedbir olarak kullanılan tipik boyutudur. Farklı fluorophores gerekiyorsa art arda sıralı mavi veya Alexa-647, gibi farklı quenchable sigara dextrans alternatifleri vardır.

2. dönüştürmek içine nicel nitel ölçümleri (isteğe bağlı)

1. Bir sıvı alımını tahlil süspansiyon hücrelerde kullanarak gerçekleştirin.
   1. Axenically büyüyen hücreler 300 x g 3 dk de cips, süpernatant atmak ve besin orta 1 x 10⁷ hücre/mL olarak resuspend. TRITC-dextran 0,5 mg/mL için eklemek ve 180 rpm, 22 ° c sallamak
   2. Örnekleri 0.7 mL buz gibi KK₂ , 0, 30, 60, 90, 120 dk. yıkama içine bir kez buz gibi KK₂ arabellek²³ ' te benchtop santrifüj 1,5 ml, 1 ml içinde aynı tampon resuspend ve buz üzerinde depolamak 0.8 mL seyreltik.
      Not: hemen veya tüm örneklerini topladıktan sonra yıkama eşdeğer sonuçlar verir.
2. Cilt hücreleri tarafından içselleştirilmiş sıvı belirleyin.
   1. Floresan bir uyarma dalga boyu 544 nm ve emisyon dalga boyu 574 kullanarak ölçmek için fluorimeter ayarla nm 10 nm kesilmiş. TRITC-dextran seyreltme serisi ayarladıysanız ve floresan için verilen ölçmek için kullanabilirsiniz dextran hacimleri. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
   2. Bölüm 2.1 hücre süspansiyon 0.9 mL kullanarak hücreleri tarafından içselleştirilmiş floresans ölçmek. Kalibrasyon eğrisi²⁴kullanarak hücre başına içselleştirilmiş sıvı hacmi hesaplamak.
3. Her zaman noktasına ayrı olarak 0.5 mL buz soğuk KK₂hücrelerden kalan sulandırmak. 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 5 mL polistren akış sitometresi tüpler içine filtre. Her zaman noktası hücrelerden birbirinden farklı ve onların floresans kayıt akış sitometresi ayarlayın (3.4 ve 3.5 bölümlerine bakın).
4. Yukarıdaki ayarları kullanarak akış sitometresi kalibrasyon boncuklar floresans ölçmek ve kaydedebilirsiniz.
   Not: Bu akış sitometresi üzerinde tüm gelecekteki floresans ölçümler için referanstır: tekrar kullanmadan önce boncuk çalıştırın ve öylesine onlar-si olmak aynı floresans ayarlarını yapın. Bu çok dar tanımlı en yüksek verecektir. Bir kapı floresans tepe etrafında koyarak bu kolaylık sağlar.
5. Üç kez tekrarlayın ve bölümlerde 2.2 ve 2.3 birbirlerine karşı elde edilen hücre floresans verileri çizmek. En uygun bir çizgi çizmek ve denklemi nitel veri akış sitometresi nicel birimlerine dönüştürmek için kullanın.

3. ölçme sıvı alımı

Şekil 1: macropinocytosis yüksek üretilen iş ölçüm şematik. (A) Grow Dictyostelium bir SM plaka numaralı seribaşı ile K. aerogenes bakteri (sarı). Zaten Gelişmiş hücre kaçınarak hücrelerden besleme açık (turuncu), (yeşil), KK₂ arabellek 25 mL hasat. Ayırmak için girdap tarafından 3 dk aralıklarla 300 x gde cips, sonra 3 kez 50 mL KK₂ arabelleği, her zaman süpernatant atarak yıkayın. 1 x 10⁵ hücre/ml HL5 büyüme orta resuspend ve 50 µL örnek bir düz dipli 96-şey plaka başına üç kuyu içine ekleyin. 22 ° c 24 h için (B) seyreltik TRITC-dextran 1 mg/ml HL5 büyüme orta olarak 50 mg/mL stok bir çözümden kuluçkaya. 50 µL (0 dak alımını kontrol wells hariç) her örnek ekleyin ve sonra hangi dextran 0 min alımı denetimine ekleyin 22 ° c için 1 h, kuluçkaya. (C) hemen medya dikkatle boşaltmak, plaka üzerinde aşırı orta kaldırmak ve banyo yıkamak için kuyu doldurma buz gibi KK₂ arabellek daldırın bir doku pat. Arabellek dikkatle boşaltmak ve yine kuru pat. 5 mM sodyum azid KK₂' hücreleri ayırmak için MC çözünmüş 100 µL ekleyin. Akış Sitometresi içselleştirilmiş floresans ölçümü için almak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

1. Bir düz oturaklı 96-iyi doku kültürü tabak (Şekil 1A) ayarlayın. Hücreleri bakteri ve onları daha önce tahlil; 24 h HL5 Orta (içeren 100 µg/mL dihydrostreptomycin, 100 µg/mL ampisilin ve 50 µg/mL sefaloridin) aktarmak için kullanma Bu upregulated bakteri²⁴tarihinde yetişkin hücrelerinde görülen düşük düzeylerde olmak macropinocytosis sağlar. Alternatif olarak, doğrudan axenic kültür hatalar farklı yoğunlukları seyreltilmiş hücreleri nedeniyle azaltmak için tahlil önce 24 h için kuluçka, hücrelerden oranında seyreltin.
   1. Hasat hücrelerden besleme ön KK₂ 50 mL santrifüj tüpü 25 mL içine. Hücreleri vortexing ve 300 x g 3 dk.. için de pelet tarafından ayırmak Süpernatant atmak, Pelet resuspend ve 300 x g KK₂her zaman bakteri kaldırın süpernatant atarak, 3 dk 50 ml için de 3 kere yıkayın.
   2. (Bir hemacytometer veya diğer hücre sayım sistemi kullanarak) hücre yoğunluğu belirlemek ve içine HL5 içeren antibiyotikler 1 x 10⁵ hücre/ml seyreltik. 50 μL her kuyuya pipet üç kuyu her koşul için kullanma. 22 ° c 24 h 0 min alımı denetimi ayarlamak için anımsa için kuluçkaya.
      Not: Bir alternatif orta, Örneğin SIH, VL6-ebilmek var olmak kullanılmış onun yerine.
2. Hücreler ile TRITC-dextran (Şekil 1B) yükleyin.
   1. 1 mg/ml kullanılan orta dextran seyreltik (Bu 2.5-5 mg/mL için çok düşük alımı hücrelerle değerlendirirken artırılabilir). 50 μL (0,5 mg/mL TRITC-dextran son bir konsantrasyon vererek) her şey eklemek ve plaka 22 ° C için 1 h, bu önemli dextran birikimi sağlar ancak dextran ekzositozu henüz başlamamış gibi geri dönün.
      Not: hata azaltarak daha hızlı yapılması için bu adımı tekrarlayıcı pipet sağlar.
3. Hücreleri akış sitometresi (Şekil 1 c) için hazır olun.
   1. Hemen yıkama önce 0 min alımı denetimlere 50 μL dextran içeren medya ekleyin.
   2. Orta dikkatle boşaltmak ve bir doku üzerinde kuru pat. Buz gibi KK₂plaka batış tarafından yıkayın, sonra dikkatle boşaltmak.
      Not: bazı suşları bağlılık kusurları ile bu adım sırasında Örneğin her iki Talin homologs nakavt müstakil hale (talA-/ talB -)²⁵. Kötü iliştirin ve gerekirse medya Aspire hücre hatları ile çalışırken dikkatli olun.
   3. Buz gibi 5 mM sodyum azid KK₂' MC (KK₂ + 2 mM MgSO₄ ve 100 mikron CaCl₂) çözünmüş 100 μL ekleyin.
      Dikkat: Sodyum azid son derece zehirlidir. Toz maskesi ve koruyucu gözlük tozu ile çalışırken kullanın. Her zaman eldiven ve önlük giymek. Isı önlemek ve asit ile birlikte kullanmayın.
      Not: Hücreleri hızla ayırmak ve ekzositozu EngellediBRÜKSEL²⁴' tür. Mikroskop bunu denetlemek için kullanılabilir.
4. Akış Sitometresi tarafından ölçü sıvı alımı
   1. Eğer mutlak olanlar için göreli değerleri dönüştürmek planlama, boncuk (bkz: 2) akış sitometresi ayarları standart hale getirmek için kullanın. Alternatif olarak, kullanım hücreler olarak bölümde ileri dağılım ve yan dağılım uygun şekilde hücreleri (Şekil 2A), makine bloke değildir, sağlanması yalıtmak için ayarlandığından emin olmak için 2 dextran (Şekil 2B) yüklü ve parametrelerini ayarlamak içselleştirilmiş Floresan (Şekil 2C) ölçmek.
   2. Sistem yüksek üretilen iş örnekleme ekleyin ve plaka ekleyin. (TRITC-dextran kullanmak için sarı-yeşil lazer heyecanlandırmak ve 582 nm kanal veya benzer ölçmek için) Floresan ölçmek için bir protokol hazırlamam ayarla, 65 μL hücre süspansiyon ve Çalıştır.
5. Akış Sitometresi sonuçlarını analiz
   1. İleri dağılım ve yan dağılım (Şekil 2A) kullanarak hücreleri kapıda. Ortalama floresans İstatistikler seçeneğini kullanarak hücre hesaplama. Bir örnek kullanarak bu parametreleri ayarlayın ve tüm örnekleri için geçerlidir.
      Not: İleri dağılım/yana dağılım profilleri farklı mutantlar veya inhibitörleri kullanıldığında örnekleri arasında değişebilir.
   2. Her koşul için üç kuyular ortalamasını belirlemek ve 0 dk alımını kontrol çıkarın. Ya 2 bölümünde belirlenen denklemi kullanarak sayısal değerleri dönüştürmek veya denetime normalleştirmek.

4. performans gösteren sıvı alımı zaman-Dershaneler

1. Hücreleri olarak bölümde 3, üç kuyular için her zaman nokta ve zorlanma/koşulu ile ayarlayın.
2. Dextran etiketli orta farklı wells için sırayla ekleyin. Tipik bir zaman ders sıvı alımını ölçer 0, 30, 60, 90 120 ve 180 dk. 60 dk sonra kuyular için 120 dk süresi noktası ekleyerek takip 180 dk zaman noktası kuyuları için orta dextran içeren eklemek vb (Şekil 3A).
3. 0 dk az 50 μL dextran içeren eklemek orta ve hemen dikkatle boşaltmak ve plaka 3.3 bölümde olduğu gibi yıkayın. 3.5 bölümünde açıklandığı gibi analiz.

5. doz yanıt eğrileri

1. Hücreleri bölümünde 3, üç kuyular için her zorlanma ve koşulu ile açıklandığı gibi ayarlayın.
2. Bileşik faiz bileşik Çift istediğiniz maksimum son konsantrasyon , 1 mg/mL dextran içeren orta içine oranında seyreltin. Araç aynı oranda ilk olarak ile dextran ile orta içeren ikinci bir tüp hazırlayın. Girdap karıştırmak için.
3. Örnek (Şekil 4A) başına orta içeren 200 μL dextran ilgi bileşik seyreltme serisi oluşturmak. Girdap karıştırmak için. Her örnek 1 h için iyi orta 50 μL ekleyin.
4. Yıkama ve bölümde 3.3 itibaren açıklandığı gibi analiz.

6. fagositoz ve membran alımı

1. Membran alımını ölçmek için madde 3 te açıklandığı gibi hücreleri hazırlayın. 20 mikron FM 1-43 için 10 mikron son bir konsantrasyon içeren orta 50 μL ekleyin. Yükleme sonra yıkayın ve akış sitometresi olarak bölümde 3.3 hücreleri hazırlamak. 585 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için mavi lazer kullanarak ölçmek.
   Not: membran kaçakçılığı sıvı fazlı daha hızlı olduğundan, 10 min 1 h²⁶' dan kullanmak için bir daha uygun zaman noktasıdır. Yalnızca membran dahil zaman bulabilsem alternatif boya yerine kullanılabilir.
2. Fluorescently etiketli boncuk veya bakteri fagositoz ölçmek için kullanın. Gibi onlar ayrılmaz Dictyostelium tarafından ileri gelen ve yan dağılım²⁴floresan Maya kullanılamaz. Hücreleri 3 bölümde açıklandığı gibi ayarlayın ve açıklanan²⁷analiz.
   1. Fagositoz boncuk ekleyin sarı-yeşil etiketli bölümde 5 x 10⁷ boncuk/mL (1,75 ve 2 mikron) veya 1 x 10⁸ boncuk/mL (1 ile 1,5 mikron) 3.2 son bir konsantrasyon için 1 h için yıkama ve akış sitometresi anlamında hazırlama önce açıklandığı gibi boncuk ölçmek için Bölüm 3.3. 525 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için mavi lazer kullanarak ölçmek.
      Not: Daha yüksek konsantrasyonlarda hücre dekolmanı götürecek.
   2. Fagositoz bakterilerin ölçmek için Texas-kırmızı etiketli Escherichia coli bioparticles Bölüm 3.2-1 x 10⁸ bakteri/mL 1 h için yıkama ve akış sitometresi olarak bölümde 3.3 hazırlama önce açıklandığı gibi ekleyin. 610 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için sarı-yeşil lazer kullanarak ölçmek.

Sonuçlar

Bir kez gerçekleştirilen teknik ve hücreleri dextran ile dolu ve analiz (Şekil 1) için akış sitometresi engellenmiş değil emin olmak ve Şekil 2Agösterildiği hücreler gibi bakmak için ileri dağılım/yana dağılım profili ayarlayın. Makine engellenmişse, daha böyle gösterildiği 2B şekil -ecek bakmak ve devam etmeden önce engellenmemiş olması gerekir. Parametrelerini göster denetim axenic hücreleri var uzun zaman noktalarda yüksek içselleştirilmiş dextran floresans ve daha kısa olanları, düşük içselleştirilmiş floresans sağlamak (Şekil 2C).

Mutantlar arasında farklılıklar ararken, bir üç fenotipleri olacağını muhtemeldir. Mutantlar normal sıvı alımı olabilir, kısmi bir kusur olabilir veya sıvı alımını tamamen kaldırılmış olabilir. Şekil 2B bir gerilme ile normal sıvı alımı, gösterir bu durumda Standart laboratuvar gerginliği Ax2, bir mutant bir ~ %50 ile azaltmak sıvı alımı (Ax2 rasG-¹⁴) ve bir ile sıvı alımı (Ax3 gefB-²⁸) kaldırılmış. Ortalama medyan sıvı alımı (Bölüm 3.5) elde etmek ve ( Şekil 3Bolduğu gibi) içselleştirilmiş sıvı hacmi hesaplamak veya bir denetime verileri karşılaştırmak için kullanabilirsiniz ( Şekil 4B olduğu gibi ve 4 C).

Şekil 3A, olduğu gibi bir sıvı alımını zamanlı kurs gerçekleştirirken içselleştirilmiş floresans 60-90 dk için sonra exocytosed dextran başlar, artması gerektiğini ve bir plato (Şekil 3B) ulaşılır. 60 dk macropinocytosis farklı mutantlar/koşullarda bu nedenle ulaşılması için iyi bir sinyal verir ve sinyal yok ekzositozu nedeniyle kayıp olduğunda standart saati noktası olarak kullanarak. Mutantlar nerede ekzositozu ciddi engel bir plato²⁹ulaşmak için daha uzun sürebilir.

Ne zaman tedavi Dictyostelium ( 4A rakamolarak ayarlanır), macropinocytosis karşı etkilidir inhibitörleri ile 1s içinde içselleştirilmiş dextran hücreleri aşağı hemen hemen hiçbir şey, çoğu durumda daha yüksek inhibitörü konsantrasyonlarda gidecek (Şekil 4B). Bazı inhibitörleri % 100 etkili olmayabilir, ancak, Örneğin nocodazole sadece akut eklendiğinde macropinocytosis tarafından sıvı alımını % 50'engeller (Şekil 4 c). İnhibitörleri etkili değilse, hücreler dextran denetim olarak benzer bir miktar içselleştirmesi ve floresan bir düşüş değil görülecektir. Bu teknik çok sayıda farklı inhibitörleri ve sıvı alımını üzerindeki etkileri için macropinocytosis tarafından çok hızlı bir şekilde taranması için inhibitör konsantrasyonlarının inhibitörü tedavisi en iyi duruma getirme harcanan zamanı azaltır sağlar.

Şekil 2: Akış Sitometresi ve temsilcisi veri kümesi kadar. (A) hücreleri kolayca ayırt edilebilir böylece ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) profilleri hücre ayarlanmalıdır. Ax2 hücreleri görünmelidir nasıl bir örnek gösterilir. (B) akış sitometresi engellenmişse, bu örnekte olduğu gibi çok düşük dağılım hücreleri var. Lazer fluorophores düzgün heyecanlandırmak değil ve devam etmeden önce makine unblocked olmalıdır. Herhangi bir veri iken makine engellendi elde atılmalıdır. (C) böylece 0 min alımı örnek hücreleri için inkübe bağlandığınızda artırır düşük floresan, floresans Williams & Kay 2018²⁴alınan bu örnekte gösterildiği gibi floresan ortamda uzun ayarlanması gerekir. (D) örnekler ile normal macropinocytosis (Ax2, yeşil), 1 h için TRITC dextran ile inkübe hücre macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM1726¹⁴, turuncu) azaltılmış ve macropinocytosis (Ax3 gefB -kaldırıldı HM1776²⁸, mavi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: 96-şey levha sıvı alımı zaman-Dershaneler gerçekleştirme. (A) Dextran var olmak mülhak her el örnekleri için sırayla, aynı bitiş saati ile. Sonra yıkayın kuyuları, ayırmak ve akış sitometresi tarafından içselleştirilmiş floresans ölçmek. Örnek kez dextran eklemek için burada gösterilir. (B) sıvı alımı zaman-ders Ax2 hücre 96-şey levha gerçekleştirilen. Williams & Kay 2018²⁴alınan, hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: sıvı alımı doz yanıt eğrileri. (A) ilgi 1 mg/mL TRITC-dextran, Çift Kişilik istenen son maksimum konsantrasyon içeren bu durumda PI3K inhibitörü LY294002, HL5 için bileşik ekleyin. HL5 büyüme orta + 1 mg/mL dextran araç yalnız koşul başına 200 µL orta seyreltme dizi oluşturmak için çeşitli oranlarda içeren ile karıştırın. Kuyu 1 h için normal olarak yıkama ve içselleştirilmiş floresans ölçme önce ekleyin. (B) sıvı alımı doz yanıt eğrisi Ax2 hücreler için aLY294002 içeren orta ile inkübe. Williams & Kay 2018²⁴uyarlanmıştır. Sıvı alımını tedavi edilmemiş bir denetim için normalleştirilmiş. Hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. (C) sıvı alımı doz yanıt eğrisi Ax2 hücreler için nocodazole ile inkübe. Williams & Kay 2018²⁴uyarlanmıştır. Sıvı alımını tedavi edilmemiş bir denetim için normalleştirilmiş. Hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Sıvı alımını değerlendirmek için diğer yöntemleri iş hızı düşük ise, hücre içinde in situ ve hücreleri ayırmak için sodyum azid kullanımı yıkama macropinocytosis, membran alımı, yüksek üretilen iş ölçümü sağlayan kritik bu yöntemde adımlardır veya fagositoz tarafından Dictyostelium. Hücreleri bir yüzeye bağlı olan ve orta değil gibi onlar Orta çevrelerindeki ilk kapalı atılmış ise sol bağlı ve arabellek daldırma tarafından değiştirildi ve yine kapalı atılmış. Hangi hücresel ATP tüketir ve membran³⁰depolarizes, sodyum azid sonra hücreleri ayırmak için kullanılan ve aynı zamanda hücre canlılığı²⁴etkilemeden ekzositozu önler.

Macropinocytosis Dictyostelium tarafından ölçmek için akış sitometresi kullanarak sıvı alımı çok hassas bir ölçüm çok hızlı bir şekilde belirli zorlanma veya koşul sıvı alımı, neden değiştirdi neden kurmak için verir iken soruşturma kullanarak daha fazla Mikroskopi gerekli²⁴' tür. Bu aynı zamanda daha önce yayımlanmış sonuçlar bazı durumlarda, sıvı alımını bir fark göstermiştir mutant suşları ya (Bu durumda), olduğu gibi bir yüzey üzerinde yetiştirilen tarafından unutulmamalıdır veya süspansiyon (olduğu gibi standart iletişim kuralı)³¹sallayarak. Bu yöntemi kullanarak nadir de olsa bazen belirgin sıvı alımını kusurları cevapsız, anlamına gelebilir. Ayrıca, ne zaman fagositoz ölçme, sadece düşük konsantrasyonlarda parçacıkların kullanılabilir. Fagositoz suşları ve koşullar²⁴arasında ilgili farklılıklar ölçmek mümkün olmasına rağmen en fazla bu tekniği ile tespit edilebilecek fagositoz kadar gerçek maksimum oranıdır. Fagositoz en yüksek hızı belirlemek için alımını süspansiyon sallayarak bir alternatif iletişim kuralı²⁷tarafından ölçülen gerekir. Bunun için buna göre akış sitometresi ayarlarken düzeltilmesi gerektiğini bu yüzden boncuk fagosite hücreleri yan dağılım, artmıştır.

Akış Sitometresi memeli hücreleri³²içinde sıvı alımını ölçmek için kullanılabilir, ancak sıvı yüksek oranda aşama alımı endositik diğer yolları tarafından Dictyostelium görülen bir sorundur. Ayrıca, hücreleri genellikle daha fazla içselleştirilmiş dextran endositik ilerlemesini sağlayan 37 ° C'de tripsin kullanarak ayrılır. Buz gibi sodyum azid makrofajlar bu teknik daha fazla optimizasyon olmaksızın memeli hücreleri için geçerli değildir yapma (Williams, yayınlanmamış gözlem) bir yüzey, ayırmak neden olmaz.

Yüksek işlem hacmi ölçümü macropinocytosis inhibitörleri, genetik mutasyon veya gen nakavt etkileri Dictyostelium hücrelerde için hızlı ve ucuz ekran için kullanılan potansiyeline sahiptir. Mutantlar her zaman onların doğrudan üst'e sadece karşılaştırılmalıdır. Okuyucu Dictyostelium zorlanma için önceden hiçbir tercih varsa, axenic sigara suşları DdB veya NC4 gibi daha "vahşi axenic olanlardan daha tipi" ve axenic suşları³³olarak etkili bir şekilde manipüle edilebilir. Aksi takdirde, Ax2 suşları axenic olan suşları ile iken Ax4 birçok suşu Talin A altını gizleme ve olması gereken en az sayıda genom mükerrer³⁴, kaçınılması mümkünse²³. Daha önce yayımlanmış suşlarının en Dicty stok Merkezi³⁵sipariş edilebilir.

Bu teknik daha önce farklı koşullar, inhibitörleri ve mutasyonlar macropinocytosis Dictyosteliumtarafından üzerinde etkileri içine mümkün olandan daha fazla araştırma olanakları sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR_II flow cytometer	BD Biosciences	-	Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD
TRITC-dextran (155 kDa)	Sigma-Aldrich	T1287	Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine
HL5 medium	Formedium	HLGCFG
96-well tissue culture plate	Corning	3596	Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work
Dihydrostreptomycin sulfate	Sigma-Aldrich	PHR1517
Ampicillin sodium	Formdium	AMP50
Kanamycin monosulfate	Sigma-Aldrich	60615
Sodium azide	VWR	103694M
Magnesium sulfate hydrate	VWR	25169.295
Calcium chloride dihydrate	VWR	1.02382.0250
Potassium dihydrogen phopshate	VWR	1.04877.1000
Di-potassium hydrogen phosphate	VWR	1.05104.1000
Fluorimeter	Perkin-Elmer	LS 50 B
FM1-43	Thermofisher	T35356
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm	Polysciences	15702-10
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm	Polysciences	09719-10
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm	Polysciences	17687-5
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm	Polysciences	09847-5
Texas Red E. coli bioparticles	Thermofisher	E2863
Flow-set fluorospheres	Beckman Coulter	6607007	Calibration Beads
SM agar	Formedium	SMACFG
0.22 µm syringe filter	Elkay Laboratory Products	E25-PS22-50S
10 mL Syringe	Becton Dickinson	302188
Round-bottom polystyrene tubes	Corning	352058	Use a tube that will fit onto your flow cytometer.
70 µm cell strainer	Falcon	352350
50 mL centrifuge tube	Sarstedt	62.547.004
Repeating pipette	Eppendorf	M4-SK
5 mL repeating pipette tips	Eppendorf	30089650
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML
LY294002	Cayman Chemical Company	70920
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404-2MG